我们提出了一种在多个层次水平上评估骨再生的实验方案。该多模态方法能够实现跨不同长度尺度的结构分析，有效解决了样本制备中的挑战，并为评价生物材料促进骨再生的效果提供了可靠的分析流程。
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摘要
摘要
植入物的临床成功在很大程度上取决于其促进骨修复和实现骨整合的能力。尽管在新型支架的设计方面已取得显著进展，但针对植入物在不同骨组织尺度上的成功效果仍缺乏充分的系统性评估。骨是一种具有层级结构的组织，其结构复杂，从纳米和微米尺度的胶原原纤维排列及其矿化，到宏观尺度上密质骨与松质骨的排列，均呈现出多级次的组织特征。这种层级结构对维持骨的功能和力学性能至关重要。因此，全面评估生物材料在多个尺度上对骨修复的影响，对于判断植入材料的有效性和安全性至关重要。然而，制备适用于整合性多模态分析的样品仍面临技术挑战。在本研究中，我们提出了一种用于评估骨再生在不同层级水平上表现的实验方案，并分析新生骨组织与植入支架之间的界面。该方法为评估支架诱导骨修复的有效性提供了可靠的技术路径。结合选用的三维和二维成像技术，对于准确评估骨愈合过程中形成的复杂矿化组织具有关键作用。
引言
骨是一种复杂且具有层级结构的组织1,2。理解其结构组织对于回答细胞如何参与组织架构以及结构变化如何影响力学功能等基本问题至关重要3。在这一背景下，损伤后骨的重塑仍是研究的核心课题。骨折愈合是一个复杂的多阶段过程，始于最初的炎症反应，随后发生血管生成以及前体细胞向软骨细胞和成骨细胞的分化4,5。关于生物材料在促进骨整合中的作用，已有诸多讨论，特别是其生物相容性及其防止纤维包裹形成的能力6。
评估生物材料诱导骨整合的常用方法是光学显微镜，该方法可实现组织学的定量与定性分析。已有研究表明，该方法是评价骨植入物成功与否的一种可靠且有效的方式7,8。然而，与骨组织层级结构相关的若干问题无法仅通过单一成像方法进行探究3，尤其是组织学方法，其至少在一定程度上受限于该技术的放大倍数限制。
三维成像技术的进步对于理解骨组织的层级结构至关重要。诸如显微计算机断层扫描（microCT，可采用同步辐射或常规实验室X射线源）9,10,11、结合切片-成像断层技术的双束扫描电子显微镜（FIB-SEM）12,13,14以及透射电子断层成像技术15,16等方法，已在多个尺度上为骨组织结构提供了新的认识。
基于不同的三维成像方法，学者提出了一种骨组织层级结构模型，最初确定了骨结构组织的九个不同层级1。该模型近期已被修订并扩展至约12个层级，为研究骨组织结构与功能之间的关系提供了有价值的参考依据2,17。尤为重要的是，这一提出的层级模型为评估损伤后骨修复的效果奠定了基础。判断再生骨组织是否重现了天然的层级结构，是评估骨愈合质量的关键标准，尤其是在损伤部位使用生物材料的情况下。
尽管已有讨论采用多种成像技术来研究骨组织结构6,7,18,19,20，关于整合多种成像模式以在多个空间尺度上评估骨矿物质组织的 workflow，目前研究仍十分有限。如前所述，骨是一种复杂的复合组织，由有机相（细胞、胶原和大分子）和矿化基质组成。从样品制备的角度来看，这种复杂性在溶剂渗透样品、硬组织切片以及整合不同成像策略方面带来了技术挑战 同一样本。
本研究的关键创新在于建立了一种可重复、关联性强且涵盖多尺度的成像工作流程，该流程结合了三维成像与多种互补技术。如图1A所示，该工作流程的设计使得同一样本能够依次通过不同的成像模式进行检测。由于其中部分技术具有破坏性或需要切片处理，因此工作流程的顺序首先采用非破坏性方法，再逐步过渡到涉及切割或材料去除的检测手段。
该样品制备与分析工作流程广泛适用于硬质或矿化组织样本，包括皮质骨、松质骨、植入前支架，以及植入后骨/生物材料界面的评估。通过结合覆盖不同视野范围和分辨率区间的多种成像模式（图1B），该工作流程可实现从厘米尺度到微米乃至纳米尺度的样本分析。尽管该流程的顺序经过优化，可用于单个样本的关联性分析，但每种技术也可根据实验目标独立应用。该方法能够对生物材料的骨整合情况进行详细评估，并对愈合区域内的新生骨组织生长进行评价。
方案
本方案中展示的结果来自先前一项研究中进行的实验程序21。所有操作均遵循巴西弗鲁米嫩塞联邦大学实验动物使用与护理伦理委员会（CEUA/UFF：779）的伦理指南。简言之，将20只雄性Wistar大鼠（体重介于300至400 g之间）随机分为两组：假手术组（Sham）和cHA-微球植入组。所有动物均接受手术，在胫骨干处制造一个2 mm的骨缺损。假手术组作为血凝块对照组，用于评估非临界性缺损中的骨再生情况，而实验组则在缺损部位植入CHA37微球。术后7天和21天，通过过量全身麻醉处死动物，并采集各组在两个时间点（7天和21天）的胫骨骨块。采用光学显微镜和显微CT评估骨质量及新生骨形成程度。
1. 样品固定与树脂包埋
- 安乐死后立即取出含有植入生物材料的胫骨，并将其转移至含有Karnovsky固定液（2.5%戊二醛，4%甲醛溶于0.1 M卡考基酸盐缓冲液）的样品瓶中。将样品在-4 °C下保存至少1天。
注意：配制和操作固定液时应在通风橱内进行，以避免接触挥发性物质。所有化学品操作必须使用适当的个人防护装备（PPE），并根据需要实施额外的技术安全措施。 - 将样品从固定液转移至含有0.1 M卡考基酸盐缓冲液的样品瓶中。保持样品在缓慢旋转条件下，每隔10分钟更换缓冲液一次，共更换2次。在此阶段，使用小型锯子修剪样品边缘，以促进树脂渗透。切割样品时应始终保持其浸润在0.1 M卡考基酸盐缓冲液中，防止干燥。
