通过建立采用神经移植或神经移位修复的根性左上干臂丛损伤大鼠模型，我们发现两组均获得了相似的肌力；而移植组动物表现出更优的运动协调性。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
研究文章
* These authors contributed equally
通过建立采用神经移植或神经移位修复的根性左上干臂丛损伤大鼠模型，我们发现两组均获得了相似的肌力；而移植组动物表现出更优的运动协调性。
臂丛上干（C5-C6）损伤会导致肩关节外展和肘关节屈曲功能受损。对于近端残端保留的C5-C6神经断裂伤，神经移植（NG）仍是传统治疗方式。而在C5-C6神经根撕脱伤中，神经移位术（NT）是唯一可行的选择。目前国际公认的NT标准方案为三联移位术：副神经（SAN）移位至肩胛上神经（SSN）、Oberlin手术以及Leechavengvongs手术。近年来临床趋势显示，NT的适应证已扩展至神经根断裂的情况，其理论依据在于远端神经移位可显著缩短轴突再生距离。为实现直接比较，本研究建立了两种模拟上述临床策略的大鼠模型：1）神经移植模型，将C5-C6残端分别移植至肩胛上神经和上干；2）多组神经移位模型，包含上述三种移位手术。术后8周和16周评估功能恢复情况（Ochiai评分、Barth足错步测试和Terzis理毛实验）、电生理参数及再生的感觉神经轴突数量。术后8周时，两组间功能恢复结果无统计学差异。至16周时，尽管Ochiai评分与Terzis测试结果仍相当，但NG组在Barth测试中表现显著优于NT组。电生理方面，NT组在术后8周时肌皮神经、腋神经和肩胛上神经的恢复率均显著更优；然而至16周时，这些电生理优势已不再具有统计学意义。术后8周时，NG组在肌皮神经和腋神经中已再生出更多的感觉轴突，而肩胛上神经的轴突数量两组相近；至16周时，NG组在全部三条神经的感觉轴突数量上均超过NT组。本研究在大鼠C5-C6锐性横断模型中的发现表明，在术后16周内，神经移植在功能和电生理恢复方面与神经移位术相当，但在感觉功能及协调性运动功能的恢复上更具优势。然而，仍需更长期随访的研究以明确这些结果的临床转化价值。
臂丛神经损伤通常分为上干损伤（C5–C6，可伴有或不伴有C7受累）、下干损伤（C8–T1）和全干损伤（C5–T1）。作用于头部与肩部的压迫力通常导致上干损伤。由于C5–C7神经根水平的椎间孔上横韧带可部分分散向上传导的创伤力，因此在椎间孔处发生这些神经根（尤其是C5）的撕裂并不罕见1。然而，严重的暴力仍可导致神经根撕脱，并可能累及下干。当上肢在水平面上受到强力牵拉时，以下干神经根撕脱为主；若力量更大，则可能发生全臂丛神经根撕脱。由于C8–T1神经根缺乏椎间孔上横韧带的保护，几乎所有创伤性下干损伤均为神经根撕脱2。因此，就神经根损伤模式而言，C5–C6神经根更易发生断裂，而C7–C8–T1神经根则更倾向于发生撕脱。这些病理解剖学特征对于选择合适的手术策略至关重要。
上干损伤的临床特征为肩关节外展和肘关节屈曲功能丧失。对于C5–C6神经根断裂但近端神经根残端仍具有活性的患者，传统治疗策略为神经移植（NG）：通常采用腓肠神经自体移植，将残存的C5和C6神经根与上干的前、后股以及肩胛上神经相连接3。当C5和C6神经根发生撕脱伤时，神经移位术（NT）成为唯一的重建选择。目前全球多数医疗中心采用的手术方案结合了三种术式：副神经移位至肩胛上神经、尺神经一支束移位至肌皮神经的肌支（Oberlin手术），以及桡神经的肱三头肌长头支移位至腋神经的前支（Leechavengvongs手术）4。
在过去十年中，神经移位术（NT）在臂丛重建中的适应证逐步扩大：一些作者甚至主张对神经根断裂采用移位技术，认为远端移位可显著缩短神经再生距离，从而加快运动功能恢复5,6,7。然而迄今为止，这些报道仅集中于术后肌肉力量的恢复结果；对于决定功能恢复质量的关键变量——灵巧性与协调运动的评估——仍然缺乏。
