可重复的实验装置设置 在体 小鼠颈部淋巴管收缩性与淋巴流动的双光子成像

摘要

该论文展示了一种创新的方法 体内 小鼠颈部淋巴管收缩功能及淋巴流动性的研究，用于检测颈部淋巴管（cLVs）的多种生理功能以及调节脑部淋巴引流与清除机制的治疗策略。

摘要

cLVs 的收缩性是淋巴流动的驱动力，也是大脑毒素清除的关键机制。本文介绍一种创新方法 体内 双光子成像技术用于观察小鼠颅内淋巴管（cLVs）的收缩功能，以及长期监测淋巴流对红细胞从cLVs中的清除过程。该成像系统包含一个适配小鼠颈部的微型加热垫，可在维持cLV收缩功能和淋巴流动的同时，将成像时间窗口延长至5小时；此外还包括湿度控制装置、保护性外壳以及定位系统，以实现cLV稳定的光学可视化。该方法具有良好的可重复性，并可兼容多种双光子显微镜和不同类型的物镜，能够在深度达500 µm的范围内获取高质量图像。本实验方案详细描述了cLV手术准备的各个步骤，旨在维持其生理环境，确保cLV正常收缩功能的保留。

引言

颈淋巴管（cLVs）的收缩功能在脑部引流以及淋巴系统清除脑组织代谢产物和毒素的过程中起着关键作用^1,2,3。cLVs这一主要功能的减弱会导致脑毒素清除能力下降，进而伴随多种脑部疾病的发生，包括阿尔茨海默病、创伤性脑损伤和脑癌^4,5,6,7,8,9。因此，研究cLVs的收缩功能是开发新型治疗策略的重要途径，有助于调控脑部引流与清除的淋巴调节机制^10,11,12。

本研究介绍了一种用于在不同年龄小鼠中实时进行双光子成像以观察纵行淋巴管（cLV）收缩性和淋巴液流动的新方法。该实验装置的重要组成部分包括一个微型加热垫，将其连接到动物颈部后，可在维持集淋巴管收缩活性和淋巴液流动稳定的同时，实现长达5小时的延长成像时间。

需要注意的是，与充满血液并在不同类型的血管中以一定速度（在人体中，从微动脉的10 mm/s到矢状窦的13 cm/s）流动的血液循环系统不同，淋巴管内淋巴液的充盈依赖于空淋巴管与代谢过程中产生的组织间液体积之间的压力梯度增加^{13,14,15,16,17,18,19}。同时，淋巴管内的淋巴流动是间歇性的，流速范围为0至1 mm/s^20,21,22。近期在人体中开展的MRI研究表明，脑膜淋巴管（MLVs）中的淋巴流速为1–3 mm²³。然而需要注意的是，即使在同一个人体内，MLVs中的淋巴流速在一天中的不同时段也会发生变化，并可能降至0。因此，淋巴管中的淋巴流动并不恒定，因为它取决于代谢过程的速率，而代谢速率又受温度影响²⁴。事实上，生化反应速率深受温度的直接影响，因此温度也可能显著影响淋巴管的自发性收缩，从而改变淋巴液的引流与运输^24,25,26。

因此，维持体温是保持淋巴管生理环境以支持正常收缩功能和淋巴流动的重要条件。然而，商用加热板的使用并不能确保在深部且光学可及的颈部区域（cLVs所在部位）维持所需的温度。这一点对于cLV收缩功能和淋巴流动的双光子成像尤为重要，因为此类实验需在环境温度为19 °C的低温实验室内进行，这是该光学技术所要求的条件²⁷。

在这方面，绝大多数in vivo研究中，使用商用加热板对淋巴管收集血管的收缩功能进行调控时，其有效时间仅限于3-5分钟（最大效应通常在数秒内出现^{3,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38}，此后淋巴管充盈度和收缩能力即开始下降。该方法显著限制了对淋巴管生理活动的观察时间，使其无法评估对淋巴管收缩功能及淋巴流动的长期影响。因此，我们研发了一种适用于小鼠颈部的微型加热垫，旨在将成像时间窗口延长至5小时，同时维持cLV的收缩功能和稳定的淋巴流动。