注意：始终确保样品所处的缓冲液体积至少为样品体积的2倍。本方案中使用的所有溶液和树脂均应遵循此原则。处理上述化学品时，应在通风橱内操作并穿戴适当的个人防护装备（PPE）。将废弃的固定液和卡考基酸盐缓冲液收集于明确标识、化学兼容且盖子密封良好的容器中。遵循机构的标准操作程序（SOPs）对危险化学废物进行安全储存和处置。 - 使用浓度递增的丙酮（10%、30%、50%、70%、90%和100%）开始脱水过程。每个浓度下保持样品旋转30分钟。100%无水丙酮步骤重复3次。
注意：操作丙酮时应在通风橱内进行，并穿戴适当的个人防护装备（PPE）。使用后，将残留溶剂收集于明确标识、化学兼容且盖子密封良好的废液容器中。遵循机构的标准操作程序（SOPs）对危险化学废物进行安全储存和处置。 - 通过将样品依次转移至丙酮与Spur树脂不同比例的混合液中进行渗透处理：2:1、1:1、1:2，最后使用纯树脂。每一步持续12小时，并在室温下保持旋转。完成梯度丙酮-树脂渗透后，更换纯树脂2次。最后将样品转移至含有纯树脂的模具中，并在70 °C下聚合24小时。
注意：树脂按照产品说明书配制以获得中等硬度。操作Spur树脂时应在通风橱内进行，并穿戴适当的个人防护装备（PPE）。使用后，将残留物收集于明确标识、化学兼容且盖子密封良好的废液容器中。遵循机构的标准操作程序（SOPs）对危险化学废物进行安全储存和处置。
2. 使用微型计算机X射线断层扫描（microCT）进行样品可视化
注意：采用显微CT（microCT）评估植入物定位及骨再生情况，并有助于识别进一步分析的潜在感兴趣区域。此步骤应在样本包埋于树脂中后进行。
- 使用制造商提供的样品台作为基座，确保样品固定稳妥，防止扫描过程中发生移动。可用低密度材料（如聚苯乙烯、纱布或微量离心管）对样品进行支撑。
- 采用以下最佳扫描参数进行成像：管电压/电流 = 60 kV/133 mA；角度步长 = 0.33°；平均帧数 = 5；体素大小 = 5 µm；旋转模式 = 180°。对于含有金属植入物的样品，应采用360°旋转并使用0.5 mm铝滤片。
注意：在骨再生过程中，类小梁编织骨的厚度通常处于常规显微CT成像的分辨率极限范围内。为准确量化小梁骨的传统形态学参数（如小梁厚度、小梁间距和小梁数量），建议使用最小体素尺寸（如上所述为5 µm）。若在该标称分辨率下，感兴趣区域（ROI）超出视野范围（FOV），应首先使用多区域扫描（multiscan）功能对ROI进行拼接。仅当无法通过多区域扫描获取完整ROI时，才考虑增大体素尺寸。 - 扫描完成后，原始采集数据由一系列编号的图像文件组成。使用制造商提供的软件进行重建，并重点关注最小化样品感兴趣区域内的伪影。
注意：图像边界处常出现伪影，尤其是在无需分析的区域。可使用制造商软件对最终重建体积进行裁剪，以去除这些区域。 - 使用多种3D可视化软件（如Avizo、VGStudio Max、CTVox和Dragonfly22）对重建后的体积数据进行分析。应用数字图像滤波器以去除伪影。本实验中采用非局部均值去噪方法实现此目的19。
注意：非局部均值去噪滤波器的平滑参数应尽可能保持较低，以免模糊界面的重要细节。
3. 光学显微镜样品制备
- 根据实验目的选择样本切片方向。胫骨可沿骨的长轴进行横向或纵向切片。使用横向切片可获得覆盖整个缺损体积的连续切片。纵向切片适用于评估沿长轴方向的骨再生情况，但该方法仅能提供缺损的一个单一剖面。
- 按照实验策略，使用低速金刚石锯片将样本切成1 mm厚的切片。
注意：建议使用厚度为0.006至0.012英寸的金刚石锯片。较薄的刀片可实现高精度切割，并因刀片本身厚度小而减少材料损耗。 - 向液体储槽中加液，直至液面覆盖锯片底缘。
注意：蒸馏水适用于骨样本。然而，若预计会产生过度加热（例如含有金属植入物的样本），应使用设备制造商提供的油填充储槽。 - 将样本固定在样品夹持器上，并将其连接至仪器臂。确保样本稳定且与锯片表面水平。使用定位旋钮调整样品切割区域对准锯片。
- 开始切割时采用较高的转速设置（210–250 RPM），并施加轻压，直至样本表面形成压痕。随后降低转速（至93–124 RPM），以平稳完成切片过程并防止过度振动。
- 切割完成后立即停止锯片运转。正确调整系统，确保样本一旦从原始块体分离即刻停止切割。
- 按照实验策略，使用低速金刚石锯片将样本切成1 mm厚的切片。
- 使用体视显微镜检查样本。首先在低倍镜下（例如5x–10x）观察整个样本，然后根据科学问题提高放大倍数（例如20x–40x）以选择感兴趣的区域。具体放大范围可能因所用仪器而异。本研究中选择了新形成骨与生物材料之间界面密度较高的区域进行进一步分析。
- 用于减薄的样本安装
- 将样本安装在支撑物上，以便在抛光过程中便于操作。如果样本仅用于光学显微镜分析，则使用瞬干胶将样本已预先抛光的一面直接粘附于塑料盖玻片上。
注意：推荐使用塑料载片，因其具有更好的粘附性。也可使用玻璃载片（需用中性洗涤剂彻底清洗），但玻璃载片在抛光过程中会增加样本脱落的风险。 - 对于需进一步采用关联分析方法的样本，应安装在两部分组成的铝管组件上。本方案中开发了一种自制铝管组件，包括一个直径为2.5 cm的内实心圆柱体和一个在外侧提供机械支撑的空心外圆筒。样本被固定在内实心圆柱体上。