鉴于残留的神经根残端含有更高比例的感觉神经纤维8，并且在重建后无需进行远距离的皮层功能重组9，我们假设，对于C5–C6节段的节后撕脱伤，采用尚有活性的C5–C6神经根残端作为再生轴突来源的神经移植（NG），其功能恢复的整体质量优于神经移植（NT）。由于大鼠被广泛认为是臂丛损伤与修复研究的理想实验模型10,11,12，我们将分别建立两种成年大鼠C5–C6节后损伤模型，分别采用NG或NT进行重建。通过行为学评估、电生理检测以及再生感觉轴突计数，对两组进行比较，以验证上述假设。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
本方案已获复旦大学实验动物科学部动物福利与伦理委员会批准（批准号：2019 Huashan Hospital JS-008）。
大鼠模型的建立
左侧上干撕脱性损伤
室温维持在 23–25 °C。采用腹腔注射 1% 戊巴比妥钠（0.4 mL/100 g 体重）对 Sprague-Dawley 大鼠进行麻醉。麻醉诱导后，将大鼠仰卧位固定于手术板上，前肢外展 90° 离开躯干。剃除颈部、胸部、腋窝区域的毛发，仅在 NG 组动物中 additionally 剃除双侧后肢的毛发。使用聚维酮碘对皮肤进行消毒。从环状软骨至胸骨柄上缘做一条 3 cm 长的颈部正中切口。在手术显微镜下逐层分离皮下组织和深筋膜，暴露胸骨舌骨肌、胸锁乳突肌、胸大肌和胸小肌。使用无菌自制的回形针牵开器将这四块肌肉向两侧牵拉。牵开器的远端用橡皮筋固定在手术板上，调节张力以获得最佳术野暴露，同时保护颈内静脉。辨认前、中斜角肌，并暴露斜角肌间隙内的臂丛神经锁骨上段（图 1A）。在距 C5 和 C6 椎间孔远端 5 mm 处横断神经根，随后切除一段长约 5 mm 的神经节段，形成明确的缺损间隙（图 1B）。在 NT 组中，将 C5 和 C6 的近端残端缝合固定于邻近软组织，以防止再生的轴突进入远端通路。
NG 模型的建立
在后肢足背外侧沿外踝做 L 形切口，向上延伸至小腿外侧。在手术显微镜下逐层分离皮下组织和深筋膜，注意保护小隐静脉，随后暴露并切取腓肠神经。双侧腓肠神经共获得 8 cm 长度。去除神经周围结缔组织后，将每条神经切成八段，每段长 1 cm。在上干起始处横断肩胛上神经；使用一段移植物连接 C5 与肩胛上神经，三段移植物从 C5、四段移植物从 C6 连接至上干（图 1C）。
NT 模型的建立
沿颈部正中做切口，并向远端上臂方向延伸约 2.5 cm。 在胸外侧皮神经穿出部位，沿胸大肌与肱二头肌之间的肌纤维方向切开胸大肌。钝性分离更深层的胸小肌，以暴露走行于胸大肌下方的臂丛神经束。尺神经起源于内侧束，在神经束段中走行于最内侧位置（图 1D）。肌皮神经起源于外侧束，穿过大圆肌下缘进入上臂，最终进入肱二头肌肌腹，在神经束段中走行于最外侧位置（图 1D）。桡神经起源于后束，穿过背阔肌肌腱下缘进入上臂后侧，并发出三个分支，分别支配肱三头肌的长头、内侧头和外侧头。腋神经亦起源于后束，穿过四边孔后分为前支和后支，支配三角肌。
副神经转移至肩胛上神经
在颈前正中切口内将胸锁乳突肌向内侧牵开，以暴露副神经。该神经自二腹肌下方穿出，到达胸锁乳突肌内侧缘中1/3处，发出支配胸锁乳突肌的分支后，沿该肌后缘下行，斜向颈部外侧，支配斜方肌。为避免神经转移后牵拉影响吻合部位的稳定性，将胸锁乳突肌支切断。在斜方肌支进入肌肉处将其离断。在上干远端起始处切断肩胛上神经。使用一根10-0合成聚丙烯缝线，将副神经的斜方肌支与肩胛上神经进行端端吻合（图1E）。
将尺神经束支转移至肌皮神经的肱二头肌运动支（Oberlin 手术）
