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基于荧光的钙成像结合自动细胞分割技术在原代人呼吸道上皮细胞培养中的应用

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DOI：

10.3791/69470

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2026年5月22日

 ,  , 
1Molecular Medicine, Hospital for Sick Children, 2Department of Biochemistry, University of Toronto, 3Department of Physiology, University of Toronto

本文内容

摘要

活细胞钙信号成像被广泛用于研究在单层培养的稳定细胞系中的钙离子动员。本方案描述了利用活细胞染料对复杂原代组织进行活细胞荧光成像以检测钙信号，并结合机器学习软件同时量化数千个单个细胞的荧光强度，从而简化分析流程。

摘要

钙信号在众多生物过程中至关重要，这凸显了开发研究原代组织中钙流方法的必要性。在复杂的原代上皮细胞培养物中以单细胞分辨率研究钙信号具有挑战性，因此目前相关研究仍较为匮乏。本研究介绍了适用于监测原代气道上皮细胞培养物中活体钙信号的方法，以及基于机器学习的新型分析手段。利用来自患者的原代气道上皮细胞培养物，在气液界面（ALI）分化后加载外源性荧光指示染料，通过落射荧光显微镜以单细胞分辨率测量钙动员。我们开发了一种新型软件，该软件采用基于机器学习的细胞分割技术，随时间将荧光强度分配给各个细胞。总体而言，经过优化的成像系统与软件为分析原代上皮细胞培养物中的单个细胞提供了快速且无偏倚的方法。本文提供的逐步实验方案将有助于未来对构成原代上皮细胞培养物的各个细胞及细胞类型中钙信号的研究。

引言

细胞内钙离子动员的变化调控多种细胞过程，包括基因表达的改变和固有免疫反应的调节1,2细胞内钙水平的变化可通过内质网和线粒体等细胞内钙库的钙释放来实现。1,2,3细胞外钙离子流入细胞内空间也可通过被动和主动运输方式改变胞质钙浓度2活细胞成像中钙离子动员的检测主要通过细胞内染料或基因编码染料GCaMP（Green Calcium-activated Multimer/Protein）进行4文献中常见的是乙酰氧基甲基（AM）偶联染料，其可使染料穿透质膜5,6,7,8进入细胞后，AM基团被细胞内源性酯酶切割，染料由此获得负电荷，从而被滞留在胞质中9由于染料获得电荷，可通过细胞质膜上的有机阴离子通道被泵出细胞。因此，加入有机阴离子外排转运蛋白抑制剂丙磺舒，以阻止染料的细胞外排，维持最佳的胞质信号10,11研究通常采用Fura-2 AM（一种比率型染料）和Fluo-4 AM（一种强度型染料），在单层培养的稳定细胞系中检测钙信号。本研究采用了一种改进的方案，结合 recently developed 的强度型钙离子染料Cal-520 AM，用于在气液界面培养的多层细胞模型中进行落射荧光成像。与Fluo-4 AM相比，Cal-520 AM具有更高的灵敏度，因此适用于在复杂的原代上皮细胞培养物中以单细胞分辨率可靠地可视化微弱信号。目前文献中已有大量关于稳定细胞系群体钙信号活细胞成像的研究，然而，现已普遍认识到 体内，组织构成了复杂的细胞环境，支持不同细胞类型在维持组织稳态中发挥特异性功能12,13,14,15尽管这一现象已被广泛认知，但不同类型细胞协调钙信号并调控钙离子稳态的具体机制仍不清楚。因此，本文所展示的方法将实现对原代气道组织中单细胞钙信号的检测，并提高下游分析的通量。

