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方法文章

新生小鼠卵巢培养与整体染色卵泡定量：一种高效方法 体外 研究原始卵泡调控的方法

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DOI：

10.3791/69498

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2025年12月19日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics, Gynecology, and Women's Health, University of Missouri School of Medicine, 2Division of Biological Sciences, University of Missouri

本文内容

摘要

本研究介绍了在膜插件上培养出生后小鼠卵巢以及对整个卵巢进行全封片卵泡定量的实验方案。结果表明，卵巢培养过程中的技术操作会显著影响原始卵泡计数，凸显了保持操作一致性的必要性，以尽量减少非生物学因素引起的变异。

摘要

在雌性哺乳动物中，原始卵泡在胎儿期卵巢发育过程中形成，并作为维持成年卵巢功能的唯一来源。原始卵泡如何组装、维持静息状态、启动卵泡发育以及发生细胞死亡的机制，对于理解卵巢生理及病理状况具有重要意义。本研究介绍了一种将出生后小鼠卵巢置于膜插件上进行培养的实验方案，该方法可实现完整卵巢的体外培养及药物处理，培养时间最长可达10天，具体时长取决于卵巢的发育阶段。通过将含有培养卵巢的插件在培养板的不同孔之间转移，即可实现培养条件的改变，从而避免在培养过程中对组织造成物理干扰。以P5期卵巢为例，将其分离后置于24孔板中的12 mm插件上进行培养。每个卵巢被置于一滴添加了10%胎牛血清（FBS）、3 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）、10 mIU/mL促卵泡激素（FSH）以及抗生素-抗真菌剂的DMEM/F12培养基液滴中，并轻柔地固定在 膜插件表面。每两天更换一次培养基，总培养时间为五天。培养结束后，卵巢组织用4%多聚甲醛固定2小时，并进行全组织免疫荧光染色，检测卵母细胞标志物DDX4的表达。根据卵母细胞大小及体性卵泡细胞的核形态对卵泡进行分期和定量分析。结果表明，卵巢组织在膜插件上的正确放置位置显著影响每个卵巢中原始卵泡的数量。此外，每个插件上放置卵巢数量的差异可能引入非生物学性变异，应予以避免。

引言

卵子发生是一个高度受调控且复杂的过程，最终产生成熟的卵母细胞。在哺乳动物中，卵子发生在胎儿卵巢中启动，原始生殖细胞（PGCs）在此分化为初级卵母细胞。每个初级卵母细胞被一层扁平的前颗粒细胞包裹，形成原始卵泡。大多数原始卵泡在形成后进入静止状态，构成卵巢储备1,2,3。在成年卵巢中，原始卵泡周期性地被激活并进入卵泡发育过程，这一过程称为卵泡发生，对于维持成熟卵母细胞和卵巢类固醇激素的生成至关重要4,5。在缺乏激活信号的情况下，人类的原始卵泡可保持静止长达50年。这种长期的静止状态可能导致卵母细胞质量下降，并加剧衰老卵巢中原始卵泡的丢失速率6。目前仍不清楚的是，特定群体的卵泡如何被选择性激活，而其他卵泡则保持静止并经历周期性的细胞死亡，其潜在机制仍是未解之谜。

卵子发生过程在哺乳动物中高度保守，因此小鼠是研究哺乳动物卵子发生的理想模型7。在小鼠中，原始卵泡的形成在出生后第4天（P4）完成。少量原始卵泡在形成后立即进入卵泡发育阶段。在卵泡发育过程中，由于器官发生增强以及mRNA和蛋白质合成增加，卵母细胞体积增大4。扁平的颗粒细胞转变为立方状颗粒细胞，并开始增殖8。这些发育中的卵泡在约第21天成长至排卵阶段，此时雌性小鼠达到青春期。出生后卵巢中的这一卵泡发育阶段通常被称为“首次卵泡发生波”。由于首次卵泡发生波与后续卵泡发育过程高度相似，出生后的小鼠卵巢为研究原始卵泡调控机制及卵巢卵泡发生提供了理想的模型9。