该装置的另一个组成部分是带有湿度控制和定位系统的保护外壳，可在无需浸水的条件下实现cLVs的稳定观察，并在使用针对0.17 mm盖玻片校正的长工作距离干镜（例如CFI Plan Apochromat Lambda D 10x（MRD70170）和CFI Plan Apochromat Lambda D 20x（MRD70270））时保持高分辨率图像。

该方法可确保重现性，并与其他类型的双光子显微镜及多种物镜范围兼容，同时考虑了环境因素，包括温度/湿度控制以及物镜的工作距离，能够在高达500 µm的成像深度和长达5小时的时间窗口内维持高质量图像，从而实现对小鼠心脏类器官收缩功能和淋巴流动的长期高质量分析。

必须考虑到颅淋巴管（cLVs）在颈动脉分叉附近的解剖位置，该区域存在压力感受器。对压力感受器的机械刺激会导致血压和心率失稳，从而引起静水压的显著变化，并最终破坏淋巴液流动³⁹。因此，本方法包含一份详细的手术操作方案，旨在轻柔地分离颈部深部区域的cLVs，以避免对邻近颈动脉分叉处产生机械刺激以及血压波动，这些因素可能导致脑部淋巴回流障碍，进而影响cLVs的淋巴流动及其收缩功能。

结果表明，小鼠心脏左心室（cLV）的收缩功能随年龄增长而下降，并且其对光刺激治疗效应的敏感性也随之降低。此外，通过长期观察（超过5小时），我们首次明确证实cLV可作为红细胞从右侧脑室清除的通道，这是大脑毒素清除的重要淋巴通路。^1,2,3总体而言，该方法的 体内 双光子成像技术用于研究硬脑膜淋巴管（cLV）的收缩功能和淋巴流动，旨在开展针对cLV多种生理功能的临床前研究，包括脑部引流与清除功能的调控、脑内代谢产物及毒素的清除，以及新型治疗技术对cLV生理功能调节作用的验证。

方案

所有操作均遵循《实验动物护理和使用指南》、欧盟关于用于科学目的动物保护的指令2010/63/EU，以及俄罗斯联邦科学与高等教育部指南（1984年11月13日第742号），上述文件已获萨拉托夫国立大学生物伦理委员会批准（协议编号7，2022年9月22日）。

注意：有关本方案中使用的所有材料的详细信息，请参阅材料表。

1. 固定小鼠的技术装置

1. 使用钢制光学导轨（SOR，长度 270 mm，宽度 43 mm；图 1A）作为装置的基座。
2. 在 SOR 上安装两个支架座（3PH-25），彼此间距为 175 mm（图 1B）。将安装立柱（3MP，直径 12 mm）插入 3PH-25 中，然后用 M6 螺丝牢固固定（图 1C）。
3. 在两个安装立柱（3MP）上安装立柱夹环（3PC）（图 1D）。在光学监测颈淋巴管期间，立柱夹环对于固定导管并持续供应生理盐水是必要的。
   注意：此步骤的目的是在手术后定期冲洗观察区域，以清除积聚的血液，避免影响光学监测。
4. 将直角固定立柱夹（3RPC-12）安装在其中一个 3MP 安装立柱上，并用 M6 螺丝牢固固定（图 1H）。
   1. 将安装立柱（直径 12 mm）插入 3RPC-12 的侧孔中（图 2B）。
      注意：该安装立柱用于后续固定非水浸式双光子镜头的保护罩。
   2. 将 3D 打印的支架安装在侧立柱上，并使用两对 M3 螺丝牢固固定（图 2C）。
   3. 使用紫外光固化胶，将直径为 12 mm 的盖玻片粘附在 3D 打印的保护外壳底面（图 2D、F）。随后，使用 M4 螺丝-螺母组件将保护罩固定在支架上（图 2）。
5. 使用两个台夹（3TC5）以及 M6 螺丝、螺母和垫圈组件，将用于垂直移动的精密平行移动台 02TV004 安装在 SOR 基座上（图 1E）（图 1F）。
6. 在台面上放置一个 3D 打印的容器（长 155 mm，宽 110 mm），用作生理盐水的蓄积储液槽（图 1G）。