我们正在利用先前已发表且经过严格验证的人鼻上皮原代上皮细胞培养模型，作为一种在更具生物学相关性的模型中对活细胞胞质钙进行成像的工具16,17,18。简言之，上皮细胞从患者鼻刷样本中分离后，培养于Transwell小室中的半透膜上，并将该小室置于培养孔内，以维持气液界面（ALI）。该气液界面结合特制培养基，已通过多种正交技术对不同细胞类型的存续进行了严格验证16,17,18。此外，已有研究表明，当前方法可推广应用于原代支气管上皮细胞培养，其培养方式与我们的原代鼻上皮细胞培养类似19。

本文介绍了一种改进的方法，用于在单细胞分辨率下测量和分析这些原代气道上皮培养物中的活体钙信号。这些多层培养物在显微镜下难以清晰观察；然而，当前的实验装置使我们能够可靠地聚焦于多层结构中的单一层，从而检测来自这些特定层的钙离子动员。该装置具有多项优势：它无需灌流系统，而灌流系统通常成本较高，且除非使用专用显微镜，否则难以适配。本研究采用了落射荧光显微镜，其时间分辨率优于共聚焦成像。使用发光二极管（LED）可显著降低光毒性，相较于基于激光的共聚焦系统更具优势。本方案采用外源性强度型染料，因其能够快速反映整个细胞群体中钙离子的相对变化，并且适用于大多数荧光显微镜系统。这一点优于常见的比率型染料，后者需要深紫外（UV）激发光，而许多显微镜并不具备该功能。此外，GCaMP 需要转染或转导，这使其更适合在特定细胞类型中进行靶向钙成像。但由于原代上皮培养物中转导和转染效率较低，该技术难以适用于对整个细胞群体的监测。

此外，本研究开发了一种基于机器学习的新型专用软件，该软件可根据活细胞核染色实现单细胞分割。随后，该软件能够记录每个细胞随时间变化的荧光强度值。研究首先采用稳定的上皮细胞系（Calu-3）进行方法优化，然后将这些方法应用于原代上皮细胞培养物中单细胞钙离子动员的研究。研究对钙离子荧光染料和丙磺舒的浓度、孵育步骤的时间以及成像设置等变量进行了优化。在此，钙信号以0.2 fps（每秒帧数）的帧率进行记录，该帧率适用于监测钙信号动态变化。如需检测更快速的钙瞬变信号，可提高帧率20。最终，将优化后的参数进一步应用于更复杂的原代鼻上皮培养体系，并进行进一步优化。

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方案

所用试剂和设备列于材料表中。

1. Calu-3 细胞的维持与培养

  1. 在添加了20%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的EMEM培养基中，于T-25培养瓶中培养Calu-3细胞。将培养基预热，并每隔一天更换一次（每瓶5 mL）。
  2. 当培养瓶中的细胞达到70%融合度时，吸除培养瓶中的培养基。
  3. 用5 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）清洗培养瓶。
  4. 直接向细胞中加入1 mL TrypLE，在37 °C、5% CO2条件下孵育10–15分钟。确保所有细胞均已从培养瓶底部脱落，并解离成单细胞悬液。
  5. 加入4 mL新鲜培养基（步骤1.1）以中和反应，然后用血清移液管充分混匀细胞，确保接种均匀。
  6. 将细胞以90%–100%融合度（约40,000个细胞/孔）接种至96孔板。
    1. 接种时，每孔加入200 µL充分混匀的细胞悬液。
    2. 让细胞在96孔板中贴壁过夜。
  7. 每天更换培养基（每孔200 µL），直至准备进行实验。
  8. 细胞在孔内达到融合后，需继续培养2–5天再开始实验，以允许细胞充分分化。

2. Calu-3 细胞负载 Cal 520 AM 或 Fluo-4 AM 的实验方案

警告：Fluo-4 AM 和 Cal-520 AM 溶于被视为有害物质的 DMSO 中。丙磺舒被列为急性危害物质。操作化学品时请佩戴手套和实验服，避免与皮肤接触。所有化学品应弃置于指定的化学废弃物容器中。