- 将内铝圆柱体置于加热板上，加热至适合熔化石蜡的温度（通常约为60–70 °C，具体取决于所用石蜡类型）。
注意：蜂蜡也可使用。处理包埋蜡时应在通风橱内操作，并穿戴适当的个人防护装备（PPE）。使用后，应将残留物收集于明确标识、化学兼容且配有合适盖子的废物容器中。遵循机构标准操作程序（SOP）进行危险化学品的安全储存与处置。 - 在圆柱体表面涂抹少量石蜡，并使其完全熔化。
- 熔化后，将样本感兴趣的一面朝下放置于涂有石蜡的表面，并轻轻按压以确保完全接触。
注意：感兴趣面应朝向圆柱体表面，以便在相对侧进行减薄处理。避免使用过多石蜡，否则可能导致安装不平整，影响抛光质量。 - 将圆柱体从加热板上取下，并在室温下冷却使石蜡固化。
- 将样本安装在支撑物上，以便在抛光过程中便于操作。如果样本仅用于光学显微镜分析，则使用瞬干胶将样本已预先抛光的一面直接粘附于塑料盖玻片上。
- 抛光过程中监测样本厚度
- 在抛光过程中，使用低至中等倍率（例如10x–20x）的反射显微镜监测样本厚度。图示说明显微镜校准及样本厚度测量方法见图2。
- 使用标准盖玻片对显微镜Z轴进行校准，其厚度通常约为150 µm。用红色永久性记号笔标记盖玻片一侧，再用蓝色记号笔在另一侧相邻区域做标记。将盖玻片安装在玻璃载片上。
- 使用微调焦旋钮和微米刻度尺，先聚焦于盖玻片底面，再聚焦于顶面。
- 记录Z轴位移值。该值对应盖玻片厚度（约150 µm），作为参考基准。
- 在抛光样本过程中，定期使用此Z轴校准方法估算样本厚度，而无需将其从铝圆柱体上取下。
注意：该技术可在抛光过程中快速、无损地估算厚度。也可将样本从夹具上取下，使用数显卡尺或千分尺进行测量。
- 减薄与抛光
- 使用粒度为1200、2500和4100的砂纸进行粗抛和中等程度抛光。此步骤的目的是将样本减薄至约0.15 mm，同时去除明显的表面不平整。
- 先使用1200粒度砂纸，然后过渡到2500粒度。此过程中施加轻压。在抛光期间定期使用反射显微镜监测样本厚度。
- 达到目标厚度后，使用4100粒度砂纸对样本两面进行抛光。抛光可手动进行，或使用设定为低转速的半自动抛光机完成。每次抛光步骤中均需持续用蒸馏水彻底清洗样本。
注意：抛光过程中保持样本和砂纸湿润有助于降低温度，并防止较粗糙砂纸造成的表面污染。 - 最终抛光时，在安装于抛光盘上的毛毡抛光布上涂抹少量金刚石抛光膏（例如6 µm或3 µm）。根据样本表面粗糙度选择金刚石抛光膏的颗粒大小。
注意：6 µm抛光膏适用于初步精抛，而3 µm抛光膏推荐用于最终镜面抛光。如条件允许，依次使用两种抛光膏可获得最佳效果。但仅使用6 µm抛光膏仍可实现满意的抛光效果。 - 以最小压力轻轻抛光样本两面。在显微镜观察前，使用压缩空气或棉签干燥样本抛光面。
- 为将样本从圆柱体上分离，使用加热板加热使石蜡熔化，并用无水丙酮清除样本上残留的石蜡。
注意：处理包埋蜡和无水丙酮时应在通风橱内操作，并穿戴适当的个人防护装备（PPE）。使用后，应将残留物收集于明确标识、化学兼容且配有合适盖子的废物容器中。遵循机构标准操作程序（SOP）进行危险化学品的安全储存与处置。 - 使用浸油作为封固介质，将样本夹在玻璃载片与盖玻片之间，并利用偏振光显微镜评估胶原纤维取向。从低倍镜（例如5x–10x）开始对样本进行整体观察，再提高至中等倍镜（例如20x–40x）以识别可能适合通过电子显微镜进一步探索的区域。
注意：若需继续进行关联分析流程并随后通过扫描电子显微镜分析样本，建议不要密封样本。
4. 扫描电子显微镜样品制备
- 小心地将样品从载玻片上取下。使用移液器吸头轻轻将盖玻片从载玻片上滑下。用滤纸吸除多余的浸油。用中性肥皂清洗样品。在小型容器内进行清洗，以避免样品意外丢失。
注意：如果样品上仍有残留的浸油，请使用蘸有70%乙醇的棉签轻轻擦拭表面进行清洁。 - 将样品置于滤纸上自然晾干。也可使用压缩空气或棉签辅助干燥。样品完全干燥后，使用碳导电胶带将其固定在样品台上。对样品进行溅射镀膜，覆盖一层10 nm厚的金，以防止成像过程中产生电荷积累。
- 利用双束FIB-SEM显微镜通过多种方法对样品进行分析。
- 在SEM（扫描电子显微镜）模式下，使用二次电子或背散射电子，对先前通过光学显微镜选定区域的样品形貌、生物材料以及新生骨组织界面进行评估。
- 在聚焦离子束-扫描电子显微镜（FIB-SEM）模式下，执行切片-成像断层扫描。
- 在使用二次电子探测器的SEM模式下，选择先前已通过偏振光显微镜和SEM分析过的区域，继续进行切片-成像断层扫描数据采集。
- 根据目标特征调整沟槽体积、像素尺寸和切片厚度等参数。在本实验设置中，切片-成像断层扫描的沟槽体积为15 µm × 10 µm × 10 µm，像素尺寸为20 nm，切片厚度为60 nm。建议尽可能采用各向同性的体素尺寸，以提高三维（XYZ）成像质量。
注意：这些参数可能因具体的FIB-SEM系统而异。请咨询设备操作人员，根据您的分析需求及系统性能确定最佳条件。
5. FIB-SEM 切片-成像断层扫描的对齐、滤波处理与分割
- 切片-成像断层扫描技术可生成一系列按顺序编号的图像。为进行图像对齐，需将该图像序列转换为 MRC 文件，通常称为图像栈（stack）。
- 使用 IMOD 软件执行 MRC 文件生成和图像栈对齐。
