本方案展示了通过颞静脉注射将儿童肿瘤细胞经静脉递送至新生小鼠，从而实现对生命早期抗肿瘤免疫反应的精确且可重复的建模。该方法可用于评估在新生儿期施加干预措施（如免疫调节或治疗）所产生的影响。
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摘要
摘要
超过一半的儿童癌症在胎儿期即已启动，其向明显疾病的进展持续至新生儿期。尽管免疫疗法目前为许多患癌儿童提供了新的治疗选择，但生命早期的免疫系统如何影响癌症进展及治疗反应仍不完全清楚。要弥补这一空白，就需要在新生儿期评估治疗干预措施，因为此阶段的免疫反应与儿童后期及成年期存在根本性差异。
在此，我们描述了一种结合活体生物发光成像的新生儿移植模型，用于研究生命早期免疫调节对机体的影响 儿童癌症
通过向1至2日龄同基因型受体小鼠注射源自两种宫内起始肿瘤的荧光素酶标记细胞，实现了可重复的肿瘤移植，手术相关死亡率为零，且生物发光成像证实操作成功率高。以感染驱动的免疫调节作为实验变量，我们进一步证明：移植后第五天经腹腔感染小鼠巨细胞病毒可显著减轻急性淋巴细胞白血病（ALL）的肿瘤负荷，但对神经母细胞瘤（NB）无此效应。该平台可用于研究 早期生命阶段免疫调节下不同肿瘤特异性反应的差异，并强调在建模早期生命中免疫–肿瘤相互作用时需考虑肿瘤所处的特定微环境。
总体而言，该方法为研究与癌症免疫监视、感染诱导的免疫调节以及治疗干预相关的新生儿免疫机制提供了一个多功能且高度可重复的平台。除了急性淋巴细胞白血病（ALL）和神经母细胞瘤（NB）之外，该方法还可适用于其他儿童恶性肿瘤及免疫调节策略，支持针对生命早期癌症干预措施的机制研究和临床前评估。
引言
免疫治疗的最新进展显著改善了某些癌症患者的预后，然而其在幼儿中的最佳应用需要深入理解发育中的免疫系统如何识别并清除癌细胞。尽管约50%的儿童癌症起源于宫内，包括B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）和神经母细胞瘤（NB），但越来越多的证据表明，出生后的事件对疾病进展和临床结局具有关键影响1,2。
新生儿的免疫反应在数量和质量上均不同于成人3在适应性免疫系统尚未完全发育的情况下，新生儿的保护依赖于 主要依赖母源抗体和先天免疫细胞。然而，由于细胞内在的低反应性以及免疫抑制通路的增强激活，这些先天免疫效应细胞的功能效率低于成体中的对应细胞，导致新生儿特别容易受到感染4,5,6然而，这些特征对不成熟免疫系统产生有效抗肿瘤反应能力的影响仍知之甚少。
在生命早期建立抗肿瘤免疫模型，需要在出生后免疫功能受限的短暂窗口期内，精确且可重复地递送肿瘤细胞、免疫调节剂或病原体。颞静脉注射是一种新生儿静脉（IV）给药方法，最能满足这些要求，具有操作成功率高、死亡率低、操作应激小，并可与后续干预措施（如感染攻击或治疗给药）相兼容等优势7,8,9,10。
在本研究中，我们在既往已验证的新生小鼠静脉给药技术基础上进行了改进，并结合活体生物发光成像技术的灵活性，建立了一种移植模型，用于研究生命早期感染对儿童癌症细胞进展的影响。该方法可将表达荧光素酶的B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）或神经母细胞瘤（NB）细胞通过静脉注射至出生后1–2天的幼鼠体内，随后在出生后第7天（P7）通过腹腔注射（i.p.）小鼠巨细胞病毒（mCMV）进行免疫调节，并在感染后第10天（P17）评估肿瘤的进展情况。
尽管对颞静脉的穿刺仅限于出生后一个短暂的时间窗口（P0–P3），但该方法可提高实验的可重复性和控制性，为研究生命早期免疫机制对肿瘤免疫监视、感染与肿瘤相互作用以及免疫治疗反应的影响提供了一个多功能平台。此外，该方法有助于移植细胞高效归巢，从而可重复地建立疾病模型，用于机制性研究。
