方法文章

利用数字滴液PCR（ddPCR）测定土壤中的微生物生物量

DOI：

10.3791/69467

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2026年4月24日

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1Geography, Faculty of Environment, Science and Economy, University of Exeter

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究提出了一种快速的微滴数字PCR（ddPCR）方法，用于定量土壤微生物生物量及真菌与细菌的比例。尽管由ddPCR测得的微生物生物量碳与氯仿熏蒸法估算值之间的相关性较弱，但该方法提供了一种灵敏且可扩展的分子手段，无需额外采集土壤样品或使用强化学试剂，即可评估微生物丰度。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

土壤是陆地最大的有机碳库，但在过去两个世纪中已有超过1330亿吨碳从土壤中流失。准确量化土壤微生物生物量（尤其是作为驱动碳和养分循环主要分解者的真菌和细菌）对于理解土壤生态功能与健康至关重要。传统方法（包括氯仿熏蒸提取法和磷脂脂肪酸分析法）受限于较高的样品需求量，以及将生化标记物转化为微生物生物量估算值时存在的不确定性。本文介绍了一种利用数字微滴PCR（ddPCR）靶向16S和18S rRNA基因来定量土壤中细菌和真菌丰度的优化工作流程。该方法可实现微生物基因拷贝数的绝对定量，结合基因拷贝数校正因子换算为细胞数量，并进一步估算微生物生物量碳。我们将该方案应用于五种全球分布、土壤质地、土地利用方式和有机质含量各异的农业系统土壤样本。将ddPCR获得的估算结果与传统的氯仿熏蒸法对微生物生物量碳的估算值进行了比较。ddPCR能够高分辨率地定量微生物丰度，并在不同土壤类型中比全基因组测序提供更广泛且更敏感的真菌：细菌（F:B）比率估算。尽管ddPCR估算的微生物生物量碳（MBC）与氯仿熏蒸法数值仅呈现弱相关性，但该方法仍为评估微生物生物量及F:B比率等生态指标提供了一种有效的分子手段。本方案为整合微生物丰度测定与群落组成分析提供了一种可重复且可扩展的策略，有助于推进土壤健康评估。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

土壤是陆地上最大的有机碳库，其碳储量超过植被和大气中碳储量的总和1。在过去200年中，土壤已损失了超过1330亿吨（Gt）的碳，因此当前恢复和维持土壤碳储量的努力对全球土壤健康至关重要2。鉴于土壤巨大的碳储存能力，准确确定这些碳储量的主要贡献者具有根本性的重要意义3。微生物在土壤养分循环中发挥着基础性作用，而微生物生物量是土壤有机碳（SOC）的重要组成部分3。真菌和细菌是土壤环境中的主要分解者，在这些生态系统的生物地球化学循环中起着关键作用4,5。在以细菌为主的土壤中，有机质的分解和养分矿化速率远高于以真菌为主的土壤5。真菌与细菌（F:B）比值正越来越多地被用作衡量土壤健康状况的指标6,7；因此，对真菌和细菌进行准确评估至关重要。

土壤中微生物生物量的估算通常依赖于破坏性的化学处理方法，例如氯仿熏蒸8。其他方法则通过底物诱导呼吸或磷脂脂肪酸（PLFA）分析等技术选择性地针对活跃的微生物群落9。PLFA分析已被广泛用于评估微生物群落组成并估算真菌与细菌（F:B）的比值。然而，不同真菌和细菌物种之间细胞大小存在显著差异，在将PLFA浓度转化为生物量或基于种群的F:B比值时会引入不确定性，从而使此类估算结果可能不可靠10。其他方法如流式细胞术可用于提高土壤中细菌丰度测定的样本通量；然而，由于非微生物颗粒在大小、形状和自发荧光特性方面与微生物相似，可能导致其准确性降低11。氯仿熏蒸法需要相对大量的土壤（>10 g）来估算微生物生物量，而使用商业试剂盒进行DNA提取时，仅需500 mg土壤即可满足基于DNA的方法的要求。先前一项关于基于DNA的方法与氯仿熏蒸法的比较研究表明，尽管两种方法均可用于估算微生物生物量，但联合使用可更可靠地评估土壤微生物生物量12。