注意：其他软件（如 Avizo 和 FIJI/ImageJ）也提供图像栈对齐插件。如需详细操作指南，请参考各软件的官方文档。此外，Peddie 等人23的研究综述了图像栈对齐过程中采用的各种方法。 - 为生成 MRC 文件，请打开终端或命令提示符，导航至包含图像序列的文件夹，并执行以下命令：tif2mrc imagerootfile*.tif stackname.mrc
- 对于非 TIFF 格式的图像，请使用 raw2mrc 命令替代。添加 -g 参数（例如 tif2mrc -g），可将 24 位 RGB 图像转换为 8 位灰度图像，从而显著减少计算时间。
- 从终端启动 Etomo，选择 对齐连续切片（Align Serial Sections） 选项。按照以下步骤对图像栈进行对齐：（1）将未对齐的图像栈加载到单个帧中；（2）使用“初始自动对齐”选项卡进行对齐；（3）使用“生成对齐图像栈（Make Aligned Stack）”选项卡生成对齐后的图像栈，然后打开该对齐图像栈。
注意：此过程所需时间可能为数分钟，具体取决于图像栈的大小和系统性能。 - 完成后，请检查结果。对齐后的图像栈文件将被命名为 stackname_ali.mrc。
注意：本流程使用系统默认参数进行图像栈对齐。然而，用户可根据需要修改初始对齐和最终图像栈生成的相关参数。如需详细指导，请参阅 IMOD 官方文档： https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/serialalign.html.https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/serialalign.html。 - 使用 Avizo 软件进行进一步的图像滤波处理。打开对齐后的图像栈，并依次应用以下滤波器：快速傅里叶变换（FFT）滤波器（位于 Sandbox Filter 插件中，选择垂直条纹方向，容差值设为 2）、阴影校正向导（调整掩膜范围以覆盖图像中所有阴影区域，归一化因子设为 100）、直方图均衡化（使用默认配置）以及非局部均值滤波器（参数调整为 5；0.1；10；3）。
注意：其他图像分析软件中也提供等效滤波器。在 FIJI/ImageJ 中，我们推荐使用以下处理流程：FFT 滤波器、背景减除（Subtract Background）、局部对比度增强（CLAHE）以及非局部均值滤波器。 - 继续使用软件进行图像分割和三维重建。可采用多种分割策略，包括手动分割和基于阈值的分割。此外，诸如分水岭算法（Watershed algorithm）等附加工具可帮助实现分割过程的自动化，从而减少分割所需时间。
6. 透射电子显微镜样品制备
- 采用聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）制备薄片，以评估骨/生物材料界面。
注意：如果植入的生物材料并非陶瓷或金属（如本研究所述），可使用超薄切片机制备适用于透射电子显微镜（TEM）观察的超薄切片。但需注意，切割矿化材料会显著缩短金刚石刀的使用寿命。 - 将超薄切片在5%醋酸铀酰水溶液中进行20分钟的后染色。
注意：操作醋酸铀酰时，应在通风橱内进行，并穿戴适当的个人防护装备（PPE）。使用后，将任何残留溶剂收集至明确标识、化学兼容且配有合适盖子的废液容器中。请遵循机构的标准操作程序（SOP），安全储存和处置危险化学废物。 - 使用透射电子显微镜（TEM）对切片进行分析。为实现全面分析，应结合成像技术与选区电子衍射（SAED）、能量色散X射线光谱法（EDS）以及电子断层扫描技术。
结果
对树脂包埋样品的初步分析采用显微计算机断层扫描（microCT）进行。这种非破坏性技术可实现对整个缺损区域的三维可视化，从而对样品进行定性和定量分析。microCT成像中的对比度主要来源于样品中不同材料的密度差异。图1展示了在大鼠胫骨非临界性缺损中植入CHA37生物材料后的microCT分析结果。该样品于植入后12周采集，并按照前述树脂包埋方案进行制备。microCT分析生成了一个三维模型，揭示了样品的内部结构（图3A-B），并可区分骨组织、生物材料、树脂以及新生骨组织（图3C-D）。通过分析体积、材料碎片分布以及小梁骨与生物材料所占相对体积等参数，我们能够在微米尺度上有效表征骨组织与材料之间的相互作用24。作为此类分析的一个实例，Zelaya等人的研究21探讨了在植入CHA微球21天后胫骨缺损中小梁骨的结构特征。其结果显示，微球会解聚成直径在20至400 µm之间的较小碎片。此外，约70%的碎片表面与小梁骨直接接触，且小梁骨厚度相对均匀，约为31 µm。相比之下，在未植入生物材料的缺损中，同期形成的小梁骨平均厚度达到58 µm。总体而言，这些发现表明三维测量能够为骨再生过程提供重要的补充信息。
显微CT成像后，将树脂包埋的样品（图4A）进行切片，用于光学显微镜分析。切片可沿横断面（图4B，橙色矩形）或沿骨的长轴方向进行纵向切片（图4B，蓝色矩形）。横断面切片可获得贯穿整个缺损体积的连续切片，而纵向切片仅能获得缺损区域的一个单一切片。需要注意的是，横断面连续切片的成功率在很大程度上依赖于操作者的技能以及所用金刚石切割片的厚度。本研究中，我们以获取缺损区域的一个纵向切片为例展示预期结果（图4C）。切片和抛光步骤至关重要，必须谨慎操作以避免样品损伤。在本实验方案中，我们使用了一种自制的铝管组件，该组件由一个内层实心圆柱体和一个外层空心圆柱体组成（图4D）。样品通过包埋蜡固定在内层实心圆柱体上。然后将该内层组件插入外层空心圆柱体中（图4E-F），确保样品朝向砂纸。该装置可通过仅由内层圆柱体重量决定的均匀压力，实现对样品的可控减薄和抛光，从而避免在抛光过程中施加过大或不均匀的力。