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方案
所有实验步骤（图1）均依照加拿大动物护理委员会（Canadian Council on Animal Care）的指导原则进行，并已获得不列颠哥伦比亚大学动物护理委员会（University of British Columbia Animal Care Committee）批准（方案编号 A23-0169）。
1. 萤光素酶标记的白血病细胞的制备
- 从小鼠Eµ-Ret白血病模型中分离白血病细胞
- 在1 L的诱导室中使用5%异氟烷和1 L·min⁻¹的氧气对小鼠进行麻醉-1 氧气，直至达到深部手术麻醉平面（翻正反射消失且呼吸缓慢、规律）。
- 确认深度麻醉后，停止异氟烷，以高流速（标准逐步置换速率的3–4倍；例如6-8）通入二氧化碳（CO₂） L·min（适用于10 L密闭室），无需将动物在密闭室之间转移。呼吸停止后，继续维持CO₂暴露至少5分钟，以确保动物死亡。
- 在打开腔室前，先排出并清除废气。
- 通过心跳和呼吸消失确认死亡后，按照机构规定，采用颈椎脱位作为次要的物理处死方法。
- 将尸体转移至生物安全柜中，再次确认死亡，记录性别和体重，并用70%乙醇喷洒体表。
- 沿腹部中线做切口，分离皮肤和腹膜壁，将脾脏切除并置于5 mL无菌PBS中。
- 从两条腿中解剖出胫骨和股骨，去除多余组织，并在无菌条件下切除脾脏。立即将脾脏转移至5 mL无菌的冰冷磷酸盐缓冲液（PBS）中，以保持细胞活性。
- 处理脾脏。
- 将脾组织在 1 mL 1× 红细胞（RBC）裂解缓冲液中匀浆（脾脏组织较大时使用 2 mL） > 200 mg）。室温孵育2–3分钟。
- 通过加入10 mL PBS + 2% 胎牛血清（FBS）（FACS缓冲液）淬灭裂解，经40 µm滤网过滤，然后在350 × g 4 °C 下离心 5 分钟。
- 将脾脏沉淀重悬于5 mL FACS缓冲液中。
- 处理骨髓。
- 用1 mL注射器（装有29号针头）吸取1 mL FACS缓冲液，切除两端骨骺，并将每根骨冲洗一次，冲洗液收集至15 mL离心管中。
- 离心细胞悬液，弃上清，将细胞重悬于1 mL 1× RBC裂解缓冲液中，在室温孵育2分钟，加入10 mL FACS缓冲液终止裂解，经40 µm滤网过滤，然后在350 × g条件下离心 g 4 °C下离心5分钟。
- 弃去上清液，用移液器反复吹打，将骨髓沉淀重悬于1 mL FACS缓冲液中。
- 轻轻涡旋，必要时通过40 µm滤网过滤。
- 将0.5 × 10^6个白血病细胞重悬于200 µL细胞培养基（例如Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM））中，培养基中添加20%胎牛血清（FBS）和白细胞介素-7（IL-7；250 pg·mL⁻¹）-1).
暂停点：染色前可将细胞悬液置于冰上最多2小时。
- 慢病毒转导白血病细胞：
- 在转导前24小时，将小鼠骨髓来源的基质细胞以每孔1 × 10^5个细胞的密度接种于24孔板中，以使细胞贴壁并达到70–80%融合度。
- 将白血病细胞（0.5 × 10^6 个细胞，终体积 200 µL）接种于未经组织培养处理的 24 孔板中。
- 加入一种编码双融合报告基因的自失活型（SIN）慢病毒载体，该报告基因由甲虫红色荧光素酶（CBR）与增强型绿色荧光蛋白（eGFP）组成，由组成型泛素启动子驱动；感染复数（MOI）为10–20，病毒滴度≥ 1 × 10^8 TU·mL⁻¹-1 （每毫升转导单位）在终体积为 200 µL 的转导体系中，同时加入聚凝胺（8 µg·mL⁻¹）-1；Sigma，H9268-5G）
注意：Polybrene 在高浓度下具有细胞毒性，不得超过 8 µg·mL⁻¹。-1在生物安全二级（BSL-2）条件下操作慢病毒。 - 用封口膜密封培养板，并在1,200 × g 室温（RT）孵育20分钟。