微生物群落评估是土壤健康中一种尚未充分利用的指标，具有改变我们测量和理解土壤方式的潜力13。通常采用代谢条形码技术来确定土壤微生物群落，通过扩增16S rRNA基因的特定区域来评估细菌的相对丰度，而真菌类群则通过18S rRNA基因或内转录间隔区（ITS）进行靶向分析14。针对真菌的代谢条形码方法可能依赖不同的基因组靶标区域，从而影响所鉴定真菌物种的多样性和丰度。由于不同真菌物种之间ITS长度不均一，可能导致扩增和测序过程中的偏好性，进而错误估计其丰度，最终导致对真菌群落的错误评估15。Fungiquant引物被设计用于靶向18S rRNA基因内的特定可变区，这些区域相较于其他真核生物具有更全面的多种真菌覆盖范围和更高的特异性16。

大多数细菌和真菌含有多个拷贝的目标基因，这会导致细胞计数估计出现偏差。此外，真菌通常具有多核细胞，每个细胞的核数量可变6。在分类群内部和不同分类群之间，核糖体RNA基因拷贝数存在显著变异，原核生物中通常少于15个拷贝，而真菌中估计在28至511个之间17。由于这种变异，用于分析微生物群落结构的分子技术被视为半定量方法，因为它们可能扭曲群落中物种相对丰度的估计18。测定的基因拷贝数（GCN）通常通过目标分类群的估计平均GCN换算为细胞丰度18,19,20。

一些研究采用了宏基因组学方法，因为与宏条形码技术相比，该方法具有多项优势，包括能够消除扩增偏差，并可全面检测整个微生物群落21。此外，该方法还能同时比较真菌和细菌的组成，并分析它们之间的相互关系22。通常，逆转录定量PCR（RT qPCR）被广泛用于检测微生物含量及其功能23。在绝对定量方面，qPCR与数字液滴PCR（ddPCR）相比存在局限性，因其对抑制物较为敏感，且需要使用外部标准品24。

数字滴定PCR（ddPCR）是一项突破性技术，其原理是将单个扩增反应分配到不同的液滴中。每个液滴中的模板均作为独立反应通过PCR进行扩增。与qPCR相比，ddPCR在细菌和真菌定量方面对酶抑制剂的敏感性更低，且具有更高的精确度、重复性、灵敏度和稳定性25。此外，该方法可用于土壤中细菌和真菌的绝对定量5。由于ddPCR依赖于用于评估微生物组成变化的相同提取DNA，因此ddPCR获得的丰度数据可直接与群落组成数据关联26，并用于量化土壤微生物生物量。 

本研究提供了一种利用数字微滴PCR（ddPCR）对土壤中真菌和细菌进行定量的方法。该优化方法已应用于来自全球五个不同地理位置和土地利用类型的土壤样品。采样地点涵盖了广泛的土壤性质、环境条件和管理措施，从而能够评估本方法在不同环境下的稳健性和普适性。这些数据可用于确定真菌与细菌的比例（F:B），作为土壤生态质量的分子生物指示指标。最后，将基于ddPCR的微生物数据估算的微生物生物量与传统的氯仿熏蒸法进行了比较。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这些方案的整体示意图见图1。所用试剂和设备列于材料表中。

1. 土壤取样

  1. 从全球五个地点采集复合表层土壤样品（0–20 cm），每个地点在25 m范围内的随机选定的三个点采集样品。
    注：所有样品均采自代表其所在区域土地利用方式的农业系统。土壤质地采用激光衍射法测定，使用激光衍射粒径分析仪进行测量（表1）。样品在常温下运输，并在4 ˚C下保存，直至进一步分析。