将肌皮神经主干向远端游离，直至完全暴露整个肱二头肌运动支。在肱二头肌运动支中段三分之一水平，从尺神经外侧取一段6 mm的神经束支，并将其远端锐性切断。在肱二头肌运动支起始处，将其从肌皮神经主干上完全切断。将游离出的尺神经束支与肱二头肌运动支使用一根10-0合成聚丙烯缝线进行端端吻合。完全暴露肱二头肌运动支具有两个目的：（1）精确定位从尺神经获取束支的合适位置；（2）确保转移后吻合口无张力（图 1F）。
将桡神经长头肱三头肌支转移至腋神经前支（Leechavengvongs 手术）
将大鼠重新置于俯卧位，前肢外展90°于躯干。剃除并消毒左侧上臂背侧毛发。在左上臂背侧做一长度为3.5 cm的纵行切口，自肩关节延伸至肱骨中段水平。在手术显微镜下逐层分离皮下组织及深筋膜。牵开三角肌以暴露其下方的四边孔结构，在此可见腋神经主干及其伴行的旋肱后动静脉由此穿出。向远端游离腋神经，直至其即将进入三角肌肌腹前的整个前、后支完全显露。在同一切口内，于肱三头肌长头与外侧头之间辨认出桡神经主干，并向远端游离，直至支配肱三头肌长头的运动支清晰可见（图1G）。在该运动支进入肌肉处将其切断，并向近端翻转，以接近腋神经前支。在腋神经前支起始处将其从主干上切断，并向远端翻转。将肱三头肌长头支与腋神经前支以单根10-0合成聚丙烯缝线进行端端吻合（图1H）。
完成所有神经重建后，每个手术区域均用无菌生理盐水冲洗，并仔细检查每一处吻合部位以确认其完整性。所有切口均分层关闭：胸大肌使用5-0不可吸收丝线缝合（仅NT组的颈部切口需要），随后缝合皮下筋膜和皮肤。由于所有神经吻合均在无张力条件下完成，术后无需对上肢进行固定。
行为学评估
Ochiai评分13
将大鼠尾部提起，使其身体悬空于桌面以上30 cm处，观察双侧前肢的姿势。随后将大鼠置于桌面上一条狭窄的跑道（50 cm长 × 10 cm宽）中，观察其行走时前肢的步态。整个跑道表面覆盖白纸，起点端用黑色墨水润湿。当大鼠向前行走时，可留下清晰的足印。0分——悬空时，双侧前肢自然放松，垂直向下悬挂（图2A-1）；行走时，无任何前肢拖拽现象（图2A-2）。1分——悬空时，患侧前肢轻度内收和屈曲（图2B-1）；行走时，因肘关节屈曲受限出现轻度拖拽（图2B-2）。2分——悬空时，患侧前肢完全屈曲并内收（图2C-1）；行走时，可见明显严重拖拽（图2C-2）。
Barth足错步测试13
准备一个水平金属网格（50 cm × 38 cm），将其抬高至桌面以上11 cm处；每个网格方格的边长为1.5 cm。将大鼠放置于网格上；当患侧前肢穿过网格孔隙发生滑落时，记录为一次"足错步"（图3）。统计患侧肢体在2分钟内发生的足错步次数。
Terzis理毛实验14
将大鼠置于一个顶部开放的透明观察箱中。向大鼠的鼻部和面部喷洒约1–3 mL的生理盐水，观察其试图清除水滴的行为。
0级——患肢无反应。
1级——患肢在肘部屈曲并可触及口部，但无法触及鼻部（图4A）。
2级——患肢可触及鼻部（图4B）。
3级——患肢可触及鼻部上方，但无法触及眼部（图4C）。
4级——患肢可触及眼部，但无法触及耳部（图4D）。
5级——患肢可触及耳部或耳后区域（图4E）。
复合肌肉动作电位（CMAP）
按照前述实验方案所述，将大鼠麻醉、固定并进行准备，暴露臂丛的锁骨上部分和束段。将黑色记录针电极插入目标肌肉（肱二头肌、三角肌或冈下肌）的肌腹中，红色记录电极插入同一肌肉的肌腱-肌肉连接处，绿色参考电极置于黑色与红色电极之间（图5）。所有电极插入深度均为2 mm，并在双侧使用相同插入位置。用刺激电极轻轻抬起神经进行测试，施加一个强度为0.5 mA、持续时间为0.2 ms的单脉冲方波，记录CMAP的潜伏期和波幅。以对侧（健康侧）作为参照（设定为1），计算潜伏期延迟率（[患侧潜伏期/健侧潜伏期] × 100%）和波幅恢复率（[患侧波幅/健侧波幅] × 100%）。
免疫荧光染色
