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方法文章

低成本3D打印微流控设备用于快速原型制作及生物应用

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DOI：

10.3791/69494

⸱

2026年3月20日

 ,  , 
1Department of Biology, University of Saskatchewan

本文内容

摘要

我们开发了一种低成本、可3D打印的微流控装置，以及一套基于开源Python的软件，能够生成可编程的浓度梯度。我们通过渗透压测定和比色分析验证了该可定制化平台，可实现可重复的渗透暴露研究和生物医学检测，所用材料成本低于5美元，并可使用消费级3D打印技术制备。

摘要

微流控设备能够精确控制溶液混合和梯度生成，这在低温生物学和生物医学研究中的细胞实验中至关重要。然而，传统的制造方法耗时长、成本高，且需要专业技能，限制了其普及应用。为解决这些问题，我们开发了一种经济高效、可靠且完全采用3D打印技术的微流控设备工作流程，利用消费级打印机和生物相容性光敏树脂，实现快速且低成本的原型制作。本文以一种可生成可编程浓度梯度和溶液组合的流体混合装置为例，展示了该工作流程。商用混合装置每台价格超过300美元，且无法定制。通过使用低成本的树脂材料，并结合创新的开放式通道设计（以透明胶带密封），我们克服了通道堵塞等常见制造难题，实现了复杂微流控结构的快速、可重复制造，材料成本低于5美元。本文展示了该工作流程，通过集成双注射泵，生成从等渗（~300 mOsm/kg）到高渗（~9,000 mOsm/kg）的线性渗透梯度，并在设定的时间间隔内恢复至等渗状态。为确保实验的自动化和可重复性，我们开发了一款基于Python的开源软件工具，可精确调控注射泵的启动、流速和梯度持续时间。通过连续的渗透压测量验证了该设备的性能，结果证实了梯度生成的线性和准确性；同时通过比色法测量验证了混合效率。这一易于获取且成本低廉的微流控平台显著提高了渗透暴露研究的可重复性，在药物筛选和精确化学调控等多种生物医学应用中展现出广阔前景。

引言

微流控装置在生物医学研究、低温生物学及其他诊断应用中，对于细胞实验、渗透压应激研究以及药物给药实验中的浓度和化学环境控制已变得至关重要1,2这些装置能够精确控制微米尺度下的流体流动和浓度。例如，在细胞冷冻保存过程中，微流控装置已被用于添加和去除冷冻保护剂，以防止渗透压损伤。3同样，这些微流控装置也可用于制备抗生素的系列稀释液，以检测抗性微生物的抗菌敏感性4这有助于鉴定治疗耐药性微生物（AMR）感染的最佳药物组合。此外，该方法支持活细胞成像与实时监测，减少试剂消耗，并实现更精确的浓度梯度控制，相比之下，宏观技术（如Boyden小室）仅能提供较粗糙且静态的浓度梯度，且无法进行细胞的实时监测。1,5这些能力能够实现模拟 在体类化学环境 体外 用于细胞行为、细胞迁移、细胞侵袭实验、药物反应及毒性测试的高分辨率研究。

尽管微流控装置具有诸多优势，但其传统的微加工技术（例如光刻和聚二甲基硅氧烷（PDMS） molding）通常耗时较长、成本高昂，且需要专门的设备和技术 expertise6。因此，通过软光刻技术制造新装置可能需要数天的工作时间，而反复的设计修改也十分耗费人力6。近年来，3D打印已成为一种快速原型制作的替代方案，以克服这些限制。然而，早期3D打印微流控技术的应用受限于高分辨率打印机的成本（通常≥10,000美元），而价格较低的设备又无法提供足够的分辨率7。基于低成本LCD的立体光刻技术的进步显著推动了该领域的发展，因为消费级打印机（通常约150-500美元）现在可提供微米级（约20-50 µm）分辨率，足以满足许多微流控应用的需求5。鉴于这些进展，本研究的总体目标是建立一种经济高效且高效的全3D打印微流控装置工作流程，能够在无需复杂制造工艺障碍的情况下生成可控的浓度梯度8。我们旨在利用消费级LCD 3D打印机和生物相容性树脂，开发一种快速且可靠的定制化微流控模型系统制备方法，使其能够被广泛的研究实验室所采用。