- 转导的白血病细胞经离心感染后，转移至基质细胞单层上，于37 °C、5% CO₂条件下，在DMEM + 20% FBS + IL-7（250 pg·mL⁻¹）中培养24小时。-1以支持细胞存活和报告基因表达。
注意：如有需要，可在24小时后添加抗生素，但在病毒转导期间应避免使用。 - 24 h后，收集非贴壁的白血病细胞，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次，350 × g 4 °C 下孵育 20 分钟, 以去除残留病毒和polybrene。
- 用无菌 PBS 重悬细胞，浓度为 1 × 10^7 个细胞·mL⁻¹-1 用于移植。
暂停点：如有需要，细胞在洗涤后可在相同的培养条件下维持最多48小时再进行移植。
- 移植到成年 NSG（NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) 小鼠
- 使用4–6周龄的NSG小鼠作为受体。
- 使用加热垫或加热灯将小鼠保温5分钟，以扩张尾静脉。
- 使用丙烯酸固定装置固定小鼠。
- 使用29号胰岛素注射器，通过侧尾静脉将1 × 10^6个细胞悬浮于100 µL无菌PBS中注射。无需麻醉（除非机构指南另有要求）
- 对注射部位施加轻柔压力以防止出血。
警告：避免外渗。成功的静脉注射不会出现可见的肿胀。 - 每周对小鼠进行两次疾病发展情况监测。
- 分选GFP+ 白血病细胞
- 疾病发作后，从白血病 NSG 小鼠中收获骨髓或脾脏。
- 按照上述方法制备单细胞悬液。
- 用活力染料（7-AAD）对细胞进行染色。
- 使用荧光激活细胞分选（FACS）对GFP+白血病细胞进行分选。
- 使用高速流式细胞分选仪进行分选，并按照以下设门策略：前向散射光（FSC）对侧向散射光（SSC）→ 排除碎片；FSC-A 对 FSC-H → 选择单细胞；活率染料阴性 → 选择活细胞；GFP+ 门 → 分离报告基因阳性的白血病细胞。
- 将分选后的细胞收集到含有DMEM + 20% FBS的离心管中。分选后目标纯度：≥95% GFP+细胞。
暂停点: 分选后的细胞在冷冻保存前可在冰上保存最多2小时。
- 分选细胞的冷冻保存
- 将分选后的细胞重悬于冻存液中，细胞密度为 5 × 10^6 个细胞/mL，冻存液含 90% FBS 和 10% 二甲基亚砜（DMSO）。
- 每支冻存管分装1 mL，置于基于异丙醇的冷冻容器中，于−80 °C过夜（12–18 h）保存。
- 将小瓶转移至液氮（LN₂）中进行长期保存。
注意：DMSO 具有毒性，且可通过皮肤快速吸收。操作时需佩戴手套，并迅速完成。
暂停点：细胞可长期保存于液氮中，直至用于新生个体移植实验。
2. 生成荧光素酶标记的NB细胞
注意：TH-MYCN 转基因小鼠可自发产生神经母细胞瘤，饲养和实验均按照批准的机构动物护理规程进行。所用慢病毒载体与第 1.2 节中描述的相同。
- 肿瘤收获与组织解离
- 根据批准的动物护理指南，对荷瘤的TH-MYCN小鼠实施安乐死。
- 在无菌条件下收获皮下或腹部的神经母细胞瘤组织。
- 称取肿瘤组织，用无菌剪刀将其剪成约1–2 mm的碎片。
- 将组织转移至含有约5 mL消化缓冲液的15 mL锥形管中，每0.5 g肿瘤组织使用该体积，缓冲液成分为DMEM、脱氧核糖核酸酶I（DNase I；50–100 U·mL⁻¹）-1）以及基于胶原酶的酶混合物（10 µg·mL⁻¹）-1 终浓度
- 在37 °C、150 rpm的摇床培养箱中孵育30分钟。
注意：酶消化试剂可能引起皮肤和眼睛刺激。请佩戴手套和眼部防护装备。 - 消化后，轻轻吹打混匀以进一步解离组织。将悬液经70 µm细胞滤网过滤至新离心管中。