通过光学显微镜进行分析是实现样品定位以及在不同成像模式之间建立关联桥梁的关键步骤（图5）。在完成抛光并初步使用光学显微镜观察后，样品的内在特征（如缺陷区域、含有生物材料的区域以及骨组织形态）可使光学显微镜下识别的区域与显微CT数据集中的相应位置相对应（图5A）。在完成初步定位后，进一步采用偏振光显微镜对样品进行观察（图5B-C），从而获得新生骨中胶原纤维排列结构的重要信息。此阶段中，样品的厚度起着至关重要的作用。较厚的切片会影响光线透过，限制对胶原纤维取向的评估。由于同一块样品在光学显微镜观察后还需进行双束扫描电子显微镜（FIB-SEM）分析，因此不同技术之间的关联区域仍主要依赖于样品本身的结构特征（图5E）。然而，若在光学显微镜与FIB-SEM分析之间需要进行额外的切割或修整，则应考虑采取适当策略，以确保不同技术之间的精确定位关联。在此类情况下，结构标志物和基准标记（微压痕或激光标记）可显著有助于兴趣区域的精确重定位。
聚焦离子束-扫描电子显微镜（FIB-SEM）可实现对新生骨组织与生物材料界面的高分辨率评估。在该技术中，首先使用扫描电子显微镜（SEM）模式对样品成像，从而精确定位感兴趣区域（图5E）。随后，可利用切片-成像断层扫描技术对所选区域的三维体积进行进一步观察（图5F-G）。该技术包括对样品进行连续的离子束切割与成像。通过切片-成像断层扫描所分析的体积大小取决于具体的设备及其应用目的。
获取切片-成像断层数据后，需对图像序列进行配准以供评估。可对配准后的图像序列应用额外的滤波器，以增强目标特征的可视化效果。在本研究中，我们应用了软件中提供的四种图像处理滤波器序列，以提高整体图像质量（图4）。首先，应用快速傅里叶变换（FFT）滤波器，以消除聚焦离子束（FIB）刻蚀过程中镓离子束切片引起的人工伪影（图6A-B，箭头）。这些“帘状”伪影在最终图像中表现为垂直条纹，严重影响目标特征的观察。此类伪影源于与表面粗糙度相关的刻蚀速率不均，可通过气体注入系统（GIS）沉积或样品预先抛光部分缓解。由于帘状伪影具有强烈的方向性频率成分，因此FFT滤波是最有效的第一步处理。若不加以校正，这些伪影将在后续处理步骤中持续传播，并在使用增强对比度的滤波器时被进一步放大。
接下来，使用明暗校正向导模块来解决样品块表面光照不均的问题（图6B-C，星号所示），这种不均可能由探测器几何结构、电荷效应或在切片-成像采集过程中束流强度的微小波动引起。在FFT滤波之后进行明暗校正，可确保仅对真实的背景梯度进行校正，避免高频条纹伪影的干扰。随后，应用直方图均衡化滤波器以增强图像对比度（图6D）。在消除条纹伪影和光照不均之后再使用直方图均衡化滤波器，可以在不无意放大与伪影相关的强度变化的前提下，有效增强样品结构细节的可见性。尽管此步骤可改善结构之间的视觉区分度，但也会增加图像噪声，导致像素强度的变异性，可能影响自动分割策略的准确性。为缓解这一问题，我们采用了去噪滤波器（非局部均值滤波）以在保留结构细节的同时降低图像噪声（图6E）。对同一感兴趣区域（ROI）在原始图像和完全处理后的图像中的比较表明，这些滤波器的顺序应用显著提升了图像质量和整体可解释性（图6F）。值得注意的是，这些滤波器也广泛应用于其他常用的电子显微镜图像分析软件平台，包括开源软件FIJI（ImageJ）。由于算法和操作等效，在相同参数设置下，不同软件平台所获得的结果具有一致性。主要差异仅体现在软件界面、计算资源需求以及许可限制方面。
使用各种滤波器提升图像质量后，可对配准的体数据堆栈应用分割策略。尽管可以手动进行分割，但这种方法可能非常耗时（见图7A）。当目标特征之间具有足够对比度时，基于阈值的分割方法可能非常有效。然而，该方法也可能捕获具有相似像素密度的非目标特征，因而需要额外的手动修正（图7B）。基于阈值的分割工具可在多种软件包中获得，包括 Avizo、Dragonfly、IMOD 和 FIJI。与图像处理流程类似，这些平台所获得的分割结果通常具有一致性，主要差异源于界面设计和许可限制。因此，用户应通过各平台的官方网站核实软件需求及可用性。
分割完成后，目标结构将以三维模型形式呈现（图7C）。这使得骨细胞小管网络等特征得以可视化。此外，通过软件特有的分析模块（如“厚度图”）可进一步增强三维渲染效果，从而测量整个骨细胞小管网络中小管的直径（图7C-D）。尽管本研究中的三维分析使用Avizo完成，但需注意的是，FIJI软件通过Local Thickness插件也可实现同等功能。有关该插件使用的更多细节，请参考其文档说明（https://imagej.net/imagej-wiki-static/Local_Thickness）。