本文介绍了一种可进行溶液混合、生成连续且可编程浓度梯度，并形成溶液组合与可编程浓度梯度的3D打印微流控装置。该装置通过桌面式立体光刻技术制造并完成整体组装，采用开放式通道设计，并用透明粘合膜完全密封。树脂引发的通道堵塞是微流控立体光刻中广泛报道的技术难题9,10；然而，本方法无需特殊表面处理或键合设备，即可制备出坚固且不漏液的微流控装置，并克服了打印过程中未固化树脂堵塞微小通道的常见问题11。此外，通过使用低成本的紫外光固化树脂，每个装置的材料成本仅需数美元，可快速批量生产。另一优势在于其设计并非固定不变，可轻松修改并重新打印，而商用装置每台需数百美元且无法定制12,13,14。

为了控制溶液浓度，将3D打印装置与双注射泵（每种输入溶液各一个）集成，并通过开源Python脚本进行控制，该方法此前已在微流控应用中描述过15。这使得能够以自动化方式精确调控流速、梯度变化步长和时间进程。15 在本系统中，流速通常为每个入口每分钟几微升至30 µl/min，在此范围内始终实现了均匀混合，同时保持极低的剪切应力。利用该系统，我们在设定的时间间隔内生成了从接近等渗（~300 mOsm/kg）到极端高渗（~9,000 mOsm/kg）再回到等渗状态的线性浓度梯度。连续的渗透压测量结果证实所生成的梯度具有线性且准确的特性，而简单的比色分析则验证了输入溶液的有效混合。这些结果表明，使用我们完全3D打印的平台可重复地实现复杂且随时间变化的浓度梯度，突显出该平台在显著降低常规成本的同时，提升渗透暴露研究通量和标准化水平的潜力。

这种3D打印的微流控平台展示了近年来向“"芯片实验室"解决方案迈进的重要进展，其分辨率足以满足许多基于细胞的微流控应用需求16,17。此外，专家预测，随着打印机技术和材料的持续进步，增材制造有望成为微器件制造的主要方法6。本方法的一个关键优势在于，可及性并未以牺牲性能为代价。与先前报道的低成本微流控器件制备策略一致18,19，这些经济型打印机所制造的器件在可靠性和精度方面可媲美许多商用工业级系统7。因此，研究人员可以充分信赖该方法，确信其能够满足大多数应用对精度的要求。该平台可根据多种需求进行定制，例如实现多步冷冻保护剂添加/去除的自动化、筛选药物在不同浓度范围内的反应，以及在器官芯片模型中实现精确的化学调控16。特别是，打印分辨率（约100 µm的通道尺寸）足以满足多种生物检测的需求16，适用于典型的细胞或颗粒尺度范围。总之，通过显著缩短制造时间、降低成本并减少对专业技术的要求，这种完全3D打印的微流控平台使研究人员能够高效地设计和实施定制化的微流控解决方案。尽管仍需手动后处理步骤（如表面抛光和胶带密封），但与传统微加工方法相比，整体工作流程仍具有良好的可及性和时间效益。

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方案

1. 设计微流控混合芯片

  1. 使用合适的 CAD 软件（例如 AutoCAD 3D 或 TinkerCAD，AutoDesk, Inc），设计一个具有双通道入口和混合 Y 形结的蛇形微通道，随后设置一段通道路径，以促进有效混合并提供足够的通道长度用于扩散。将各个通道元件合并为一个单一区域。
  2. 创建一个矩形载玻片（85 mm × 28 mm × 3 mm）作为基底基板。然后，从载玻片顶面减去先前设计的蛇形微通道，形成具有适当深度和宽度的开放式通道结构。
  3. 将每个螺纹连接端口（1/4″-28 UNF）作为独立特征创建，用于 1/16″ 外径管，然后将其与载玻片主体合并，确保内部 UNF 螺纹与接头精确匹配。