2. 加热元件

1. 外周设备的组装
   1. 用一层薄薄的硅胶覆盖电线与加热元件1的连接处图3）。将温度传感器1固定在垫子上，并用硅胶密封（图3B).
   2. 将加热元件和温度传感器的导线焊接至多芯电缆，连接处填充硅胶，并用热缩管密封。图3).
   3. 将加热元件2和温度传感器2放入泡沫滚筒中图4).
2. 控制单元的组装
   注意：下载用于打印对照组病例文件的链接 https://disk.yandex.ru/d/06BURfMlQpl0Jg
   1. 使用3D打印机打印控制单元的外壳图5B).
   2. 如图所示，将用于连接电源线和电源按钮的连接器固定在机箱壁上 图5C，D).
3. 在 enclosure 内安装一个 24 V DC 电源、一个 DC 降压转换器和两个 MOSFET 模块（图5AG，H，I).
4. 组装电路时，请遵循以下步骤：图6).
   1. 将降压转换器连接至电源，并将电压设置为 9 V（图6).
   2. 将 Arduino UNO 上的 VIN 引脚连接到转换器的 OUT+ 接口，GND 连接到 OUT 接口图6).
   3. 将电源的 V+ 引脚连接到 MOSFET 模块的 VIN+ 引脚，V 引脚连接到 VIN 引脚图6).
   4. 将加热元件1的V pin+连接到MOSFET模块1的VOUT+，V-连接到VOUT（图6).
   5. 重复加热元件2和MOSFET 2的步骤（图6).
   6. 将MOSFET 1和2模块上的GND引脚连接到Arduino UNO的GND，将PWM MOSFET 1连接到Arduino UNO的D11接口，将PWM MOSFET 2连接到D10接口图6).
   7. 将温度传感器1的VIN引脚连接到Arduino UNO的GND接口，VIN+连接到Arduino UNO的5 V接口，SIG连接到D3图6).
   8. 将温度传感器2的SIG触点连接到Arduino UNO的A1接口，将传感器的GND连接到Arduino UNO的GND，并连接100 kΩ上拉电阻（图6).
5. 将 Arduino UNO 和键盘屏幕固定在盖子外壳中（图7I).

3. 温度控制软件指南

1. 下载 Arduino 程序（.ino 文件）并在 Arduino 开发环境（IDE 版本：2.3.5-nightly-20241212）中打开。
2. 选择正确的 COM 端口并下载固件。界面包含两个按钮，使用左键和右键在它们之间切换（图 7B、D）。选择指示器位于列的左侧（图 7F）。
3. 温度选择字段位于屏幕的左列（图 7H）。使用“上”和“下”按钮进行调节（图 7C）。
4. 启动/关机字段位于屏幕的右列（图 7G）。要选择此列，请按键盘上的 右 按钮，然后按“选择”按钮（图 7A）。当过程运行时，活动指示器将闪烁，且“运行”按钮上的标签将变为“关闭”。