2. DNA 提取

注意：使用土壤DNA提取试剂盒，并按照制造商提供的说明书进行DNA提取。所有步骤的室温均为20 ˚C。

  1. 短暂离心2 mL珠磨管，确保珠子沉降至管底。加入100 mg土壤和800 µL溶液CD1，短暂涡旋混匀。
  2. 使用珠磨均质仪彻底均质样品，以6 m s−1的速度裂解40秒。
  3. 将珠磨管在室温下以15,000 × g离心1分钟，进行机械细胞裂解。
  4. 将上清液转移至洁净的2 mL微量离心管中。
    注意：上清液中可能仍含有土壤颗粒。
  5. 加入200 µL溶液CD2，涡旋5秒。
  6. 在室温下以15,000 × g离心1分钟。
  7. 将最多700 µL上清液转移至另一洁净的2 mL微量离心管中，避免触及沉淀。沉淀应可见。
  8. 加入600 µL溶液CD3，涡旋5秒。
  9. 将650 µL裂解液加入离心柱中，在室温下以15,000 × g离心1分钟。
  10. 弃去穿流液，重复步骤2.9，确保所有裂解液均通过离心柱。
  11. 将离心柱放入洁净的2 mL收集管中。
  12. 向离心柱中加入500 µL溶液EA，在室温下以15,000 × g离心1分钟。
  13. 弃去穿流液，将离心柱放回同一2 mL收集管中。
  14. 向离心柱中加入500 µL溶液C5，在室温下以15,000 × g离心1分钟。
  15. 弃去穿流液，将离心柱放入新的2 mL收集管中。
  16. 在室温下以最高16,000 × g离心2分钟。
  17. 将离心柱放入新的1.5 mL洗脱管中。
  18. 将50–100 µL溶液C6加至白色滤膜中心。
  19. 在室温下以15,000 × g离心1分钟。弃去离心柱，将洗脱液保存于-20 °C。

3. 纯化DNA的定量

注意：根据制造商说明书，使用荧光计和双链（dsDNA）宽范围（BR）检测试剂盒对纯化后的DNA进行定量。

  1. 使用缓冲液与试剂按199:1的比例配制工作液。
  2. 将每种DNA标准品各10 µL加入190 µL工作液中。
  3. 将1–20 µL纯化后的DNA加入180–199 µL工作液中，终体积应为200 µL。涡旋混匀后，将标准品和DNA样品在室温下孵育2分钟。
  4. 按照荧光仪屏幕上的操作提示，先分析标准品，再分析DNA样品。

4. 引物选择

  1. 针对土壤微生物的分析，根据相关参考文献选择特异性引物。对于细菌，使用16S rRNA引物25,27；对于真菌，使用18S rRNA引物16。
  2. 采用基于DNA结合染料的实时荧光定量PCR（qPCR）预混液和热循环仪进行扩增。引物序列见表2。