卵巢卵泡的分类主要基于卵泡体细胞的细胞核形态以及卵母细胞的大小。在小鼠卵巢中，静止的原始卵泡由单层扁平的前颗粒细胞包裹一个直径约为20 µm的初级卵母细胞构成。发育中的卵泡可分为初级卵泡、次级卵泡、三级卵泡和腔前卵泡。初级卵泡包含一个直径通常超过25 µm的卵母细胞，其周围为单层立方状颗粒细胞（补充图1）。次级卵泡具有两层颗粒细胞，而三级卵泡则包含三层或更多层的颗粒细胞。腔前卵泡比三级卵泡更大，具有多层颗粒细胞，并含有一个充满液体的腔隙，称为卵泡腔。随着卵泡的发育，卵母细胞体积逐渐增大，在排卵时可达约80 µm。此外，发育中的卵泡外周还环绕着数层薄的膜细胞，位于颗粒细胞层外侧10,11,12。

小鼠出生后卵巢体积相对较小，使得全卵巢培养成为一种可行的研究方法。该方法能够有效支持在完整卵巢内研究卵巢及卵泡发育，既保留了卵巢的物理和生理微环境，又最大限度减少了周围组织的干扰。12这种方法使得进行那些在常规条件下难以开展的实验成为可能 体内 模型。示例包括卵巢发育的活体成像、时间可控的多药物处理，以及通过培养基蛋白质谱分析卵巢分泌活性13,14此外，通过共培养实验，该方法还可用于研究分泌因子在无直接细胞间相互作用条件下的影响。在这些实验中，不同类型的组织可置于同一培养基中的独立膜插件上。15此外，使用条件性 基因敲除小鼠卵巢 体外 有助于阐明原始卵泡激活与生长的关键机制。

本文介绍了使用膜插件培养出生后小鼠卵巢以及对整个卵巢进行完整装片卵泡计数的方法（图1）。文中所述技术包括：1）新生小鼠卵巢的解剖，2）新生小鼠卵巢的培养，3）培养过程中的培养基更换，4）组织固定与完整装片抗体染色，以及5）组织成像与卵泡定量分析。此外，本研究采用阿霉素（doxorubicin）实验性诱导原始卵泡丢失，建立了一种用于研究卵巢储备耗竭机制的模型。结果表明，每个插件中培养的卵巢数量及其在插件内的位置会影响原始卵泡的计数结果。这凸显了在培养过程中保持一致实验设置的重要性，以避免实验结果中出现非生物学因素导致的变异。

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方案

CD-1 雄性和雌性小鼠以 1:1 的比例同笼饲养作为繁殖配对。新生幼崽的出生日期被定义为出生后第 0 天。所有动物实验均经机构动物护理 & 使用委员会（IACUC），密苏里大学（方案编号：36647）。

1. 试剂与培养基

  1. 本研究中使用的所有试剂均列于材料表中。在卵巢培养前，请准备好所有材料和培养基。
  2. 培养基：配制约 5 mL 的 DMEM/F-12 培养基，添加 3 mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）、10% 胎牛血清（FBS）和 10 mIU/mL 促卵泡激素（FSH）。
    注意：应将 BSA（30 mg/mL）、FBS 和 FSH 储液（10 IU/mL）加入 DMEM/F-12 培养基中，现用现配。将培养基置于培养皿中，在 37 °C、5% CO2 的培养箱中平衡约 30 分钟。储液于 -20 °C 保存，使用前立即解冻。将储液分装成适当体积，避免反复冻融。