4. 将动物固定在技术装置中

注意：实验在雄性 BALB/c 小鼠（25-28 克，2、18 和 24 月龄）上进行；每组包含 7 只动物。

1. 按小鼠体重，配制氯胺酮与赛拉嗪混合溶液（剂量分别为 100 mg/kg 和 10–15 mg/kg），并通过腹腔注射给药。
2. 将眼药膏涂抹于眼睑，防止手术期间眼球干燥。必要时可重复此操作。
   注意：麻醉后需评估麻醉深度。手术要求无屈曲反射、对尾部夹捏无反应，四肢肌张力降低或消失，心跳和呼吸缓慢且平稳。
3. 将小鼠仰卧置于加热装置上，以便暴露腹部区域。
   注意：通过加热装置（36–37 °C）及热成像仪持续监测小鼠体温。从小鼠置于显微镜镜头下开始，整个实验持续 5 小时。在开始成像前 1 小时，通过面罩向动物供给 1% 异氟烷，此后动物将一直处于麻醉状态直至实验结束。整个过程中每 30 分钟评估一次麻醉深度。
4. 将控制单元插入电源插座（输入电压范围 175–240 V AC，频率范围 50–60 Hz，交流电流 1.8A/230 V AC）。将设备的工作温度设定为 37–38 °C。
5. 使用医用胶带固定动物，使其身体与台面平行，并将头部相对于身体矢状轴倾斜，使颈部右侧或左侧置于滚轮上（图 8A）。
   注意：此头部固定方式旨在使颈部右侧或左侧（根据实验条件而定）抬高约 5 mm，接近显微镜镜头。从而使深部颈淋巴结（dcLN）和颈淋巴管（cLV）区域与气管基本处于同一水平。
6. 将结扎线绕过上切牙并固定于装置后部，同时使用医用胶带固定动物以维持体温。
7. 使用剃毛器剃除颈部发际线区域的毛发。剃除后清除残留毛发，随后覆盖动物以保护无菌区域。为进行手术操作及后续光学观察，于切口部位皮下注射 0.5–1 mL 利多卡因/布比卡因（剂量分别为 7–8 mg/kg 和 0.25 mg/mL）。
   1. 进行初步消毒时，先用酒精棉片脱脂并局部消毒皮肤，再用 0.5% 氯己定溶液或 2% 碘液进行皮肤抗菌处理。上述灭菌步骤需重复进行两次。
8. 使用直角手术剪沿下颌至锁骨区域纵向切开颈部皮肤，切口长约 2 cm（图 8B）。
9. 使用显微外科弯剪进行筋膜切开，借助弯镊轻轻分离唾液腺及颈部浅层肌肉，暴露胸锁乳突肌。操作中应避免损伤可见血管，以防出血。持续用生理盐水润湿手术区域，防止组织过度损伤。
10. 使用显微外科剪对胸锁乳突肌进行肌膜切开，以暴露气管与颈动脉之间的区域。
11. 继续分离肌肉与筋膜，实施肌膜与筋膜切开，于深部 5–7 mm 处定位深部颈淋巴结及其输入和输出淋巴管（图 8C）。

5. 在显微镜下固定小鼠

1. 将固定好动物的装置放置在显微镜的移动载物台上，并使用 M6 螺丝将其牢固连接。这是为了确保装置在移动载物台上具有稳定的安装位置。
2. 将控制单元插入电源插座（输入电压范围 175–240 V AC，频率范围 50–60 Hz，交流电流 1.8 A/230 V AC）。将设备的工作温度设置为 36–37 °C。
3. 使用医用胶带将装有生理盐水的导管固定在支架上。
4. 在动物头部一侧的加热元件下方放置一个直径为 1 cm 的滚轮，以确保相对于移动显微镜载物台呈 45° 倾斜角。这是为了使颈淋巴管处于水平位置，并减少对气管的后续压迫。
5. 在手术操作后，将固定的导管置于颈部已暴露的区域，使其位于动物锁骨侧。
   1. 打开生理盐水的供应，等待直至暴露的颈部区域完全充满生理盐水。
   2. 将保护套筒缓慢覆盖在充满生理盐水的颈部区域上，使淋巴管区域位于其中心位置，且不压迫动物的气管（图 9A）。
   3. 建议使用连接双光子显微镜的双目镜来安装保护套筒。将保护套筒放置在气管上方时，应确保其不压迫气管。在下放过程中，需确认保护套筒下方无气泡积聚。确保保护板位于颈部上部肌肉之上，不压迫颈淋巴管（cLVs），以便加热的生理盐水流入管腔，同时防止颈淋巴管发生机械形变。
6. 将非浸水式双光子物镜缓慢下放至保护套筒内，深度应等于该物镜的工作距离，随后对颈淋巴管进行双光子成像观察（图 9B）。
   注意：首次扫描时，必须确认淋巴管在其全长范围内结构完整，并且在小鼠呼吸时具有可动性。这表明淋巴管未被保护套筒压迫或变形。