使用数字微滴式PCR进行微生物定量

  1. 将所有试剂在冰上解冻并涡旋混匀。
  2. 按如下方式配制 ddPCR 反应体系：加入 0.1 µL（10 µM）正向引物和 0.1 µL（10 µM）反向 16S 或 18S 引物，10 µL ddPCR Evagreen Supermix，X µL 含 0.5 ng 模板 DNA，用无核酸酶水（NFW）将最终反应体积调整至 22 µL。每列设置一个阴性对照，以无核酸酶水替代模板 DNA。
  3. 将 DG8 放入微滴生成卡盒架中。
  4. 将总共 20 µL 反应混合液加入卡盒的样品孔中。
  5. 在标有“oil”的卡盒孔中加入 70 µL Evagreen 微滴生成油。
  6. 将卡盒放入微滴生成仪中，并用垫圈盖紧卡盒。
  7. 将生成的 40 µL 微滴转移至 96 孔（半裙边）板中进行 PCR 扩增。
  8. 使用板封仪密封 96 孔板（温度：180 ˚C，时间：5 秒）。
  9. 使用以下循环程序，热盖温度设为 105 ˚C。
    注意：(a) 细菌：98 ˚C 预变性 5 分钟，进行 40 个循环；94 ˚C 变性 30 秒，61 ˚C 退火 60 秒，4 ˚C 保持 5 分钟，98 ˚C 最终延伸 10 分钟。(b) 真菌：95 ˚C  预变性 5 分钟，进行 40 个循环； 95 °C  变性 30 秒， 55 °C 退火 1 分钟，72 °C  延伸 30 秒，4 °C 保持 5 分钟，90 °C 最终延伸 5 分钟。
  10. 将 96 孔板转移至微滴读取仪。
  11. 使用 QuantaSoft 软件版本 2.1 评估每个孔的拷贝浓度。调整振幅阈值以区分阴性与阳性微滴。
  12. 通过将拷贝数/µL 乘以最终反应体积（20 µL），再除以反应中加入的总模板 DNA 量，计算每纳克 DNA 的基因拷贝数，公式如下：(拷贝数 µL-1 × 反应体积) / 反应中加入的总 DNA 量。
  13. 通过将每纳克 DNA 的基因拷贝数乘以提取的总 DNA 量（ng），计算每纳克提取 DNA 的总基因拷贝数，公式如下：(每纳克基因拷贝数 × 提取的总 DNA 量)。
  14. 通过将每纳克提取 DNA 的总基因拷贝数除以提取过程中所用土壤的干重（g），计算每克土壤的基因拷贝数，公式如下：
    每克基因拷贝数 = （每纳克提取 DNA 的总基因拷贝数 / 提取过程中处理的土壤干重（gdw，克））。
  15. 根据平均基因拷贝数（GCN）将基因拷贝数转换为细胞数，公式如下：
    细胞数 = 每克基因拷贝数 / 平均每个细胞的基因拷贝数 cell-1）。
  16. 使用以下公式将细胞数转换为微生物生物量碳（MBC）：
    16S 的 MBC（mg C g-1 土壤）= cells gdw-1 × (100 fg cell-1) × 10−15 (g fg-1) × 103(mg g-1)28
    18S 的 MBC（mg C g-1 土壤）= cells gdw-1 × (6 fg cell-1) x 10−12 (g fg-1) × 103 (mg g-1)29
    完整流程见 图 2。
    注意：46 个细菌门的平均 16S rRNA 基因拷贝数（均值 ± 标准差）20 已计算并用作细菌的校正因子，最终值为 2.48。对于真菌，根据 Lofgren 等人17 的研究，采用 113 作为校正因子。微生物生物量碳（MBC）由 ddPCR 获得的细胞数估算，假设每个细菌细胞含碳量为 100 fg28，每个真菌细胞含碳量为 6 pg29。

6. 基于全基因组测序的土壤分子分析

  1. 按照牛津纳米孔技术公司（Oxford Nanopore Technologies）的 SQK-NBD114 方案，使用原位条形码试剂盒 24 V14（SQK-NBD114.24）制备测序文库（参见材料表）。确保每个样本使用试剂盒中提供的一种条形码。
  2. 使用牛津纳米孔技术公司 R10.4.1 测序芯片对制备好的文库进行测序。
  3. 在测序过程中，于 MinKnow 中执行碱基识别，选择超高精度（SUP）模型，并开启条形码修剪功能。Dorado 版本：0.7.2+9ac85c6。
  4. 使用分类学分类工具 Kraken2（v2.1.3）30，针对 NCBI 非冗余蛋白（nr）数据库（置信度 0.05）对 DNA 测序读段进行物种分类。
  5. 检查 Kraken2 生成的报告文件，获取细菌和真菌的总读段分类结果。
  6. 计算每个样本中细菌和真菌的相对丰度。

7. 氯仿熏蒸法测定土壤微生物生物量碳

  1. 将新鲜土壤样品称重后放入已预称重的称量盘中，在105 °C烘箱中烘干24小时。
  2. 通过从新鲜土壤重量中减去干土重量，并将差值除以新鲜土壤重量，计算土壤含水量。
    含水量 (%) = ((W湿 – W干)/ W干) × 100
  3. 利用含水量计算土壤干物质含量。
    干物质含量 (%) = 100 – 含水量 (%)
  4. 将5 g土壤分别加入两个独立的50 mL离心管中，标记为未熏蒸和熏蒸。
  5. 向标记为未熏蒸的离心管中加入共25 mL的0.5 M K2SO4溶液。
  6. 将未熏蒸样品在室温下置于旋转摇床中振荡1小时。
  7. 向标记为熏蒸的离心管中的土壤直接加入2 mL无乙醇氯仿。盖紧管盖并用Parafilm封口膜密封，在室温避光条件下孵育24小时。
  8. 将未熏蒸样品在室温下以2,500 x g离心10分钟。
  9. 倾出未熏蒸样品的上清液，经0.45 µm纤维素滤膜过滤后，于-20 ˚C保存。
  10. 打开熏蒸样品的管盖，在通风橱中通风2小时，然后进行K2SO4提取（重复步骤5–9），提取液于-20 ˚C保存。
  11. 使用总有机碳分析仪测定“熏蒸”和“未熏蒸”样品提取液中的碳浓度。
  12. 使用以下公式计算微生物生物量碳（MBC）：MBC = (熏蒸样品碳含量 – 未熏蒸样品碳含量) / 0.45。结果以每克干重土壤为基准进行标准化。