有髓纤维使用抗神经丝蛋白200（NF200）进行标记；其中，运动有髓纤维通过与抗胆碱乙酰转移酶（ChAT）共标记加以区分。因此，NF200阳性而ChAT阴性的纤维被归类为感觉有髓纤维15。
对于神经移植组，取患侧肢体第二缝合部位远端的肌皮神经、腋神经和肩胛上神经的主干。对于神经转位组，取肌皮神经的肌支、腋神经的前支以及肩胛上神经在其各自吻合部位远端的相应节段。每条神经取3 mm节段，浸入4%多聚甲醛中，在4 °C固定24小时。
将标本垂直于长轴方向定位，包埋于石蜡中，并连续切片至3 µm厚度。脱蜡后，使用微波炉在0.01 M EDTA缓冲液（pH 8.0）中进行抗原修复。切片在4 °C下与以PBS稀释的一抗孵育过夜（ChAT，1:200；NF200，1:500），随后用PBS洗涤，并在避光条件下于室温与二抗孵育50分钟（Cy3标记的山羊抗兔抗体，1:300；Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠抗体，1:400）。细胞核用DAPI复染。使用配备载玻片扫描仪的荧光显微镜对每条神经的完整横截面进行成像。
NF200 以绿色荧光显示，ChAT 以红色荧光显示；NF200 阳性/ChAT 阴性的轮廓被计为感觉有髓纤维。每根神经随机选取五个切片，使用 ImageJ 进行分析。对每个切片整个横截面上的感觉有髓纤维总数进行计数，并取五个切片的平均值作为该神经标本的最终计数值。
统计学分析
使用 G*Power 根据感觉轴突计数预实验的效应量（Cohen's d = 2.31）前瞻性计算样本量（每组 n = 8），以在 α = 0.05 时达到 ≥ 80% 的检验效能。所有统计分析均使用 GraphPad Prism 软件完成。数据以中位数（四分位间距）[M (p25–p75)] 表示。组间比较采用 Mann-Whitney U 检验。当 P 值 < 0.05 时，认为差异具有统计学意义。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
术后第1天，NG组和NT组大鼠术肢的肩关节外展和肘关节屈曲功能均完全丧失；当动物被固定时，刺激其患侧前肢背侧，两组均未出现回缩或发声反应。术后8周时，两组动物肩关节和肘关节功能均有所改善，此时相同的刺激可引发回缩反应。至术后16周，功能进一步恢复，但仍不完全；当刺激前肢背侧时，NT组大鼠出现挣扎和吱叫，而NG组大鼠挣扎更为剧烈，并发出更响亮的尖叫声。
在8周和16周时，NG组与NT组的Ochiai评分无显著差异（均P > 0.05）。在2分钟测试中，8周时足部错误次数相似（P > 0.05）；但在16周时，NG大鼠的错误次数显著少于NT大鼠（P < 0.05）。Terzis梳理行为评分在两个时间点均无统计学差异（均P > 0.05，表1）。
在8周时，神经移植组（NT）的肌皮神经（肱二头肌支）、腋神经（前支）和肩胛上神经的潜伏期延迟和波幅恢复率均显著优于神经导管组（NG）（均P < 0.05）。然而到16周时，这些电生理差异已消失（均P > 0.05，
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
本研究的目的是验证我们的假设：与神经移位相比，采用残余神经根移植重建臂丛神经损伤的整体效果更优。将C5–C6神经断裂的成年大鼠分为两组：一组通过神经移植进行上干重建，另一组则通过副神经、桡神经的肱三头肌长头分支以及尺神经的一个束支进行神经移位。电生理学结果显示，神经移植组并未优于神经移位组；事实上，由于再生的轴突在神经移植过程中需跨越额外的吻合部位，移植组的早期恢复落后于移位组。然而，术后16周时，神经移植组大鼠在Barth足错步测试中的表现显著优于神经移位组。这些结果表明，尽管两种策略在肌肉力量恢复方面无明显差异，但神经移植后运动协调性的恢复优于神经移位。