  1. 实验当天，用移液器吸出孔板中的培养基，并用预热的钙缓冲液（140 mM NaCl、5 mM KCl、1 mM MgCl2、2 mM CaCl2 和 10 mM Hepes，用 NaOH 调节至 pH 7.38，291 mOsm）洗涤细胞两次（每次 200 µL/孔），以去除死细胞。
  2. 将细胞与染料工作液在 37°C、5% CO2 的培养箱中孵育 1 小时，每孔加入 200 µL 染料工作液，其中包含 3 µM Cal-520 AM、2.5 mM 丙磺舒和 1:5000 的 Hoechst 核染料，溶剂为钙缓冲液（步骤 2.1）。
    1. 对于 Fluo-4 AM 实验，将细胞与染料工作液在 37°C、5% CO2 条件下孵育 1 小时，每孔加入 200 µL 染料工作液，其中包含 3 µM Fluo-4 AM、2.5 mM 丙磺舒和 1:5000 的 Hoechst 核染料，溶剂为钙缓冲液（步骤 2.1）。
      注意：用铝箔包裹染料管，避免光照。
  3. 在孵育期间，用钙缓冲液（步骤 2.1）配制毒胡萝卜素溶液。调整中间储备液浓度，以确保加药后孔内达到正确的终浓度。
    注意：此处向 100 µL 现有钙缓冲液中加入 50 µL 药物溶液，因此需配制 3 倍浓度的中间储备液（6 µM）。
  4. 孵育 1 小时后，用移液器吸除染料溶液，并用钙缓冲液（步骤 2.1）洗涤两次（每次 200 µL/孔），以去除细胞外残留染料。
  5. 洗涤后，每孔加入 100 µL 用钙缓冲液（步骤 2.1）稀释的 2.5 mM 丙磺舒溶液，以维持染料在胞质内的滞留。
  6. 用铝箔包裹孔板，避光保存。此时细胞已准备好进行成像。

3. 为 Calu-3 稳定细胞系设置显微镜

  1. 使用配备SuperFluor物镜、稳定的固态光源和CMOS荧光相机（像素尺寸为6.5 µm）的落射荧光显微镜。照明强度设定为500 mW。
  2. 使用96孔板适配器将细胞培养板放置在载物台上。在明场模式下，先用低倍率（5-10x空气物镜）对细胞层进行聚焦，以找到细胞单层。
    注意：此步骤为可选，但有助于高效地初步聚焦到细胞层。
  3. 确定细胞层位置后，继续使用明场模式切换至更高倍率（20x空气物镜），并对细胞层重新聚焦。
    注意：需确保在明场下对单层细胞实现正确聚焦，细胞边界应清晰可见。
  4. 使用GFP（475 nm LED）通道识别钙离子染料信号。LED功率应控制在5%-10%之间，以避免光漂白；曝光时间应适当，能够在不使信号过饱和的前提下观察到基础绿色荧光信号，通常为300-500 ms。
    注意：为确保实验可重复性和染料负载均匀，需对细胞层进行定性分析；大多数细胞应表现出相似的亮度。应选择死细胞较少的视野进行观察，因为死细胞在添加任何刺激物之前会强烈荧光。可使用Fiji软件测量相对基础荧光强度（步骤7.9）。若染料负载均匀，细胞间的基础荧光强度差异应接近10%-15%（步骤7.9）。
  5. 使用DAPI（405 nm）LED通道识别Hoechst核染色信号。LED功率应设置在2%-5%之间，曝光时间为50-100 ms。
    注意：若细胞处于焦点位置，细胞核应呈现清晰的轮廓。需确保核信号未达到饱和，以免干扰绿色荧光通道。