8. 土壤有机质含量估算

  1. 将瓷坩埚置于 105 ˚C 的对流烘箱中干燥 30 分钟，冷却至 20 ˚C 后称重（WC）。
  2. 将最多 2 g 的土壤放入已干燥的坩埚中，再次称重。
  3. 将装有土壤的坩埚置于 105 ˚C 的对流烘箱中干燥 24 小时。
  4. 放入密封干燥器中冷却，然后再次称重（WS）。
  5. 将马弗炉预热至 550 ˚C，然后将装有土壤的坩埚放入炉中灼烧 4 小时。
  6. 从马弗炉中取出坩埚，放入干燥器中冷却。
  7. 称量坩埚与土壤的重量（WA）。
  8. 通过计算土壤在 550 ˚C 孵育前后干重的差值，测定土壤有机质百分比。
    SOMLOI = [(WS – WA)/(WS – WC)] × 100

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

从五个地点采集了土壤样品，并通过灼失法测定土壤有机质含量。本研究中所用各种土壤的有机质含量介于3.38%至10.34%之间（表1）。每份土壤样品均进行三次重复DNA提取，所得DNA产量为每克干土32 ng至4,590 ng（图3A）。

不同有机质含量的土壤中DNA浓度存在显著差异（单因素方差分析，p < 0.0001，R2=0.97）。有机质含量最低的土壤A并未表现出最低的DNA浓度。然而，有机质含量最高的土壤E，其DNA浓度显著高于其他所有土壤（A–D，p < 0.0001），而土壤B的DNA浓度最低，且显著低于土壤A和D（p < 0.05）。采用16S和18S rRNA基因引物，对从各土壤样品中纯化的DNA进行ddPCR分析。利用ddPCR测定每克干重土壤中16S（图3B）和18S rRNA（图3C）基因的拷贝数。在所有土壤样品中，18S rRNA基因拷贝数均少于16S rRNA基因。Tukey事后检验显示，土壤B的16S和18S rRNA基因拷贝数最少，平均每克干土分别为8.8 × 107和4.6 × 106拷贝。土壤E与其他所有土壤差异显著，其16S和18S rRNA基因拷贝数最高，每克干土分别为4.4 × 109和2.5 × 109拷贝。土壤A–D中的真菌基因拷贝数之间无显著差异，而土壤D中的细菌基因拷贝数与土壤B和E相比差异显著。

对从各土壤样品中纯化的DNA进行了全基因组鸟枪法（WGS）测序，并使用Kraken2针对NCBI nr数据库进行分类学注释。通过统计比对到细菌和真菌的DNA序列读段总数，计算每个土壤样品的真菌：细菌比率（F:B），并与基于ddPCR估计的基因拷贝数计算出的真菌：细菌比率进行比较（补充图1）。ddPCR测得的F:B比值在所有土壤样品中范围为0.022至0.66，均高于全基因组测序方法所得结果。土壤E中的平均F:B比值最高，ddPCR测得为0.56，WGS方法测得为0.038。此外，与WGS相比，ddPCR在土壤样品中检测到的F:B比值范围更广。另外，ddPCR方法测定的F:B比值与WGS数据之间存在正相关关系（r = 0.59，R2 = 0.35，p = 0.019），如补充图1所示。

采用细菌和真菌的平均基因拷贝数，将计算得到的基因拷贝数转换为原始样品中细菌和真菌的细胞数量（补充图2）。这些数据被合并用于估算土壤中微生物细胞的总数（图3D），不同土壤之间的微生物总量存在显著差异（单因素方差分析，p < 0.0001）。Tukey成对比较分析显示，土壤E中的微生物含量最高，而土壤B采集样品中的微生物含量最低，且显著低于土壤A、D和E。