透射电子显微镜（TEM）分析可用于在纳米尺度上观察骨/生物材料界面。该分析可结合选区电子衍射（SAED）、能量色散X射线光谱（EDS）和电子断层扫描技术，对样品进行详细表征。图8展示了一个使用金刚石刀切片的样品的界面区域。注意，在生物材料中可观察到沿切割方向的裂纹（图8A，箭头所示）。SAED图谱对于区分骨组织与生物材料区域至关重要（图8B-C）。通过标定TEM中获得的电子衍射图谱，可根据晶面间距的分析识别样品中存在的晶体相。在本例中，生物材料（图8B）和骨组织（图8C）均由羟基磷灰石晶体组成。然而，在骨组织区域，002环呈现不完整状态，表明骨晶体沿胶原纤维取向生长。此外，EDS分析可提供样品的元素信息（图8D-G）。骨/生物材料界面还可通过电子断层扫描进一步研究，该技术可在纳米尺度上对植入物的骨整合进行三维分析。
图1：用于关联分析的集成样品制备与成像技术。（A）顺序样品制备步骤，从样本获取开始，依次进行每种成像技术所需的制备流程。（B）各成像技术对应视野范围与空间分辨率的概览。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：基于反射的厚度测量过程示意图。(A) 使用带标记盖玻片进行系统校准。首先将显微镜焦距调整至下标记，再调整至上标记；微调焦尺上观察到的位移即对应盖玻片的厚度。(B) 样品厚度测量。将样品放置于载物台上后，依次将焦距调整至样品的底面和顶面。微调焦尺读数的差值即反映样品的实际厚度。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：大鼠胫骨缺损植入CHA37生物材料后12周的微计算机X射线断层扫描评估。（A）显示骨组织纵向切面的代表性三维体积图像，突出显示缺损区域及植入的生物材料。（B）与A图相同体积的图像，但以较高密度像素渲染，对应于生物材料碎片。（C）虚拟横截面切片（A图中红线位置）的二维截面图，显示皮质骨、未成熟骨、生物材料、树脂及背景的不同灰度水平。（D）沿线轮廓（C图中黄线）的灰度值变化，展示样品中不同材料的存在强度水平。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：样品切片与抛光。（A）树脂包埋的样品。（B）样品可能切片方式的示意图。切片可沿横向（蓝色矩形所示）或纵向（橙色矩形所示）进行。（C）胫骨缺损的纵向切面。（D-E）自制的圆筒系统，用于样品减薄与抛光。首先将样品粘附于内层实心圆柱体上，然后将该圆柱体插入空心的外层圆柱体中，使样品表面朝向砂纸。（F）组件组装方式的示意图。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：利用不同成像技术对缺损区域的相关性分析。 （A）缺损区域的微计算机X射线断层扫描（Microcomputed X-ray tomography）二维切片图像。生物材料（BM）碎片位于缺损中心，而与骨修复相关的骨小梁则靠近缺损边缘。 （B-D）样品抛光截面的光学显微镜分析。明场成像突出显示了生物材料碎片和骨组织。 （C）偏振光显微镜可区分愈合过程中原有的蓝色骨组织与新形成的橙色骨组织。使用了一块一级λ片，其高折射率方向与图中细长的蓝色线条平行。 （D）C图中选定区域的更高倍数图像。虚线圆圈显示了新生骨紧贴原有皮质骨生长的界面，但其中I型胶原纤维呈垂直排列（浅黄色区域）。 （E）二次电子（SE）模式下的扫描电子显微镜成像。 （F）用于切片-观察断层成像的沟槽铣削区域。沟槽内的亮区表示先前沉积铂以保护预定铣削区域的位置。 （G）沟槽断面显示生长中的骨小梁所呈现的骨形态。BM：生物材料。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6：图像滤波可校正聚焦离子束-扫描电子显微镜（FIB-SEM）伪影并增强特征区分度。（A-F）原始FIB-SEM图像显示出典型伪影，如帘状效应（A，箭头）和照明不均（A-B，星号）。通过依次应用FFT滤波（B）和阴影校正向导模块（C），这些伪影得以减弱。随后应用了对比度增强滤波（D）和非局部均值去噪滤波（E）。结果表明，与原始图像相比，最终处理后的图像中样品的内部特征更加清晰可辨（F）。请点击此处查看该图的放大版本。
图7：成像分割与三维模型展示。（A）可使用图像分析软件手动分割感兴趣特征。（B）若特征在像素强度上表现出足够差异，可应用基于阈值的分割方法。（C）分割后，生成三维渲染模型。可进一步利用软件中提供的分析模块（如“厚度图”模块），将测量参数（如小管直径）与渲染结构相关联。（D）将厚度图结果绘制为小管直径的频率直方图。平均直径为166.1 ± 60.66 nm。请点击此处查看该图的放大版本。
图 8：骨/生物材料界面的透射电子显微镜分析。（A）生物材料（BM）的一个碎片被矿化组织包围。由超薄切片引起的生物材料中的裂纹用箭头标出。（B-C）分别从对应于生物材料和矿化组织区域获得的选区电子衍射（SAED）图谱。（D-G）界面的能谱分析（EDS）。感兴趣区域显示在扫描透射电子显微镜（STEM）图像中（D），以及相应的磷（P）和钙（Ca；E-F）元素分布图。（G）成像区域的总体EDS谱显示了磷（P）和钙（Ca）的特征峰。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