6. 双光子 体内 监测cLV收缩力

注意：双光子图像使用多光子显微镜（脉冲激光，激发波长970 nm）获得。图像分辨率为20倍（f/0.75）。每幅图像包含1个视野，放大倍数为3.0（212.13 × 212.13 µm），由512 × 512个像素点组成。cLVs的图像通过以每秒30帧的速度拍摄持续1分钟的视频获得。双光子图像在单一通道中获取，激发cLVs中荧光标记LYVE-1的波长为488 nm，其发射波长为525 nm。

1. 心淋巴管（cLV）直径分析与自动收缩功能评估
   1. 使用30帧/秒、3倍放大倍率的30分钟视频，在感兴趣区域（ROI）内测量心淋巴管（cLV）的直径。利用自定义的Python代码，对用于淋巴流速计算的相同管段，获取其直径随时间变化的曲线。
   2. 手动选择对应于cLV对侧管壁的两个点，随后使用Lucas-Kanade光流算法（OpenCV中的calcOpticalFlowPyrLK函数）在后续帧中确定这些点的位置，该算法可实现亚像素级测量精度。将所追踪两点间的距离计算为直径，并从像素单位转换为微米。采用滑动窗口中值滤波器以消除运动伪影。每个ROI内应至少包含20次直径测量值。
   3. 为确定脉动的内在频率，使用平滑处理后的直径时间序列数据。利用SciPy库中的find_peaks函数自动检测信号的峰值与谷值，该函数基于幅值阈值及峰间最小距离来识别时间信号中的局部极值点。
   4. 排除收缩幅度小于平均直径3%、或收缩间隔小于2秒的cLV收缩事件。以每分钟收缩次数计算30分钟时间区间内的平均收缩频率。

7. cLVs 中淋巴流动的双光子分析

注意：通过慢性导管将自体血液注入右侧脑室后5小时内，通过观察cLVs中红细胞的移动来评估淋巴流动情况。

1. 用1%异氟烷麻醉小鼠（参见已发表的方案）⁴⁰）。按照上述方案将导管植入右侧侧脑室⁴⁰.
2. 准备小鼠以进行双光子成像 体内 按照步骤 7.1、7.3–7.5 对 cLVs 进行成像。
3. 通过针刺尾静脉采集血液，将10 µL血液收集至预先用肝素冲洗过的无菌微量离心管中，以防止采血和注射过程中血液凝固。
4. 使用微量注射泵以0.1 µL/min的速度将血液注入右侧侧脑室（前囟后−0.5 mm；内侧−1.06 mm；深度2.5 mm）。
5. 对cLVs中红细胞运动进行双光子分析。使用已发表的方案计算淋巴流速^41,22.

8. cLV 收缩功能的光生物调节

1. 对于cLVs的PBM分析，请使用先前发表的技术和方案⁴⁰。

9. 安乐死

1. 研究完成后，使用 CO₂ 安乐死舱对小鼠实施安乐死。

结果

使用保护性套管为长期监测颈淋巴管提供了最重要的优势 体内例如，将手术区域与外部环境隔离，使淋巴管及其周围组织能够浸没在生理盐水中，并通过连接到动物体上的导管持续补充生理盐水。此外，由于保护罩固定在显微镜载玻片上，并与淋巴管周围的组织保持紧密的机械接触，因此在动物自然呼吸和心脏活动期间，可确保观察视野的机械稳定性，使所观察血管在5小时观察期间的总位移不超过零点几微米。