- 300 × g 离心 g 在室温（20–22 °C）下孵育5分钟。
- 弃去上清液，将沉淀重悬于添加了10% FBS的DMEM中。
- 使用RBS裂解缓冲液进行红细胞裂解，操作步骤如第1.1节所述。
- 300 × g 离心 g 5分钟后离心，将沉淀重悬于10 mL高糖DMEM培养基中，该培养基添加有10%胎牛血清和50 µM 2-巯基乙醇。
注意：2-巯基乙醇具有毒性和挥发性，操作时应在化学通风橱中进行。
暂停点：细胞在转导前可在冰上保存最多1小时。
- 慢病毒转导
- 将2 × 10^6个NB细胞在300 × g离心5分钟，完全去除上清液。
- 将细胞沉淀直接重悬于14 µL浓缩的慢病毒载体中（同1.2节所述载体；病毒滴度≥ 1 × 10^8 TU·mL-1，MOI约为10–20）。
- 在37 °C、湿润的培养箱（% CO₂）中孵育细胞-病毒混合物5分钟。
- 加入200 µL高糖DMEM + 10% FBS，于37 °C、5% CO₂条件下继续孵育2小时。
注意：慢病毒载体必须在生物安全二级（BSL 2）条件下操作。 - 用高糖DMEM洗涤转导细胞四次，以去除残留病毒。
- 使用台盼蓝排斥法计数活细胞。
重要提示：基质制备过程中必须始终置于冰上，以防止提前凝胶化。
- 皮下植入NSG小鼠
- 以每 100 µL 冷的基底膜基质（生长因子减少型细胞外基质）重悬细胞，细胞密度为 5 × 10^6 个细胞。
- 使用吸入式异氟烷（氧气中浓度为2–3%）对6–8周龄的NSG小鼠（见第1.1节）进行麻醉。
- 将细胞-基质混合物装入预冷的1 mL注射器中，注射器需配备27号针头。
- 皮下注射5 × 10^6个细胞，总体积为100 µL，注射部位为 flank 区域。
- 监测小鼠直至从麻醉中完全恢复。
注意：混合基质后应立即注射，以防止凝固在注射器内部。 - 让肿瘤生长至直径约1 cm。
- 细胞分选
- 收获肿瘤并按照第2.1–2.2节所述方法制备单细胞悬液。
- 根据第1.4节所述的门控策略，通过FACS基于GFP表达富集荧光素酶标记的细胞。
- 进行两轮连续分选，以获得 ≥ 95% 的GFP阳性纯度。
- 冷冻保存
- 按照第1.5节所述方法冻存分选后的细胞。
暂停点：细胞可长期保存于液氮中，用于未来的移植实验。
- 按照第1.5节所述方法冻存分选后的细胞。
3. 准备用于时间静脉注射的细胞悬液
- 在37 °C水浴中快速解冻表达荧光素酶的白血病细胞或神经母细胞瘤细胞，直至仅剩微小冰晶。
- 立即用70%乙醇对冻存管外壁进行消毒，然后将内容物转移至含有9 mL预热的DMEM + 10% FBS培养基的15 mL锥形离心管中。
- 在4 °C下以300 × g离心5分钟，吸除上清液，并将沉淀重悬于无菌的冰上预冷PBS中。
- 采用台盼蓝染色排斥法结合血细胞计数板（或自动细胞计数仪）测定细胞活力。仅使用细胞活力≥80%的悬液。
- 将细胞悬液通过40 µm细胞滤网，以去除细胞团块。
注意：细胞团块会增加注射失败和组织损伤的风险。 - 调整细胞浓度，使每只新生小鼠注射20 µL悬液，其中含1 × 10^4个白血病细胞（用于白血病移植）或5 × 10^4个神经母细胞瘤细胞（用于神经母细胞瘤移植）。
- 将细胞悬液置于冰上保存，并在注射前轻轻混匀，以保持细胞均匀悬浮。
暂停点：若细胞活力仍保持在≥80%，可在冰上保存最多2小时后再进行注射。
4. 颞静脉注射（P1–P2 仔鼠）
注意：新生小鼠颞静脉注射可无需麻醉。然而，通常采用短暂的低温固定以减少动物活动并提高注射准确性。 部分机构动物护理委员会不允许使用低温固定方法——研究人员在实施本操作前必须咨询相关机构委员会。若经机构批准，以下步骤可用于实施低温固定。
- 准备一个内衬无菌纸巾的小容器，并将其置于冰上预冷。
- 将出生后第1–2天（P1–P2）的幼鼠放置于容器内的纸巾上，进行低温固定2–3分钟，直至其自发活动明显减少。