已采用多种成像技术来研究骨组织结构，并评估生物材料在诱导骨整合方面的有效性7,21,22,23,24。在本实验方案中，我们建立了一套整合X射线显微断层扫描（microCT）、光学显微镜和电子显微镜的工作流程，用于分析在大鼠胫骨缺损植入生物材料后所形成的矿化骨组织。实施该工作流程需要大量投入，并依赖于专业仪器设备。尽管microCT和光学显微镜相对易于获取且数据采集时间适中，但高分辨率技术如聚焦离子束-扫描电子显微镜（FIB-SEM）断层成像、薄片制备以及透射电子显微镜（TEM）则需要更先进的设备。此外，切片-成像断层扫描的数据处理工作量大，单个数据集的处理可能耗时数月，尤其是在三维重建与图像分割阶段。然而，骨再生研究通常需要大量样本，因为生物学重复可能增加数据变异性，影响统计学的稳健性。为应对这一挑战，建议所有样本首先通过microCT进行初步的整体评估。该技术可对缺损愈合情况和生物材料性能进行快速、无损且可靠的评估25,26。在完成图像分割后，可在所有样本中定量分析生物材料和新生骨组织的体积，从而实现组间比较并评估实验重复性。基于microCT的分析结果，可进一步选择部分代表性样本，采用本方案中所述的后续成像技术进行更深入的分析。这种两步策略既在初筛阶段保证了足够的生物学重复，又实现了对代表性样本的多尺度综合表征。
重要的是，通过显微CT获得的骨小梁参数（如骨小梁厚度和骨小梁间角度），可为建立与力学测试结果的相关性模型提供有价值的数据27。先前的研究已成功将显微CT获取的体积信息与有限元分析相结合，用于估算骨折愈合组织的力学性能，证明了其在骨折愈合研究中的应用价值27,28,29,30。此外，Reznikov 等人的近期工作表明，量化骨小梁间角度可为骨小梁微观结构与正常运动功能之间关系提供重要见解31。该骨小梁间角度参数随后被用于评估在有或无纳米结构cHA/海藻酸钠微球存在条件下的骨再生情况。值得注意的是，在血凝块组和生物材料处理组中均观察到相似的骨小梁间角度模式，表明该生物材料在骨再生过程中不会干扰骨小梁骨的固有拓扑结构11。
本方案的一个优势在于其可适应性：该方法可根据不同类型的生物材料、解剖位置或动物模型进行定制。尽管本方案中展示的代表性结果基于CHA37样本的分析，但近期综述已广泛证明，本研究中所采用的技术同样适用于其他生物材料体系，包括钛基植入物和羟基磷灰石陶瓷支架6,18,19,32,33。本方案中使用的每种技术均有其独特优势，但也存在各自的方法学局限性。主要局限性包括与样本制备、伪影产生以及图像分辨率相关的问题，在解读每种技术所得数据时应予以充分考虑。一个主要难点在于同时评估样本中的矿物质成分和有机成分。在本方案中，我们重点分析了矿化组织。然而，样本中的一些有机成分也可被观察到。例如，在本研究采用的不同方法中均可识别出骨细胞陷窝。此外，使用醋酸铀对样本进行染色后处理，还可凸显样本中的有机部分，包括细胞内细胞器、未嵌入矿化组织中的细胞以及未矿化的胶原基质。
样本评估中的另一个关键局限性在于每种技术的分辨率限制。尽管使用X射线管的传统实验室显微CT（microCT）能够提供缺损区域骨再生的详细概览，但由于分辨率的限制，无法准确分辨骨细胞陷窝或早期编织骨的小梁样结构。在此类情况下，建议采用基于同步辐射的显微CT（SR-microCT）进行更高分辨率的分析34。
光学显微镜在识别骨/植入物界面方面具有更高的分辨率。偏振光显微镜的加入可进一步揭示胶原原纤维的取向，这一特征难以通过本方案中的其他技术观察到。经光学显微镜观察的同一区域可随后固定于样品台，用于扫描电子显微镜检测，从而实现对样品预定义区域的二维可视化。
针对样品中较小区域的分析，聚焦离子束-扫描电镜切片与成像断层扫描技术以及透射电子断层扫描技术可在纳米尺度上对界面进行详细评估。该分析对于区分小梁结构和水泥鞘结构具有重要意义35。此外，使用聚焦离子束-扫描电镜技术，无论是用于获取切片与成像断层图像，还是用于制备电子显微镜观察所需的薄片样品，均可使操作者自主选择样品中的感兴趣区域，从而实现对目标区域更具针对性的用户导向型分析19。
通过透射电子显微镜（TEM）可实现对样品更精细结构细节的观察。用于TEM的样品制备是研究植入性生物材料时的一个瓶颈。主要限制因素在于生物材料的硬度。例如，钛合金和陶瓷类生物材料无法使用超薄切片机中的金刚石刀进行切片。而较软的生物材料，如本研究中使用的水凝胶或羟基磷灰石/海藻酸盐微球，则可以进行切片。然而，即使在这些情况下，超薄切片也常常会产生诸如材料内部裂纹等假象36。图8A展示了超薄切片机切割后常见的一种典型切片假象。此外，尝试切割比树脂包埋细胞更硬的样品会缩短金刚石刀的使用寿命。基于上述原因，采用聚焦离子束-扫描电镜（FIB-SEM）制备薄片为评估骨/生物材料界面提供了一种优化的方法。与超薄切片技术相比，FIB-SEM能够以高空间精度靶向提取感兴趣区域，并造成最小的机械损伤。尽管FIB-SEM制备过程也会引入某些假象，如帘状效应、再沉积、离子注入和非晶化，但它仍是制备适用于TEM分析的硬质样品的有价值方法37。总体而言，FIB加工的切片区视场较小（约5 µm × 6 µm），而超薄切片的视场可达数百微米38。
透射电子显微镜（TEM）技术结合了纳米尺度的形貌分析与通过电子衍射及高分辨率透射电子显微镜（HRTEM）获得的晶体学信息。此外，还可利用能量色散X射线光谱（EDX）和电子能量损失谱（EELS）获取元素信息。尽管EDX可通过扫描电子显微镜（SEM）进行，但在扫描透射电子显微镜（STEM-EDX）中实施EDX可实现更高的空间分辨率39。此外，电子断层扫描技术可用于在纳米尺度上对骨/生物材料界面进行三维分析18,40。在此背景下，Grandfield 等人的研究通过将元素EDS分析与电子断层扫描相结合，探究了钛合金中骨/植入体界面的结构特征。该研究为骨组织与二氧化钛表面之间的界面提供了重要见解，展示了多模态关联分析方法如何揭示传统二维成像无法获取的微观结构特征41。