4. 获取活体钙成像视频

  1. 以每5秒1帧（0.2 fps）的时间间隔开始录制持续10分钟的实时视频。
    注意：在每一帧中均需采集各荧光通道（DAPI 405 nm 和 GFP 475 nm）的图像。
  2. 视频开始录制后，先进行5分钟的基线读数，然后再加入激动剂。
  3. 使用P200移液器，向含有100 µL含2.5 mM丙磺舒的钙缓冲液的孔中加入50 µL浓度为3倍中间储备液的毒胡萝卜素。在孔内轻柔地吹打1-2次，确保药物均匀分散。加入毒胡萝卜素后继续读取5分钟的数据。
    注意：加药步骤至关重要；移液器枪头不得接触培养板表面，以免改变焦平面。应使枪头漂浮于液面上，仅与孔内的缓冲液接触。若药物混合过于剧烈，可能导致细胞从培养板上脱落，从而干扰信号。
    注意：务必记录加药时对应的帧数，以便后续分析。
  4. 保存视频以及实验前拍摄的快照。随后进行数据分析。

5. 使用 Cal 520 AM 或 Fluo-4 AM 负载原代气道细胞的实验方案

  1. 实验当天，从trans well中移除基底外侧培养基，并使用750 µL基底外侧和300 µL顶侧的钙缓冲液（步骤2.1）分别清洗插入膜的顶侧和基底外侧各两次。
  2. 将细胞在37 °C、5% CO2条件下，用600 µL基底外侧和200 µL顶侧的Cal-520 AM或Fluo-4 AM染料孵育1小时。染料配制方法与Calu-3细胞相同：对于Cal-520 AM，使用含3 µM Cal-520 AM、2.5 mM丙磺舒和1:5000 Hoechst的钙缓冲液（步骤2.1）；对于Fluo-4 AM，使用含3 µM Fluo-4 AM、2.5 mM丙磺舒和1:5000 Hoechst的相同钙缓冲液。
  3. 在孵育期间，配制毒胡萝卜素（thapsigargin）的3倍中间储备液，使其终浓度为2 µM（即中间储备液浓度为6 µM）。
  4. 孵育结束后，吸除染料溶液，并用含钙缓冲液（步骤2.1）进行两次清洗，每次使用300 µL顶侧和750 µL基底外侧缓冲液。
  5. 清洗后，在顶侧加入100 µL、基底外侧加入500 µL含2.5 mM丙磺舒的钙缓冲液（步骤2.1）。
  6. 保持trans well置于培养板内，用铝箔包裹培养板。此时细胞已准备好进行成像。

6. 为原代鼻腔插入物设置显微镜

  1. 准备一个适用于成像的玻璃底培养皿、镊子和细遮蔽胶带。用70%乙醇快速擦拭培养皿以确保其清洁，并使其完全干燥。
  2. 将玻璃底培养皿放入落射荧光显微镜的小型圆形适配器中。
  3. 使用镊子小心地将插入物置于玻璃底培养皿的中央。
    注意：操作时需小心，避免溅出已加入插入物顶端腔室中的缓冲液。
  4. 为确保在加药过程中插入物不发生移动，使用遮蔽胶带将插入物顶部的塑料部分固定在玻璃底培养皿的侧壁上。
  5. 将带有插入物的适配器放置在显微镜载物台上，首先使用10倍空气明场物镜对细胞进行聚焦。
  6. 使用GFP（475 nm LED）通道识别钙离子染料信号。LED功率应控制在5%-10%之间，以避免光漂白；曝光时间应适当，以清晰观察到基础绿色信号而不至于过饱和，通常在300-500 ms之间。
    注意：请参见步骤3.4下的说明，以确保钙离子染料正确加载。
  7. 使用DAPI（405 nm）LED通道识别Hoechst核染色信号。LED功率应保持在2%-5%之间，曝光时间为50-100 ms。
    注意：若细胞处于焦点，细胞核应呈现清晰、轮廓分明的形态。应聚焦于最顶端的细胞层，并调节显微镜的z轴，找到细胞仍保持清晰对焦的最高焦平面。确保核信号不达到饱和，以免干扰绿色荧光通道。
  8. 为获取活细胞钙成像视频，请遵循步骤5.1-5.4。在加药步骤中，应将药物加入插入物中心，并使用P200移液器缓慢重悬。
    注意：请务必记录下药物添加时的帧数，以便后续分析。