重要提示：切勿让幼鼠直接接触冰面（始终使用容器和纸巾作为隔离屏障）。 - 将60 µL细胞悬液吸入100 µL玻璃注射器中，并安装30号针头。将悬液重新排出至原管中，以填充注射器和针头的死体积。完成死体积预填充后，回吸20 µL细胞悬液用于注射，确保其中无气泡。分别使用BALB/c小鼠和TH-MYCN小鼠作为白血病细胞和神经母细胞瘤细胞的受体。
- 通过在亚克力板平台下方放置冷光源，构建透射照明操作台。
- 佩戴放大眼镜（或使用体视显微镜）以观察注射部位。
- 在操作台上放置一张中央有孔的无菌纸巾，并将幼鼠置于其上，使颞静脉清晰可见。
- 在幼鼠头部旁放置一小块橡皮泥（彩泥），以帮助在注射过程中稳定针头。
- 将针头斜面向上刺入可见的颞静脉，缓慢注入细胞悬液，观察血管充盈情况以确认静脉内注射成功。
- 注射后，使用无菌棉签对注射部位施加轻柔压力。将幼鼠置于温暖的恢复表面（约37 °C，例如低档加热垫并加毛巾隔离），直至其恢复正常活动和粉红色外观。
- 恢复后继续监测幼鼠5–10分钟，然后将其放回母鼠身边。
注意：恢复期间避免过热。应使用隔离层并持续监测。 - 立即用PBS冲洗注射器，随后用注射器清洗液冲洗，最后用70%乙醇冲洗。
5. 病毒制备与感染
- 所有涉及小鼠巨细胞病毒（mCMV）的操作均须在BSL-2级生物安全条件下进行，并遵守机构的生物安全和动物护理批准要求。
- 病毒储备液的操作应在经认证的II级生物安全柜中进行，动物感染操作应在指定的BSL-2级操作区域中进行。
- 病毒的制备与操作应在经认证的II级生物安全柜中进行，动物感染操作应在指定的BSL-2级操作区域中进行。
- 穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括实验服或一次性防护服、手套和眼部防护装置。所有含病毒的材料（注射器、垫料、笼具和表面）均应视为具有潜在传染性。
- 尽量减少锐器的使用，并将针头立即丢弃至经批准的生物危害锐器容器中。使用后应对工作台面和设备进行去污染处理。所有固体和液体废弃物应按照机构规程作为生物危害废物处置。
- 在出生后第7天（P7，白血病细胞移植后5–6天）对小鼠进行感染。
- 将病毒分装液置于冰上解冻，轻轻颠倒混匀，并在制备过程中保持在冰上。避免反复冻融（建议使用一次性分装液）。
- 将mCMV用PBS配制成2 × 10^5 空斑形成单位（PFU）/mL ，使用30号针头向幼鼠腹腔内（i.p.）注射50 µL PBS中含有1 × 10^4 PFU的病毒液。注射部位为腹部右下象限，进针角度应浅，以避免损伤腹腔器官。
警告：mCMV具有传染性（BSL-2级），须采取适当的 containment 和去污染措施。 - 记录动物编号、年龄、实验分组、病毒剂量、注射体积及注射详情。
6. 生物发光成像（BLI）
注意：按照下述方法，在P7（细胞注射后5–6天，感染前）和P17（感染后10天）进行BLI检测。
- 将D-荧光素溶于PBS中，配制成10 µg·µL-1的溶液。使用0.22 µm滤器过滤除菌，分装后避光保存于−20 °C。
注意：D-荧光素对光敏感。在配制和使用过程中应尽量减少光照。 - 使用30号针头，按每只幼鼠50 µL剂量腹腔注射D-荧光素。
- 用异氟烷（诱导浓度3–4%，维持浓度1.5–2%）在氧气（0.8–1.0 L·min-1）中对幼鼠进行麻醉。将幼鼠置于加热的成像平台（约37 °C）以维持体温。
注意：异氟烷为挥发性麻醉剂。应使用经批准的挥发器及废气清除系统。 - 将麻醉后的幼鼠放入小动物成像系统（仪器详细信息见材料表）。
- 在注射D-荧光素后10分钟，采用一致的曝光参数采集生物发光和X射线图像（生物发光成像参数：P7图像曝光时间为120 s，P17为30 s；P7和P17图像均采用B4 binning模式，视野（FOV）25，光圈f-stop 1.2，物体高度1.5；X射线参数：分辨率设为高，功率设为高）。