在本研究中，采用了三种经典的动物行为学实验，以对大鼠模型的前肢整体功能进行综合评估。Ochiai评分主要用于评估肢体功能障碍对运动过程中步态模式和步幅长度的影响13。Barth脚错误测试通过量化患肢的异常运动，提供一个反映前肢近端肌肉功能的数值指标；该测试本质上是一种依赖感觉反馈的感-运动任务16。Terzis梳理测试则评估肩部上抬...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
作者无任何利益冲突需要披露。
本研究由国家自然科学基金（编号：82201525，资助JS）资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1× 柠檬酸抗原修复液 | Servicebio | G1219-1L | |
| 1× Tris-EDTA 抗原修复液(pH 8.0) | Servicebio | G1207-1L | |
| 1× Tris-EDTA 抗原修复液(pH 9.0) | Servicebio | G1218-1L | |
| 10-0 PROLENE | Johnson&Johnson Med Tech | W2790 | |
| 5-0 MERSILK | Johnson&Johnson Med Tech | SA82G | |
| Alexa Fluor 488 标记的山羊抗小鼠 IgG (H+L) | Servicebio | GB25301 | |
| 抗160 kDa 神经丝蛋白中等链小鼠单克隆抗体 | Servicebio | GB12763-100 | |
| 抗胆碱乙酰转移酶兔多克隆抗体 | Servicebio | GB11070-1-100 | |
| 抗荧光淬灭剂涂层试剂 | Servicebio | G1401 | |
| 牛血清白蛋白 | Servicebio | GC305010-5g | |
| ChAT | Servicebio | GB11070-1 | |
| Cy3 标记的山羊抗兔 IgG (H+L) | Servicebio | GB21303 | |
| DAPI | Servicebio | G1012-10 | |
| 包埋机 | GET Electronics (Hui ZHOU) Co., Ltd. | JB-P5 | |
| 荧光显微镜 | Nikon | Eclipse C1 | |
| 四通道肌电图仪 | Dantes | DT440 | |
| G*Power | Heinrich Heine University Düsseldorf | 3.1.9.7 | |
| 高速相机控制器 | Nikon | DS-U3 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | 1.8.0 | |
| 显微外科器械 | 宁波成和微器械厂 | 6804 | |
| 微波炉 | Galanz | P70D20TL-P4 | |
| 手术显微镜 | 上海医用光学仪器厂 | SXP-1B | |
| 移液器 | Eppendorf | 100221588457 | |
| Prism | GraphPad Software | 10.1.2 | |
| 轮转式切片机 | Leica | RM2016 | |
| 扫描仪 | Epson | V300 | |
| Sprague Dawley 大鼠 | 上海斯贝福实验动物有限公司 | OR-1001 | |
| 组织自发荧光淬灭剂 | Servicebio | G1221-5ML | |
| 组织标记笔 | Gene Tech | GT1001 |