7. 使用 Fiji 软件进行分析

  1. 打开 Fiji 软件，选择文件 \ 打开，上传视频文件，在弹出的窗口中保留所有默认设置。
  2. 如有需要，在图像 \ 调整 \ 亮度/对比度中，调节各个荧光通道的亮度和对比度，以获得细胞的最佳观察效果。
  3. 为便于细胞追踪，使用图像 \ 颜色 \ 合并通道功能合并核染色或明场通道，并在弹出窗口中为每个通道选择相应的文件。
  4. 若需根据细胞边界和核染色追踪特定细胞，请使用分析 \ 工具 \ ROI 管理器，并在弹出窗口中勾选“显示全部”和“标签”选项。
  5. 使用自由选择工具仔细勾画细胞轮廓，并按 t 键添加细胞。
    注意：确保在视频的四个角和中心区域均进行细胞追踪。
  6. 当所有细胞均被准确追踪后，在包含所有 ROI 的打开标签页中，点击更多 \ 多测量，然后在弹出窗口中点击确定。
  7. 将标题为结果的弹出窗口中的整个表格复制到 Excel 文件中。
    注意：该表格中每个 ROI 将包含 6 个子标题（Area1、Mean1、Min1、Max1、IntDen1、RawIntDen1），每个子标题后带有数值，对应所追踪的相应细胞。后续分析中关键的数据为每个 ROI 的 Mean 值。
  8. 为监测荧光强度的变化情况，计算每个细胞在基线期的平均荧光强度，并计算变异百分比。实验通常的变异范围在 20% 至 30% 之间。
    变异系数公式，静态方程，用于教育研究。
  9. 将所有读数进行归一化处理，即用每个被追踪细胞的平均强度值除以其基线期的第一个读数。
  10. 新增一列时间（单位为秒），第一帧对应时间为 0，后续时间点以 5 秒递增，对应 0.2 fps 的时间间隔。
  11. 将数据复制到数据分析与绘图软件中，生成荧光强度相对于基线随时间变化的曲线图。
    注意：若要生成单细胞最大值图谱，可在 Excel 中使用 =MAX() 函数确定每个细胞达到最大荧光强度的帧数，并使用 GraphPad Prism 进行作图。

8. 使用钙成像分析套件进行分析

  1. 使用 Fiji 打开视频文件，并按照步骤 8.1 和 8.2 进行操作。
  2. 当核染色通道和绿色通道的显示效果已优化后，点击 图像 \ 复制 来复制视频中的单帧图像。在弹出的窗口中，取消选中 复制超堆栈，并在同一窗口的 通道 选项中输入 1。将其保存为 PNG 图像文件。
  3. 重复步骤 9.2，但在 通道 选项中输入 2。
    按照步骤 8.3 合并这两幅图像，然后将合并后的图像上传至 Cell-Pose 图形用户界面（GUI），以生成细胞掩膜。
  4. 将图像上传至 Cell-Pose 图形用户界面（GUI），选择 Cyto3 模型，利用核染色信号（通道 1）和胞质染色信号（通道 2）进行细胞分割。
  5. 将图像保存为 PNG 文件，然后在 Fiji 中打开该 PNG 文件，并将其转换为 TIFF 文件。
    注意：Cell-Pose GUI 生成的是黑白 PNG 文件。
  6. 通过拖放方式在 Calcium Suite 中同时打开掩膜文件和视频文件，然后点击 分析数据，以生成可下载的图表以及包含软件所识别所有细胞的归一化和原始强度值的可下载 .csv 文件。