暂停点：成像后应立即存储图像文件；后续分析可稍后进行。 - 使用适当的生物发光成像软件，划定涵盖每只小鼠全身的感兴趣区域（ROI），并以光子数·s⁻1·cm⁻2·sr⁻1为单位对发射光进行定量分析。
- 导出定量的ROI数值，用于后续统计分析。
7. 从移植细胞的小鼠中收获白血病细胞
- 按照第1.1节所述方法收获白血病细胞并制备单细胞悬液。
8. 流式细胞术染色与采集
- 计数细胞，并在 4 °C 条件下以 300 × g 离心 5 分钟，然后用 FACS 缓冲液重悬至 1 × 10^7 个细胞·mL-1。
- 将 100 µL（1 × 10^6 个细胞）转移至聚苯乙烯流式细胞术管中。
- 加入 Fc 受体阻断抗体（抗 CD16/32；每管 1 µL），室温孵育 5 分钟。
- 在 FACS 缓冲液中配制抗体主混合液，并向每管中加入 CD19-FITC、BP1-PE、B220-APC 和谱系阴性标记物（TER119-PerCP、CD3-PerCP、CD11b-PerCP），每种抗体每 1 × 10^6 个细胞加 1 µL，总体积为 100 µL FACS 缓冲液。
- 室温避光孵育 20 分钟。
- 用 5 mL FACS 缓冲液洗涤，离心后重悬于含 7-AAD（3 µL）和计数微球（6 µL；6,000 个微球）的 200 µL FACS 缓冲液中。
- 使用抗体捕获微球或细胞制备单染补偿对照，并与实验样本同时上机检测。
- 在流式细胞仪上使用标准的 FITC/PE/APC/PerCP 检测器设置和中等流速采集数据，持续收集事件直至获得 1,000 个微球信号。
- 导出 FCS 文件，并使用流式细胞术分析软件（见材料表）按照既定的设门策略（图 2D）进行分析。
- 利用计数微球计算每脾脏或每骨髓中的绝对细胞数量：将获得 1,000 个微球时的目标事件数乘以校正系数 6（共加入 6,000 个微球），并根据染色细胞比例（1 × 10^6 个细胞）归一化至整个器官的细胞总数。
9. 绘制图形与统计分析
注意：使用统计软件包（见材料表）对生物发光成像（BLI）和流式细胞术数据进行图形生成和统计分析。
- 以均值 ± 均值标准误（SEM）表示数据。
注意：本研究未排除任何动物。 - 对于生物发光成像（BLI），在 P7 和 P17 时间点分别使用非配对的 Mann–Whitney 检验比较 PBS 组与 mCMV 组，并采用 Holm–Šídák 法对多个时间点的多重比较进行校正。
- 采用双尾非配对 Mann–Whitney 检验分析流式细胞术结果。
- 统计学显著性定义为 p < 0.05。
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结果
经颞静脉注射可实现白血病和神经母细胞瘤细胞在新生小鼠中的高效植入
为了模拟生命早期感染对儿童癌症进展的影响，将来源于白血病成年 Eµ-Ret 小鼠的荧光素酶标记B-ALL细胞，或来源于濒死 Th-Mycn 小鼠的NB细胞，通过颞静脉注射至1–2日龄同基因型幼鼠体内。移植后第五天，通过生物发光成像（BLI）和X射线成像确认了白血病（图2A，n = 7）和神经母细胞瘤（图3A，n = 9）的成功植入，结果表明颞静脉注射的操作成功率达到100%，且无任何与操作相关的死亡。
新生儿mCMV感染抑制白血病进展
移植成功确认后，新生幼鼠在出生后7天通过腹腔注射随机分为两组，分别接受PBS（n = 3）或mCMV（每只幼鼠1 × 10^4 PFU，n = 4）。感染后10天，mCMV感染幼鼠表现出显著的体重下降（p < 0.05），并出现明显的神经系统功能障碍。通过qPCR检测脑组织中的病毒载量...