2. 准备打印设计

  1. 为准备 3D 打印过程，将设计好的微流控芯片组件的 STL 文件导入开源切片软件中，例如 CHITUBOX Basic v2.3.1（Shenzhen CBD Technology Co. Ltd，中国）。
  2. 在切片软件中加载打印机专用的预设配置和树脂参数文件（Phrozen_Sonic_Mini_8K_Power_Resin_SG_00.cfgx）。通过以下路径从随附的 GitHub 仓库导入完整的打印机和树脂设置文件：切片设置 > 导入设置。
    注意：完整的 3D 树脂打印指南不在本研究范围之内；然而，大多数 3D 打印机制造商均提供了关于如何调整树脂参数以及优化打印位置以确保成功打印的指导，例如： https://phrozen3d.com/blogs/tutorials/resin-print-failures。
  3. 将模型方向相对于构建平台调整至约 45–50°（本例中使用 46.67°），以获得最佳打印效果。此位置可防止打印过程中出现吸力问题，并保持微小通道和孔洞畅通。
    注意：导入混合芯片的 STL 文件后，芯片将平放在打印表面上。随后必须旋转芯片方向，以便树脂顺利排出，并最大限度减少因中空结构在平坦表面上成形而产生的压力差风险。
  4. 使用切片软件中的自动支撑功能为芯片添加结构支撑。确保在 Chitubox 主窗口中可见的打印头方向上，通道面朝外。然后，使用 Chitubox 主屏幕左侧的平移按钮和菜单，将芯片与打印平台之间的距离增加至 5 mm。该间隙将用于容纳支撑结构以及打印件的支撑筏。
  5. 随后手动添加额外支撑，在最靠近打印头的位置增加支撑件密度，并在芯片两侧均添加支撑，以确保部件在穿过高粘性树脂被抬升时保持静止状态。
  6. 仔细检查自动生成的支撑结构，并根据需要手动添加额外支撑，以增强稳定性，特别是在边缘和通道等复杂结构周围。
  7. 对模型进行切片，并仔细检查每一层，确保切片之间无可见间隙。
  8. 通过以下路径点击孤岛检测按钮：切片 > 孤岛检测，以识别可能导致打印错误的未支撑区域。若检测到孤立区域，则需重复切片过程。
  9. 当模型通过孤岛检测且未发现孤立区域后，将准备好的模型文件保存为".ctb"格式并存储至 U 盘，即可用于 3D 打印。
    注意：树脂参数根据制造商建议导入，并使用制造商提供的 XP Finder 模型进行测试，该模型可在以下网址获取： https://phrozen3d.com/pages/phrozens-xp-finder-and-rp-tester-test-model-download-and-tutorials。由于参数可能因实验室环境条件和不同打印机而异，因此测试这些设置并在必要时根据实验室内部条件进行调整至关重要。完整的打印机与树脂设置文件，连同所有代码及文中提及的 .stl 文件，均可在本文随附的 GitHub 仓库中找到。请注意，打印过程中也可能发生收缩和翘曲现象。这可在一定程度上通过调整树脂参数、打印角度以及支撑柱分布来补偿，以适应实验室环境条件。此外，芯片的透明度受每层成形角度的显著影响；但由于该芯片仅用于混合而非成像，因此只需确保足够的光学清晰度以进行混合过程中的比色分析即可。为此，需确保芯片底部相对于打印头平台的角度在 20 至 60 度之间。本例中采用 46.67 度的角度，因为该角度基于层间对齐提供了较高的光学清晰度，同时又不至于过陡而导致打印过程中出现无支撑结构的问题，这一点已通过切片界面中点击切片按钮后出现的 Chitubox 孤岛检测功能验证。 

3. 打印与后处理

  1. 选择与微流控载玻片和连接器组件对应的.ctb文件，并启动打印任务。
    注意：尽管消费级基于树脂的3D打印机设计用于家庭环境，但树脂材料可能释放潜在有害的挥发性有机化合物（VOCs）。因此，建议在化学通风橱内或通风良好的区域操作3D打印机。
  2. 定期监控打印过程。根据树脂特性和打印机速度，该设计的典型打印时间约为3–4小时。
  3. 打印完成后，使用塑料刮刀小心地从构建平台上取下打印件，并立即用90%乙醇喷洒模型以去除未固化的树脂。
    注意：未固化的树脂可能导致严重的化学灼伤。在设备完全固化和清洁前，操作时务必佩戴适当个人防护装备（PPE），包括手套、实验服和护目镜。用于清洗打印样品的乙醇应在通风良好的区域处理，并确保佩戴包括手套和眼部防护在内的个人防护装备。
  4. 在打印件仍较柔软时，检查所有小孔、通道和螺纹区域是否畅通且可接触。如有必要，可轻轻使用小工具（如移液器吸头或细针头）清理部分堵塞或阻塞的区域。使用压缩空气或装有乙醇的注射器冲洗通道，确认其通畅性。
  5. 将打印模型完全浸入99%乙醇中2–3分钟，以溶解残留的未固化树脂，并确保所有微通道和缝隙得到彻底清洁。
  6. 将清洁后的打印件放入紫外光固化箱中。每侧均匀暴露于紫外光下约30秒，以实现均匀固化，防止翘曲并确保尺寸稳定性。
    注意：进行紫外光固化操作时，务必佩戴防紫外线安全护目镜，以防眼睛损伤。
    注：固化箱内含高强度405 nm灯。由于部件大部分透明且灯管位于部件上方10 cm处，因此固化速度较快。实验不同光照时间表明，光照6秒后旋转部件3秒是有效的。制造商建议使用医用固化站分别设置为30分钟和空白分钟进行固化。
  7. 固化后，将打印件短暂浸入或用乙醇冲洗，然后将其放入含有乙醇的密封自封袋中，以防止干燥及树脂在非预期区域硬化。
  8. 将装有乙醇和已固化模型的密封袋放入超声波清洗机中，超声处理180秒，以有效去除任何残留的未固化树脂或污染物。
    注：也可使用市售的清洗-固化一体站，以实现各实验室间后处理流程的标准化。
  9. 超声处理后，用去离子水彻底冲洗打印设备。
  10. 通过再次喷洒并浸入90%乙醇中，进行最终清洁步骤。如有必要，重复超声清洗180秒，以确保完全洁净。
  11. 后固化完成后，使用440目砂纸小心打磨部件表面。对将插入混合载玻片的螺纹连接器进行相同的后固化处理，需注意的是，3个连接器在打印、清洗和后固化过程中应并排放置于打印机平台、后固化箱及含乙醇的自封袋中，以同时处理。再次用去离子水冲洗，并使其自然晾干或用压缩空气轻轻吹干以去除残留水分。
    注：打印过程的分步图像见补充图1。