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结果

为了测量活细胞中的钙离子动员，将 Calu-3 细胞或已分化的原代鼻黏膜培养物与一种细胞内染料共同孵育。通过检测依赖钙离子的信号相对变化，反映钙离子从细胞内钙库或细胞外空间向胞质溶胶的动员增加情况。加入毒胡萝卜素（thapsigargin）后荧光信号持续升高，表明胞质溶胶中钙离子水平持续上升；毒胡萝卜素是一种明确的内质网定位 SERCA（肌浆/内质网钙离子 ATP 酶）蛋白的不可逆抑制剂21。此处结果表明，钙离子检测方法在 Calu-3 稳定细胞系和原代气道鼻黏膜培养物中均表现出良好的性能。

利用基于显微镜的检测方法可专注于单个细胞的反应。细胞根据胞质内荧光钙染料进行手动追踪，并通过Hoechst活细胞核染色的存在加以确认（图1A，补充图1）。使用Fluo-4 AM或Cal-520 AM对单个细胞的荧光强度进行归一化处理，并以初始基线荧光强度为基准绘制随时间变化的曲线，结果显示钙反应存在动力学差异（图...

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讨论

本文介绍了在活体原代鼻腔和支气管培养物以及稳定的上皮细胞系中分析单细胞钙信号的方法。Cal-520 AM 和 Fluo-4 AM 两种钙离子探针在这两种实验体系中均表现出良好的指示效果。其中，Cal-520 AM 灵敏度更高，其量子产率为 0.75，高于 Fluo-4 AM 的 0.16，且对钙离子的亲和力略强（Cal-520 AM 的 Kd 为 320 nM，Fluo-4 AM 的 Kd 为 345 nM）。此外，据报道，Cal-520 AM 的细胞内滞留能力优于 Fluo-4 AM22。然而，在本研究中，两种染料在毒胡萝卜素介导的钙离子释放实验中均表现出良好的性能22,23。

该生物模型的独特之处在于其采用源自人体组织的原代上皮细胞进行培养。当前的培养方法中的分化过程可形成由多种不同细胞类型组成的多层组织。本文介绍检测活体钙信号的方法 体外 呈现了相关结果。由于未进行酶解离或打开紧密连接，组织得以...

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

作者感谢Tarini Gunawardena在原代鼻组织培养方面提供的帮助，以及爱荷华大学的Wu Shu慷慨地进行原代支气管组织培养并提供运输支持。同时感谢Gabrielle Langeveld和Dian Liu在数据分析及成像适配器设计方面给予的帮助。我们还要感谢病童医院（Hospital for Sick Children）成像中心的支持。本研究得到了加拿大囊性纤维化基金会和美国囊性纤维化基金会的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
24孔板 Thermofisher 142475
24孔Transwell小室 Corning CLS3470-48EA
96孔平底透明底部黑色聚苯乙烯TC处理微孔板Corning 3603
Cal-520 AMAAT Bioquest 21130分装后于-20°C保存，溶于DMSO
Calcium Suite软件可通过联系我们的实验室团队申请代码
EMEM，1×Wisent 320-005-CL4°C 保存
胎牛血清 Wisent 080-450分装后于-20°C保存
Fluo-4 AM AAT Bioquest 20550分装后于-20°C保存，溶于DMSO
HEPESBioshopHEP001.5室温保存
Hoechst Thermofisher H35704°C 保存
人结肠直肠腺癌上皮细胞系 ATCCHTB-55
氯化镁 Sigma 7786-30-3室温保存
35 mm微皿，低玻璃底Ibidi 80137室温保存 
青霉素-链霉素溶液Wisent 450-200-EL4°C保存
磷酸盐缓冲液（PBS）Wisent 3111-010-CL室温保存 
氯化钾 Sigma 7447-40-7室温保存 
丙磺舒 ThermofisherP36400分装后于-20°C保存，水溶性 
氯化钠 Bioshop SOD004室温保存 
毒胡萝卜素 ThermofisherT7458分装后于-20°C保存，溶于DMSO 
TripLE Express酶（1×），含酚红 Thermofisher126050104°C保存

参考文献

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