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讨论
了解生命早期免疫系统发育如何影响癌症进展，对于设计适合年龄的免疫调节策略至关重要。在本研究中，我们描述了一种可重复的新生期移植平台，可在出生后免疫系统不成熟的關鍵时期，精确控制癌细胞植入和免疫调节的时间进程。通过将时间特异性静脉介导的静脉内递送与生物发光成像（BLI）相结合，该模型能够系统地探究生命早期感染如何在不同疾病背景下影响儿童癌症的进展。
通过该方法，我们证明了新生小鼠巨细胞病毒（mCMV）感染在新生期静脉移植后显著抑制白血病进展，而在相同实验条件下，神经母细胞瘤（NB）的进展则未受影响。这两种截然不同的结果凸显了生命早期感染驱动的免疫调节具有情境依赖性，并强调在建模儿童癌症与免疫相互作用时，需重视疾病特异性的生物学特性。
新生小鼠巨细胞病毒（mCMV）感染后观察到的白血病负荷降低，与我们之前的研究结果一致11。我们已证实，新生儿期病毒感染可广泛激活先天免疫通路，包括诱导前白血病细胞发生凋亡的干扰素γ（IFN-γ）反应。相比之下，神经母细胞瘤（NB）是一种起源于神经嵴来源...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了加拿大卫生研究院向 G.S.D.R. 提供的运营资助（项目号：MOP-126122）。A.F. 获得了迈克尔·库乔内儿童癌症研究计划（MC3RP）博士后奖学金的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100µL，微升注射器，鲁尔接头尖端 | Hamilton | 80601 | - |
| 30 G 针头 | BD | 305106 | - |
| 7-AAD | Biolegend | 420404 | - |
| Ami-X 成像系统 | Spectral Instruments Imaging | - | - |
| 抗小鼠 B220-APC | Biolegend | 103212 | - |
| 抗小鼠 CD19-FITC | Biolegend | 152404 | - |
| 抗小鼠 CD3εPerCP | Biolegend | 100326 | - |
| 抗小鼠 Ly-51-PE | Biolegend | 108308 | 也称为 BP1 |
| 抗小鼠 TER119-PerCP | Biolegend | 116226 | - |
| 抗小鼠/人 CD11b-PerCP | Biolegend | 101230 | - |
| Aura 软件 | Spectral Instruments Imaging | - | 版本 4.0.8 |
| BD Accuri C6 | BD | - | - |
| BD Fortessa X-20 | BD | - | - |
| 清洗液 | Hamilton | 18310 | - |
| CountBright 绝对计数微球 | 赛默飞世尔科技旗下 Invitrogen 公司 | 2770930 | 6 µL 含有 6000 个珠子 |
| D-荧光素 | GoldBio | eLUCK-1G | - |
| DMEM | Gibco | 11965092 | - |
| DNase I | Sigma | 1.13×10¹⁰ | - |
| Falcon 40µm 细胞滤筛，蓝色，无菌，独立包装 | 猎鹰 | 352340 | - |
| FBS | Gibco | A5256701 | - |
| FlowJo 软件 | BD | - | v10.8 |
| GeltrexTM | 赛默飞世尔科技 | A1413202 | - |
| GraphPad Prism 软件 | Dotmatics | - | v10.4.1 |
| LE.5209 冷光源 | Euromex | - | - |
| Liberase™ TM 研究级 | Sigma | 5.4E+09 | - |
| NSG小鼠 | 杰克逊实验室 | 5557 | NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ |
| Polybrene | Sigma | H9268-5G | - |
| 纯化的抗小鼠 CD16/32 抗体 | Biolegend | 101301 | - |
| RBC裂解缓冲液（10X） | Biolegend | 420301 | - |
参考文献
- Valent, P., et al. Cancer stem cell definitions and terminology: the devil is in the details. Nat Rev Cancer. 12 (11), 767-775 (2012).
- Hwee, J., et al. A systematic review and meta-analysis of the association between childhood infections and the risk of childhood acute lymphoblastic leukaemia. Br J Cancer. 118 (1), 127(2018).
- Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the Newborn and Young Infant from Infectious Diseases: Lessons from Immune Ontogeny. Immunity. 46 (3), 350-363 (2017).
- Tsafaras, G. P., Ntontsi, P., Xanthou, G. Advantages and Limitations of the Neonatal Immune System. Front Pediatr. 8, 5(2020).
- Basha, S., Surendran, N., Pichichero, M. Immune Responses in Neonates. Expert Rev Clin Immunol. 10 (9), 1171-1184 (2014).
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- Wasala, L. P., Hakim, C. H., Yue, Y., Yang, N. N., Duan, D. Systemic Delivery of Adeno-Associated Viral Vectors in Mice and Dogs. Methods Mol Biol. 1937, 281-294 (2019).
- Glascock, J. J., et al. Delivery of Therapeutic Agents Through Intracerebroventricular (ICV) and Intravenous (IV) Injection in Mice. J Vis Exp. (56), e2968(2011).
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- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Anim. 40 (5), 155-160 (2011).
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