4. 微流控通道的表面抛光与封合

  1. 为实现良好的可视化效果和密封性，使用玻璃磨石对微流控载玻片表面进行抛光处理。
  2. 首先使用2.45微米（6000目）玻璃磨石（磨粒范围约1.5–2.3 µm）对载玻片上表面进行抛光，直至表面均匀光滑；随后使用更细的0.92微米（16000目）磨石（磨粒范围约0.76–1.5 µm）进一步提高表面光洁度。这将确保获得更加平滑的表面（补充图2）。
  3. 使用透明防水补丁和密封胶带对微通道进行密封。确保胶带完全覆盖整个通道区域，同时保持连接孔和端口畅通无阻（见图1）。
  4. 首先从载玻片一侧开始粘贴胶带，然后用拇指轻轻但牢固地按压，以确保粘贴均匀并排除气泡。
  5. 使用锋利的剪刀或刀片修剪载玻片边缘多余的胶带，确保连接器部位被整齐切割且功能完好。
  6. 将贴好胶带的载玻片在60 °C下烘烤30分钟，以增强粘合强度。
  7. 冷却后，在连接器与载玻片边缘接触处涂抹瞬干胶凝胶。胶水固化过程中对每个连接器施加轻微压力，以确保正确对齐，便于后续进行可靠的管路连接和流体操作。
    注：具有足够光学透明性的打印器件代表性图像见补充图3。

5. 流体流动装置的设置与测试

  1. 将所需的测试溶液分别装入两个独立的注射器中（标记为注射器 A 和注射器 B；图1）。用于生成梯度时，使用两种溶液：（i）等渗溶液，成分为磷酸盐缓冲盐水（PBS）；（ii）高渗溶液，成分为在 PBS 中配制的 40%（v/v）二甲基亚砜（DMSO）和 1.2 M 氯化钠（NaCl）。
    注意：该装置可在定义的时间间隔内，生成从约等渗（~300 mOsm/kg）到极端高渗（~9,000 mOsm/kg）再回到等渗状态的线性浓度梯度。
  2. 使用精密气密玻璃注射器，以实现准确的流体流动控制和压力调节。使用 1/4″-28 接头、卡套和 1/16″ 外径 PEEK 管路将注射器连接至载玻片。
  3. 在将注射器和管路牢固连接至微流控装置后，将注射器安装到可编程精密注射泵上。
  4. 使用提供的网线将两个注射泵（泵 A 和泵 B）相互连接，确保同步运行。
  5. 使用 RS232 电缆将泵 A 连接到计算机的串行端口。
  6. 在微流控装置下游设置泵 C，并将其置于抽吸模式，以维持稳定流动并防止压力积聚。
  7. 运行基于 Python 的脚本，以精确控制注射泵的流体流动。该脚本将控制泵 A 和泵 B，生成从等渗到高渗条件的线性渗透梯度，随后在用户定义的时间间隔内恢复至等渗条件。
  8. 在 Python 软件中调整实验参数，如流速、梯度间隔和总运行时间，以根据特定检测需求定制实验条件。

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结果

图1 展示了我们设备的整体装置

微流控混合装置示意图；注射泵，Python 控制，通过培养基交换进行细胞检测。
图 1：系统装置示意图。从左至右，基于 Python 的控制软件通过调节注射泵 A 和 B 的泵送速率，生成精确的时间-浓度曲线。液体从玻璃注射器经聚醚醚酮（PEEK）管路输送，在3D打印的微流控混合器中进行混合。生成的时间-浓度曲线用于市售微流控细胞培养系统中的检测实验，随后使用第三个注射泵将培养基从系统中抽出。

