评估骨再生与支架性能的多模态方法

摘要

我们提出了一种在多个层次水平上评估骨再生的实验方案。该多模态方法能够实现跨不同长度尺度的结构分析，有效解决了样本制备中的挑战，并为评价生物材料促进骨再生的效果提供了可靠的分析流程。

摘要

植入物的临床成功在很大程度上取决于其促进骨修复和实现骨整合的能力。尽管在新型支架的设计方面已取得显著进展，但针对植入物在不同骨组织尺度上的成功效果仍缺乏充分的系统性评估。骨是一种具有层级结构的组织，其结构复杂，从纳米和微米尺度的胶原原纤维排列及其矿化，到宏观尺度上密质骨与松质骨的排列，均呈现出多级次的组织特征。这种层级结构对维持骨的功能和力学性能至关重要。因此，全面评估生物材料在多个尺度上对骨修复的影响，对于判断植入材料的有效性和安全性至关重要。然而，制备适用于整合性多模态分析的样品仍面临技术挑战。在本研究中，我们提出了一种用于评估骨再生在不同层级水平上表现的实验方案，并分析新生骨组织与植入支架之间的界面。该方法为评估支架诱导骨修复的有效性提供了可靠的技术路径。结合选用的三维和二维成像技术，对于准确评估骨愈合过程中形成的复杂矿化组织具有关键作用。

引言

骨是一种复杂且具有层级结构的组织^1,2。理解其结构组织对于回答细胞如何参与组织架构以及结构变化如何影响力学功能等基本问题至关重要³。在这一背景下，损伤后骨的重塑仍是研究的核心课题。骨折愈合是一个复杂的多阶段过程，始于最初的炎症反应，随后发生血管生成以及前体细胞向软骨细胞和成骨细胞的分化^4,5。关于生物材料在促进骨整合中的作用，已有诸多讨论，特别是其生物相容性及其防止纤维包裹形成的能力⁶。

评估生物材料诱导骨整合的常用方法是光学显微镜，该方法可实现组织学的定量与定性分析。已有研究表明，该方法是评价骨植入物成功与否的一种可靠且有效的方式^7,8。然而，与骨组织层级结构相关的若干问题无法仅通过单一成像方法进行探究³，尤其是组织学方法，其至少在一定程度上受限于该技术的放大倍数限制。

三维成像技术的进步对于理解骨组织的层级结构至关重要。诸如显微....

方案

本方案中展示的结果来自先前一项研究中进行的实验程序²¹。所有操作均遵循巴西弗鲁米嫩塞联邦大学实验动物使用与护理伦理委员会（CEUA/UFF：779）的伦理指南。简言之，将20只雄性Wistar大鼠（体重介于300至400 g之间）随机分为两组：假手术组（Sham）和cHA-微球植入组。所有动物均接受手术，在胫骨干处制造一个2 mm的骨缺损。假手术组作为血凝块对照组，用于评估非临界性缺损中的骨再生情况，而实验组则在缺损部位植入CHA37微球。术后7天和21天，通过过量全身麻醉处死动物，并采集各组在两个时间点（7天和21天）的胫骨骨块。采用光学显微镜和显微CT评估骨质量及新生骨形成程度。

1. 样品固定与树脂包埋

1. 安乐死后立即取出含有植入生物材料的胫骨，并将其转移至含有Karnovsky固定液（2.5%戊二醛，4%甲醛溶于0.1 M卡考基酸盐缓冲液）的样品瓶中。将样品在-4 °C下保存至少1天。
   注意：配制和操作固定液时应在通风橱内进行，以避免接触挥发性物质。所有化学品操作必须使用适当的个人防护装备（PPE），并根据需要实施额外的技术安全措施。
2. 将样品从固定液转移至含有0.1 M卡考基酸盐缓冲液的样品瓶中。保持样品在缓慢旋转条件下，每隔10分钟更换缓冲液一次，共更换2次。在此阶段，使用小型锯子修剪样品边缘，以促进树脂渗透。切割样品时应始终保持其浸润在0.1 M卡考基酸盐缓冲液....