对每份土壤样品进行三份平行的氯仿熏蒸处理，以估算各样品中的总微生物生物量碳（MBC）（图4A）。在所用的土壤中，每克干土检测出的碳含量介于3.6至9.6 mg之间，各样品间无显著差异（单因素方差分析，p = 0.266）。采用细菌和真菌细胞的平均碳含量，将数字滴定PCR（ddPCR）估算的微生物细胞数量转换为总微生物生物量碳的估算值。将基于ddPCR的估算结果与氯仿熏蒸法进行比较（图4B）。为评估氯仿熏蒸法与ddPCR法测定的MBC之间的关系，进行了皮尔逊相关性分析（n = 15）。两种方法之间存在正相关关系（r = 0.43，R2 = 0.18，p值 = 0.05）。来自土壤E的离群值（其特征为有机质含量最高）可能对该结果的边缘显著性产生了不成比例的影响（图4B）。

土壤分析示意图：ddPCR、DNA测序、微生物生物量、土壤有机质定量。
图1：土壤样品处理流程概述。该图展示了利用土壤DNA进行微生物定量的分子方法，以及用于测定微生物生物量碳和土壤有机质的传统方法。请点击此处查看此图的放大版本。

DNA 拷贝数转为基因拷贝数的计算流程图；ddPCR 方法；总基因拷贝数，微生物生物量。
图 2：从 ddPCR 检测得到的 16S 和 18S 基因拷贝数到最终微生物生物量碳估算的细胞计数流程图，展示本实验方案的步骤 5.11–5.16。 请点击此处查看该图的高清版本。

DNA 和 RNA 定量图；A-D 面板；微生物分析；基因拷贝数、微生物细胞数。
图 3：土壤微生物定量分析。（A）从各土壤样品中纯化的 DNA 平均浓度。（B）使用数字液滴 PCR（ddPCR）测定的每克土壤干重的 16S rRNA 基因拷贝总数平均值。（C）使用 ddPCR 测定的每克土壤干重的 18S rRNA 基因拷贝总数平均值。（D）各土壤样品中每克干重的微生物细胞总数平均值。所有误差线表示平均值的标准误。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）及后续的 Tukey 多重比较检验进行统计分析，显著性差异以紧凑字母显示法表示（显著性阈值 = 0.05）。样品按有机质含量（OM%）从低到高排列。土壤来源（OM%）A：荷兰（3.38），B：伊拉克（5.14），C：中国（6.41），D：英国（8.19），E：英国（10.34）。请点击此处查看该图的高清版本。

微生物生物量碳数据；图A显示方差，图B将ddPCR结果与TOC结果进行对比。
图 4：通过氯仿熏蒸提取法和基于基因的细胞数量估算测得的微生物生物量碳。（A）通过氯仿熏蒸法提取的微生物生物量碳（MBC），按有机质含量从低到高排列。误差线表示平均值的标准误差。进行单因素方差分析（one-way ANOVA）及后续的Tukey多重比较检验，显著性差异采用紧凑字母标记法表示（显著性阈值 = 0.05）。（B）根据ddPCR测定的基因拷贝数推算细胞丰度（cell gdw -1），再转换为生物量碳含量，并与同一样品的总有机质含量进行对比作图。请点击此处查看该图的高清版本。

样品土壤来源pH含水量 %有机质%质地土地利用方式
ATexel, Netherlands7.1619.043.38Sandy loam园艺种植
BNajaf, Iraq7.588.335.14Silty loam水稻种植
CJiangxi, China4.118.456.41Silty loam芝麻/油菜种植
DCambridge, UK6.8121.88.19Silty loam小麦种植
EExeter, UK5.4420.2710.34Silty loam草地

表1：用于微生物生物量测定的五种土壤样品（A–E）的理化性质和土地利用特征。

靶标bp上游引物下游引物参考文献
16S rRNA1805′- ACTCCTACGGGAGGCAGCAG5′- ATTACCGCGGCTGCTGG(Le Geay et al., 2024; Ovreås et al., 1997)
18S rRNA3515′-GGRAAACTCACCAGGTCCAG5′-GSWCTATCCCCAKCACGA(Liu et al., 2012)