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讨论

微流控混合室通常是采用预设配置制造的昂贵组件。本文展示了快速原型技术和定制代码如何使实验室能够快速开发混合室，从而促进多种多样的实验装置的建立。

我们通过比色分析和渗透压测定来验证混合的完全性。进一步将渗透压测量结果与基于混合物浓度计算的理论值进行比较。比色分析和渗透压测定结果表明，该载片在混合效果方面与商用载片性能相当。该载片的材料成本比市售替代产品低两个数量级，但仍可实现同等的混合效果。

该载片使用生物相容性树脂打印，并用基于乙烯共聚物的胶带进行密封。此前已有报道使用树脂制造并粘附于玻璃的类似微流控载片，但这些载片是通过高端商用3D打印技术制备的17。本文在此前大量研究工作1,5,17的基础上进一步证明，如今微流控结构的分辨率已完全可由价格较低的消费级设备实现。载片的打印经历了多次设计-测试...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由加拿大自然科学与工程研究理事会（RGPIN-2023-04007）和加拿大卫生研究院（PJT-175283）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1/16” OD PEEK 毛细管 – 65 µ毫米内径IDEX Health and Science，美国货号：ID-15601.5 米，切成更小的段。购自 Darwin Microfluidics
3D打印机UV树脂固化灯 – 230 V 405 nmSkouphy，中国用作后固化站，将树脂部件放入白色泡沫箱中约6秒
3个耐压1/4-28 UNF玻璃注射器 – 5 mL汉密尔顿，美国货号：HM-101036641/4-28 接头可连接 1/16” PEEK 管。购自 Darwin Microfluidics
二甲基亚砜（DMSO），符合美国化学会（ACS）标准Fisher Scientific，美国货号：D128-1购自 Fisher Scientific
ELITechGroup 校准标准品，850 mOsm/kgELITechGroup，美国VCAT：SS-277，货号：NC1876875购自 Fisher Scientific
ELITechGroup 校准标准品，300 mOsm/kgELITechGroup，美国VCAT：SS-276，货号：NC1876872购自 Fisher Scientific
无法兰PFA接头 &和 ETFE 卡套 1/4”-28 至 1/16” IDEX Health and Science，美国SKU: ID-XP-245X10 个装，购自 Darwin Microfluidics
食用色素加拿大俱乐部屋
FreezePoint 6000P 冰点渗透压仪ELITechGroup，美国型号：6000P
FreezePoint 测量容器ELITechGroup，美国VCAT：SS-279，货号：NC1876881购自 Fisher Scientific
Gorilla 超级胶水凝胶 美国Gorilla Glue公司https://gorillatough.com/product/gorilla-super-glue-gel/
鱼骨形混合器 - 玻璃芯片小物件工厂货号：LTF-012.00-4264购自 Darwin Microfluidics
高渗培养基 - 40% DMSO (v/v) 加 1.2 M NaCl实验室制备
Ibidi µ-滑片 VI 0.4 – ibiTreatIbidi，德国货号：80606
等渗培养基 - Cytiva HyClone 磷酸盐缓冲液（PBS）Cytiva，美国货号：SH3025601购自 Fisher Scientific
Motic 体视显微镜Motic，中国香港模型：  SMZ-168 TLED
NE1000 SyringONE 注射泵美国 New Era 泵系统公司型号：1010-US购自 New Era Pump Systems Inc.
Phrozen Sonic Mini 8k 树脂3D打印机Phrozen Tech Co., LTD. 中国台湾Phrozen Sonic Mini 8k
泵与电脑之间的 RS-232 主网络电缆美国 New Era 泵系统公司型号：CBL-PC-PUMP-7（7 英尺电缆）9针串口转RS232转换器，购自New Era Pump Systems Inc.
泵对泵二级网络电缆美国新纪元泵系统公司型号：CBL-NET-7（7 英尺线缆）RS232 电缆，购自 New Era Pump Systems Inc.
树脂 - PowerResins 外科导板树脂 1000 GRPowerResins，3BFab Inc，Tü土耳其REF: PSG-03-C
RS-232 转 USB 转换电缆Prolific Technology，中国台湾型号：CBL-USB232购自 New Era Pump Systems Inc.
封片密封胶带 - 晶透装强力胶带 1.88” x 9 码美国Gorilla Glue公司
氯化钠（NaCl）EMD Millipore，MilliporeSigma，德国货号：M1064041000购自 Fisher Scientific

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3D打印微流控梯度生成溶液混合注射泵渗透梯度生物医学应用开放式通道设计Python自动化

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