2. 卵巢培养

  1. 通过断头法处死 P5 雌性小鼠。使用手术剪和镊子取出卵巢及其附着的包膜组织。将卵巢置于含有预冷的含抗生素-抗真菌剂的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）的 60 mm 培养皿中（图 2A，B）。
  2. 在体视显微镜下，使用一对胰岛素注射器（1 mL）解剖并去除卵巢上的包膜组织（图 2C，D）。用 1 mL 移液器将卵巢转移至含有 3 mL 培养基的 30 mm 培养皿中，并将培养皿放入 CO2 培养箱中。
    注意：避免刺破或挤压卵巢。使用胰岛素注射器在卵巢包膜上做干净且均匀的切口以释放卵巢。预先在移液器吸头中吸入约 50 µL 培养基，将吸头靠近卵巢，然后将其吸入吸头中进行转移。
  3. 在超净工作台内，通过在每个孔中加入 400 µL 培养基并放置一个插入式培养小室来准备培养板（图 2E，E'）。培养基位于插入式小室外侧，当插入式小室的膜被培养基浸润后会变为不透明。
  4. 对于进行 24 小时多西环素（Dox）处理的培养，通过将 Dox 储液（10 mg/mL）用培养基稀释，新鲜配制含 0.1 mg/mL Dox 的培养基。
    注意：含多西环素的培养基应根据机构生物安全及环境健康与安全委员会的指南妥善处理。
  5. 在体视显微镜下，使用 1 mL 移液器将最多三个卵巢转移至插入式小室中（图 2F，G）。尽量减少带入插入式小室的培养基量，并在转移后立即去除多余培养基。当卵巢被轻柔地放置于插入式小室内后，使用 200 µL 移液器将约 200 µL 培养基从孔中转移至插入式小室内，确保膜表面完全被培养基覆盖。随后将培养基重新移回孔中，并将卵巢居中于膜上。在居中操作时，应先用培养基填充移液器吸头，以防止卵巢被吸入吸头内。确保卵巢之间留有足够空间，并稳定附着在插入式小室的膜上（图 2H），而不是悬浮在培养基中（图 2I）。操作时注意不要刺破卵巢或膜。
  6. 在为期 5 天的培养过程中，每隔两天更换一次培养基：从孔中移除 200 µL 培养基（总量的一半），并向孔中添加 200 µL 新鲜培养基（图 2J）。
  7. 对于进行 24 小时药物处理的培养，在初始培养 24 小时后，按照以下步骤将带有卵巢的插入式小室转移至含有 400 µL 新鲜培养基的新孔中：
    1. 使用一对镊子将含有卵巢的插入式小室从孔中取出。
    2. 将插入式小室底部短暂浸入装有新鲜培养基的 60 mm 培养皿中进行冲洗。
    3. 将插入式小室底部轻轻敲击于空的 60 mm 培养皿上，以去除插入式小室上的多余培养基。然后将插入式小室放入含有新鲜培养基的孔中。
      注意：在更换培养基或转移插入式小室后，应去除插入式小室上的多余培养基，以确保卵巢立即稳定附着在膜上。

3. 固定与整体免疫染色

  1. 为固定培养的卵巢，使用镊子将插入物从培养板中取出，并放入含有5 mL DPBS的60 mm培养皿中。在卵巢旁加入约100 µL DPBS，使用1 mL移液器重悬卵巢组织。
  2. 使用1 mL移液器将卵巢从插入物中转移至1.5 mL离心管中。移除管中的DPBS，加入500 µL 4%多聚甲醛。于4°C固定卵巢2小时。
    注意：如果卵巢过大无法通过移液器吸头，可能需要将吸头末端修剪得更宽，以防止损伤组织。
  3. 用1 mL PBST冲洗固定的卵巢2 （PBS，0.1% Tween [v/v]，0.5% Triton [v/v]）在旋转摇床上至少洗涤三次，每次1小时。建议将组织置于PBST中过夜2 在4 °C下孵育过夜（12–16小时），以增强抗体渗透。
    注意：此处可作为暂停点；组织可在PBST中保存2 在加入一抗孵育前最多三天
  4. 在4 °C下，用100 µL抗体稀释缓冲液（1% BSA [w/v]、10%驴血清 [v/v]、0.1 M甘氨酸、0.1% Tween和0.5% Triton溶于PBS）将抗死盒解旋酶4（DDX4）抗体按1/400（2.3 µg/mL）稀释，孵育卵巢组织12–16小时。
  5. 第二天，移除一抗，加入1 mL PBST2 加入试管中。在旋转摇床上至少清洗组织三次，每次1小时。
    注意：此处可作为暂停点；组织可保留在PBST中2 一抗孵育后最多三天内
  6. 用 PBST 将二抗驴抗兔 AF488 按 1/500 稀释（1.5 µg/mL）2将组织与至少100 µL稀释后的二抗在4 °C孵育12–16小时。
  7. 第二天，用 PBST 对组织进行充分洗涤2 至少三次，每次1小时，在旋转摇床上. 建议将组织洗涤长达8小时以降低背景信号。从这一步开始，务必用铝箔覆盖管子，以避光保护。
  8. 移除 PBST2 加入100 µL DAPI（用PBS稀释至1/1000，即1 µg/mL）至离心管中。将组织在DAPI中室温孵育30分钟。
  9. 用PBST洗涤卵巢2 用1 mL移液器将卵巢转移至成像间隔片中心，去除多余的PBST，并在显微镜载片上固定30分钟2加入约 5 µL 抗荧光淬灭封片剂，将显微镜载玻片置于间隔垫上方。用透明指甲油密封间隔垫边缘，以长期保存。
    注意：成像前需确保指甲油已完全干燥，且盖玻片外表面无封片剂残留。这些试剂可能损坏显微镜的物镜。此外，避免使用过量封片剂，以免在成像过程中导致卵巢移动。
  10. 使用共聚焦显微镜以10倍放大倍数对卵巢进行成像，Z轴步长为10 µm。调整设置，并使用Z轴补偿（激发增益）以完整成像整个卵巢。可通过以下步骤实现：
    1. 通过直方图监测信号饱和度来调整激发功率和探测器增益，因为不同组织之间可能存在差异。从低激光功率开始，并根据需要逐步增加。
    2. 对于深层区域成像，应启用增益探测器的Z补偿功能，因为信号强度可能随深度增加而减弱。帧平均数至少设置为10，并启用双向X扫描，扫描速度设为600 Hz。
      注意：使用这些设置时，每个卵巢的成像时间不应超过10分钟（约200 µm）。使用抗DDX4抗体对卵巢进行整体免疫荧光染色通常信号较强，极少发生光漂白。