表2：使用ddPCR靶向16S和18S rRNA基因所选用的引物对。

补充图1：通过ddPCR方法和WGS测定的所有土壤样品中F:B比值的相关性。请点击此处下载该文件。

补充图2：使用靶向以下目标的ddPCR方法测定的不同土壤样品中的细胞数量：(A) 细菌；以及 (B) 真菌。请点击此处下载该文件。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

土壤微生物是陆地生态系统中的主要分解者，在养分循环和作为 土壤中的碳储存。尽管土壤微生物具有重要性，但使用基于基因拷贝数的方法准确量化其绝对丰度仍具挑战性，原因包括不同物种中目标基因拷贝数的变异性等多种因素。本研究展示了如何通过数字滴液PCR（ddPCR）靶向原核生物的16S rRNA基因和真核生物的18S rRNA基因编码区，来定量土壤微生物生物量。在土壤E中观察到最高的真菌：细菌（F:B）比值，该样品同时具有最高的有机质百分比。第二高的F:B比值出现在样品C中，这与这些土壤的高酸性相关。该结果在样品C和E中符合预期，因为真菌生长在较低pH条件下增强。31对用于ddPCR方法的相同DNA提取物进行全基因组测序。比较了WGS与ddPCR之间的F:B比值。所有分析样本中，由WGS数据计算得到的F:B比值均低于由ddPCR数据计算得到的F:B比值。然而，不同样本间F:B比值的整体变化趋势在两种方法之间在视觉上具有可比性。土壤样本的F:B比值高于全基因组测序结果，且在不同土壤类型间表现出更大的F:B比值变异性。WGS数据中观察到的较低F:B比值可能源于真菌与细菌基因组大小的差异，且在无富集条件下真菌序列可能被低估32此外，尽管土壤A的有机质含量最低，但其微生物拷贝数和微生物生物量碳并未呈现最低值，这表明有机质含量并不总是与微生物生物量直接相关。值得注意的是，起始DNA浓度之间观察到的趋势（图3A）以及总微生物细胞（图 3D在形态上相似，表明DNA浓度可作为微生物生物量的良好替代指标。

数字PCR（ddPCR）能够准确定量土壤样品中的基因拷贝数，并可用于估算总的微生物细胞数量。然而，该方法也存在一些需要考虑的局限性。不同微生物类群之间的16S和18S rRNA基因拷贝数差异很大23。因此，使用单一的基因拷贝数校正因子可能导致对样品中微生物丰度的高估或低估33。这一局限性可通过结合对微生物群落的先验知识18、利用全基因组测序数据，以及应用能够代表特定土壤微生物群的适当基因拷贝数校正方法加以解决。尽管分子方法提供的仍是估算值而非精确计数，但其对微生物丰度的预测更为准确。当与群落组成数据相结合时，该方法可实现超越相对丰度本身的深入解析19,34。

采用氯仿熏蒸法估算的微生物生物量碳（MBC）在所分析的样品间未显示出显著差异，但在样品A–D中观察到MBC存在较大变异。相比之下，采用数字滴定PCR（ddPCR）方法测定的总微生物细胞数量检测到显著差异，表明该分子方法可能比传统技术具有更高的分辨能力。然而，由微生物细胞数量计算微生物生物量碳本身存在局限性。细胞大小的变异性会影响细胞计数向生物量的转换。与使用单一的基因拷贝数转换因子类似，使用单一的细菌和真菌碳含量转换因子可能导致微生物生物量碳的高估或低估。

此外，基于DNA的方法在比较细菌与真菌优势度差异较大的土壤时可能尤为存在问题。DNA得率和基因拷贝数（GCN）还可能受到DNA提取方法和引物设计选择的影响35,36，从而导致实验室间的比较困难37。另外，GCN和DNA得率方法均可能因所谓的“残留DNA”（即来自死亡生物体或与黏土结合的DNA）而产生高估14,38。尽管ddPCR方法表现出更高的精确度和重复性，但其缺点包括操作流程复杂、成本较高，以及在使用EvaGreen化学体系时需使用非特异性DNA染料5。这可能导致微弱的假阳性信号，使得阳性液滴与阴性液滴难以区分，当基因拷贝数较低时，轻微的阈值调节偏差就可能影响真菌与细菌（F:B）比值14。为了提高可处理样本数量，可采用液体处理机器人实现DNA提取和反应体系构建的自动化39。此外，新型ddPCR系统支持更高程度的多重检测，可同时为96个样本生成液滴。