在一项研究中测试了该技术，旨在考察不同年龄对光生物调节（PBM）刺激脑膜淋巴管（cLV）收缩功能敏感性的差异（图10）。这一选择基于我们此前发表的一系列ex vivo研究结果，这些结果表明，随着年龄增长，脑部引流功能下降，且对PBM的刺激效应变得不敏感^29,42,43,44

讨论

研究淋巴管的生理功能需要在维持特定环境条件的同时采用非侵入性方法，以保证其正常的收缩功能和稳定的淋巴流速。目前绝大多数研究淋巴管功能的方法均基于对其收缩性的光学监测以及对淋巴流速的评估^{3,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3D 打印机	Bambu Lab, 中国	P1S
5针连接器	Connfly electronic (Zhenqin), 中国	DS1110-01
一套热缩管	Jupiter, 中国	JP7230-01
Arduino IDE	Arduino LLC	2.3.5-nightly-20241212
BALB/c 小鼠	"Andreevka" Branch FSBIS SCBT FMBA, 俄罗斯	3-15-16	雄性，6月龄
氯己定	BIOPHARMACEUTICAL PLANT, 俄罗斯	N/A
Dumont 镊子	Stoelting, 美国	52100-07
伊文思蓝染料	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, 美国	N/A
精细镊子	Stoelting, 美国	52102-02P
Hamilton	Hamilton Bonaduz AG, 瑞士	29 G 针头
加热元件	中国	LFH-9415sg
胰岛素针头	INSUPEN, 意大利	31G, 0.25mm*6mm
氯胺酮	MOSCOW ENDOCRINE PLANT, FSUE, 俄罗斯		全身麻醉
按键屏蔽板	diymore, 中国	1602 LCD 按键屏蔽板
利多卡因	ORGANICA, 俄罗斯	N/A	镇痛药物
带锁开关按钮	中国	N/A
金属膜电阻	TZT, 中国	N/A
微型解剖弹簧剪刀	Stoelting, 美国	52130-00P
MOSFET 模块	中国	MOSFET 模块 D4184
安装支架	Standa, 立陶宛	3MP, 直径 12 mm
安装导线	AB retail, 俄罗斯	HB-1
非尖头镊子	Stoelting, 美国	52108-83P
3D 打印机用塑料	Bambu Lab, 中国	A00-D0-1.75-1000-SPL.
支架环	Standa, 立陶宛	3PC
支架夹持器	Standa, 立陶宛	3PH-25
电源连接器	RUICHI, 中国	AC-015
电源	SANPU, 中国	PS200-H1V24
用于垂直运动的精密平行移动台	"Laser components", 俄罗斯	02TV004
直角固定支架夹	Standa, 立陶宛	3RPC-12
M3 螺钉	Standa, 立陶宛	N/A
M4 螺钉	Standa, 立陶宛	N/A
M6 螺钉	Standa, 立陶宛	N/A
剃毛机	Braun,	Series 3310s
氯化钠	Kraspharma, 俄罗斯	N/A
焊料	金属粉末生产, 俄罗斯	锡铅焊料 61
助焊剂	Solins, 俄罗斯	LTI-120 22 ml 带刷
焊接站	AOYUE, 中国	N/A
焊接站	AOYUE, 中国	N/A
钢制光学导轨 (SOR)	Standa, 立陶宛	N/A
降压电压转换器	RUICHI, 中国	EM-825
直头解剖剪刀	Stoelting, 美国	52132-10P
温度传感器	Liludin, 中国	DS1820
四环素	JSC Tatkhimfarmpreparaty, 俄罗斯		眼膏
控制器	Arduino, 中国	UNO R3
镊子	Stoelting, 美国	52100-03
双光子 显微镜	Nikon, 日本	A1R MP
导线	Partner-Electro, 俄罗斯	P020G-0305-C050
赛拉嗪	"Alfasan International B.V.", 荷兰		肌肉松弛剂
导管	Scientific Commodities Inc., 美国	PE-10, 0,28 mm 内径 × 0,61 mm 外径