结果

对树脂包埋样品的初步分析采用显微计算机断层扫描（microCT）进行。这种非破坏性技术可实现对整个缺损区域的三维可视化，从而对样品进行定性和定量分析。microCT成像中的对比度主要来源于样品中不同材料的密度差异。图1展示了在大鼠胫骨非临界性缺损中植入CHA37生物材料后的microCT分析结果。该样品于植入后12周采集，并按照前述树脂包埋方案进行制备。microCT分析生成了一个三维模型，揭示了样品的内部结构（图3A-B），并可区分骨组织、生物材料、树脂以及新生骨组织（图3C-D）。通过分析体积、材料碎片分布以及小梁骨与生物材料所占相对体积等参数，我们能够在微米尺度上有效表征骨组织与材料之间的相互作用²⁴。作为此类分析的一个实例，Zelaya等人的研究

讨论

已采用多种成像技术来研究骨组织结构，并评估生物材料在诱导骨整合方面的有效性^{7,21,22,23,24}。在本实验方案中，我们建立了一套整合X射线显微断层扫描（microCT）、光学显微镜和电子显微镜的工作流程，用于分析在大鼠胫骨缺损植入生物材料后所形成的矿化骨组织。实施该工作流程需要大量投入，并依赖于专业仪器设备。尽管microCT和光学显微镜相对易于获取且数据采集时间适中，但高分辨率技术如聚焦离子束-扫描电子显微镜（FIB-SEM）断层成像、薄片制备以及透射电子显微镜（TEM）则需要更先进的设备。此外，切片-成像断层扫描的数据处理工作量大，单个数据集的处理可能耗时数月，尤其是在三维重建与图像分割阶段。然而，骨再生研究通常需要大量样本，因为生物学重复可能增加数据变异性，影响统计学的稳健性。为应对这一挑战，建议所有样本.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
丙酮	Merck	67-64-1
铝制圆柱体	自制	n/a
Avizo 版本 2022.1	ThermoFisher	n/a	用于图像滤波、分割和三维可视化的软件
二甲胂酸钠三水合物	Ted Pella	18851	用于配制卡考基酸缓冲液的粉末，配制 0.2 M 储存液
粒径为 3 µm 的金刚石抛光剂	Ted Pella	895-8
粒径为 6 µm 的金刚石抛光剂	Ted Pella	895-9
Diamond Wheel x.006	South Bay Technology	DWH 3063
Diamond Wheel x.012	South Bay Technology	DWH 4122
毛毡抛光布	Ted Pella	816-20
平底包埋胶囊	EMS	70021
玻璃盖玻片	Knittel	n/a
玻璃载玻片	Knittel	n/a
戊二醛，25%，电镜级	Ted Pella	18426/18427
金溅射仪 K550X	EMITECH	n/a
ImageJ	美国国立卫生研究院 (NIH)		用于图像对齐、滤波、分割和三维可视化的软件
IMOD 版本 5.1	科罗拉多大学		用于图像对齐、分割和三维可视化的软件
研磨与抛光机	South Bay Technology	型号 910
低速金刚石轮切割机	South Bay Technology	型号 650
低粘度包埋试剂盒	EMS	14300	用于 SPURR 树脂的试剂盒，按照产品说明书要求配制
Micro-CT Skyscan 1273	Bruker	n/a
显微镜 Jeol 2100F 200kV	Jeol	n/a
显微镜 Olympus BX51	Olympus	n/a
显微镜 Tescan Lyra3	Tescan	n/a
显微镜 Zeiss Axioplan	Zeiss	n/a	配备一级 λ 波片
多聚甲醛，电镜级	Sigma	P6148	用于配制甲醛溶液的粉末，配制 16% 储存液
塑料载玻片	Exakt	41500
QuickStick 135 粘合蜡	South Bay Technology	n/a
砂纸 粒度 1200	n/a	n/a
砂纸 粒度 2500	n/a	n/a
砂纸 粒度 4100	n/a	n/a
超级胶水	Loctite	n/a
水溶性冷却液	South Bay Technology	n/a
Whatmann 1 号滤纸	sigma	WHA1001150