需要注意的是，所有微生物生物量的测定均为估算值，且涉及通用的转换系数以确定数量37。因此，不同方法之间的比较应谨慎进行，因为目前尚不清楚哪种方法最为准确。尽管如此，氯仿熏蒸-提取法在过去几十年中被广泛使用，该方法依赖氯仿蒸气对土壤进行熏蒸。由于氯仿对人类和环境具有毒性，且其裂解土壤微生物细胞的效果存在争议，这一方法已引发诸多关注40。此外，氯仿熏蒸可能导致来自非生物来源（如植物残体）的微生物生物量碳（MBC）被高估41。最后，与其他仅需极少量土壤（<500 mg）的分子方法相比，该方法需要相对大量的土壤样品。

本研究提供了证据，表明基于数字滴液PCR（ddPCR）的土壤微生物生物量测定方法在多种土壤中均具有稳健性，且不受不同土壤类型和潜在抑制物的影响。该方法的成功应用依赖于起始DNA样本的质量，因此，确保从样本中有效纯化DNA至关重要。该方法在多种土壤类型和质地中的微生物检测与定量方面展现出良好前景，可作为现有微生物生物量估算方法的有力补充，并为土壤健康监测以及区域或全球微生物组监测的规模化应用提供重要支持。

披露

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作者声明无利益冲突。

致谢

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我们感谢Nina Lindstrom-Friggens博士、Liz Cressey博士、Joanna Zaragoza-Castells博士、Angela Elliott、Kees Jan van Groenigen博士以及Iain Hartley教授。我们还要感谢提供本研究土壤样品的土地所有者。本研究由壳牌研究有限公司（Shell Research Ltd，项目编号CW648947-PT34767）资助。本研究期间生成的数据集可在美国国家生物技术信息中心（NCBI）序列读取档案库（Sequence Read Archive）中获取，登录号为PRJNA1305539。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Bettersizer S3 Plus Bettersize，中国BT-803
离心机Thermoscientific SL16 
氯仿 ThermoScientificL14759.AU 
ddPCR 96孔板Bio-Rad，沃特福德，英国12001925
ddPCR 微滴读取油 Bio-Rad，沃特福德，英国1863004
干燥器 Davisil
DG8 微滴生成卡夹Bio-Rad，沃特福德，英国1863051
用于 QX200/QX100 微滴生成仪的 DG8 卡盒Bio-Rad，沃特福德，英国1864008
用于 QX200/QX100 微滴生成仪的 DG8 密封垫圈Bio-Rad，沃特福德，英国Q33265
DNeasy PowerSoil pro 试剂盒 Qiagen，德国47017
双链 (dsDNA) 宽范围 (BR) 检测试剂盒Invitrogen，德国Q33230
FastPrep-24 5G MP Biomedicals，英国116005500
GridION Oxford Nanopore Technologies，英国GRD-MK1CAPX
K2SO4Merck，英国7778-80-5
Mag-Bind 磁珠Omega Bio-tek，美国M1378-01
MinION 流动池Oxford Nanopore Technologies，英国FLO-MIN114
马弗炉Carbolite AAF1100
原生条形码试剂盒 24Oxford Nanopore Technologies，英国SQK-NBD114.24
PCR 板热封膜，铝箔，可穿刺 Bio-Rad，沃特福德，英国1814040
PX1 PCR 板封膜仪Bio-Rad，沃特福德，英国1814000
Qubit 荧光计Invitrogen，德国Q33226
QX200 微滴数字 PCR 系统Bio-Rad，沃特福德，英国1864001
QX200 ddPCR EvaGreen 预混液Bio-Rad，沃特福德，英国186-4033
用于 EvaGreen 的 QX200 微滴生成油 Bio-Rad，沃特福德，英国1864005
QXDx 微滴生成仪 Bio-Rad，沃特福德，英国12001049
SENSOQUEST LABCYCLER Geneflow，德国1120280125

参考文献

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ddPCR 16S rRNA 18S rRNA DNA

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