本研究采用的多模态工作流程提供了互补性的深入见解，这是单一成像技术无法实现的。如前所述，显微CT（microCT）是评估生物材料整体降解情况及缺损总体形态的重要方法。然而，对于骨-生物材料界面的精细尺度分析，聚焦离子束-扫描电镜（FIB-SEM）能够更有效地揭示微米级结构特征，并提升对界面处介观骨组织结构的识别能力。该关联分析策略的另一个关键方面在于偏振光显微镜与透射电镜（TEM）的结合应用。偏振光显微镜可显示胶原纤维的排列情况，从而评估有机成分，并识别与不同骨成熟阶段相关的取向偏好；而透射电镜则提供纳米尺度下矿物纳米颗粒的排列、尺寸和取向信息。通过这种结合，能够直接将组织层面的结构模式与底层矿物组织关联起来。这一整合视角凸显了骨/生物材料界面的层级结构如何在不同空间尺度上呈现，并展示了在统一的关联分析框架内整合光学、微结构和超微结构成像技术所具有的独特解释力。
综上所述，本文所述的成像技术有助于对骨的多级结构进行全面评估。通过整合这些方法，我们能够评估生物材料诱导形成有序矿化组织的能力，从而恢复原始骨的结构与功能。随着骨组织工程的发展，本方案所介绍的工作流程将成为验证生物材料的一种可靠方法。
披露
作者声明，他们不存在任何已知的相互竞争的经济利益或可能被认为影响本文所报告工作的个人关系。
致谢
本工作得到了以下巴西机构向作者提供的资助：国家科学技术发展委员会（CNPq/Brazil）和里约热内卢州卡洛斯·查加斯·菲略研究资助基金会（FAPERJ）。我们感谢LABNANO/CBPF和CENABIO/UFRJ提供的电子 显微镜设施。语言润色和语法修订使用了ChatGPT（OpenAI, GPT-5.1, 2025）完成。所有修改均经作者审阅并确认。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 丙酮 | Merck | 67-64-1 | |
| 铝制圆柱体 | 自制 | n/a | |
| Avizo 版本 2022.1 | ThermoFisher | n/a | 用于图像滤波、分割和三维可视化的软件 |
| 二甲胂酸钠三水合物 | Ted Pella | 18851 | 用于配制卡考基酸缓冲液的粉末，配制 0.2 M 储存液 |
| 粒径为 3 µm 的金刚石抛光剂 | Ted Pella | 895-8 | |
| 粒径为 6 µm 的金刚石抛光剂 | Ted Pella | 895-9 | |
| Diamond Wheel x.006 | South Bay Technology | DWH 3063 | |
| Diamond Wheel x.012 | South Bay Technology | DWH 4122 | |
| 毛毡抛光布 | Ted Pella | 816-20 | |
| 平底包埋胶囊 | EMS | 70021 | |
| 玻璃盖玻片 | Knittel | n/a | |
| 玻璃载玻片 | Knittel | n/a | |
| 戊二醛，25%，电镜级 | Ted Pella | 18426/18427 | |
| 金溅射仪 K550X | EMITECH | n/a | |
| ImageJ | 美国国立卫生研究院 (NIH) | 用于图像对齐、滤波、分割和三维可视化的软件 | |
| IMOD 版本 5.1 | 科罗拉多大学 | 用于图像对齐、分割和三维可视化的软件 | |
| 研磨与抛光机 | South Bay Technology | 型号 910 | |
| 低速金刚石轮切割机 | South Bay Technology | 型号 650 | |
| 低粘度包埋试剂盒 | EMS | 14300 | 用于 SPURR 树脂的试剂盒，按照产品说明书要求配制 |
| Micro-CT Skyscan 1273 | Bruker | n/a | |
| 显微镜 Jeol 2100F 200kV | Jeol | n/a | |
| 显微镜 Olympus BX51 | Olympus | n/a | |
| 显微镜 Tescan Lyra3 | Tescan | n/a | |
| 显微镜 Zeiss Axioplan | Zeiss | n/a | 配备一级 λ 波片 |
| 多聚甲醛，电镜级 | Sigma | P6148 | 用于配制甲醛溶液的粉末，配制 16% 储存液 |
| 塑料载玻片 | Exakt | 41500 | |
| QuickStick 135 粘合蜡 | South Bay Technology | n/a | |
| 砂纸 粒度 1200 | n/a | n/a | |
| 砂纸 粒度 2500 | n/a | n/a | |
| 砂纸 粒度 4100 | n/a | n/a | |
| 超级胶水 | Loctite | n/a | |
| 水溶性冷却液 | South Bay Technology | n/a | |
| Whatmann 1 号滤纸 | sigma | WHA1001150 |
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