4. 卵泡定量分析

  1. 为了量化每个卵巢中的卵泡数量，使用 ImageJ 软件打开图像。打开后，确保颜色模式选择为伪彩色，并在拆分为独立窗口下方的框中勾选拆分通道。选择感兴趣的图像，然后使用图像/变换/旋转工具将卵巢在图像中对称放置。
    注意：共聚焦显微镜获取的图像可使用 Imaris 软件（图3A，B）或 ImageJ 软件16以三维形式查看和分析。
  2. 使用分析/工具/网格工具将卵巢划分为网格（图3C，C'）。
  3. 使用插件/分析/细胞计数器工具标记覆盖卵巢的所有网格（图3D，D'，由计数器类型4标记的网格）。在这些网格中，每行交替标记一个网格用于卵泡定量（图3E，E'，由计数器类型8标记的网格）。位于卵巢边缘且包含少于10个卵母细胞的网格不纳入卵泡定量。
    注意：初始化细胞计数器，并选择您认为易于辨识的计数器类型。
  4. 卵母细胞可通过其细胞核周围存在 DDX4 阳性的环状结构（细胞核本身 DAPI 染色阳性）来识别。原始卵泡的卵母细胞直径约为 20 µm，周围被扁平的体细胞包裹。生长中的卵泡其卵母细胞直径大于 25 µm，并被一层或多层立方形颗粒细胞包围（补充图1）。
  5. 在每个已标记的网格中计数原始 卵泡（如 图3E，E' 中计数器类型8所示）。通过该网格内的光学切片/图像堆栈逐层观察卵泡，并分别使用细胞计数器工具进行标记。注意避免在两个连续的光学切片/图像堆栈中重复计数同一原始卵泡。 在所有用计数器类型4标记的网格中计数生长中的卵泡。
    注意：使用缩放功能有助于在图像堆栈中观察和计数卵母细胞。
  6. 通过将每个网格中原始 卵泡的平均数量（nfgrid）乘以覆盖卵巢的网格总数（ngrids），计算整个卵巢中原始 卵泡的数量（nf）。nf = nf grid × ngrids。
    注意：统计分析使用 Prism 10.2.0 软件（GraphPad Software, version 10, Inc., CA）完成，图表亦由该软件生成。组间差异采用单因素方差分析（ANOVA）后接 Tukey 多重比较检验进行评估。当 p < 0.05 时认为具有统计学显著性。数据以均值 ± 标准误（SE）表示。

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结果

本文中，我们展示了新生小鼠卵巢培养、全组织免疫染色、共聚焦成像以及卵泡定量的方法，用于评估培养过程中插入物内卵巢的数量和位置是否影响实验结果，特别是卵巢内的卵泡计数。我们采用以下设置进行卵巢培养：每个插入物中分别培养一个、两个或三个卵巢用于稳定培养，以及每个插入物中三个卵巢用于悬浮培养。卵巢在两种条件下进行培养：对照组或药物处理组，其中药物处理组使用 0.1 µg/mL 的多西环素（Dox）处理 24 小时。培养 24 小时后，将对照组和多西环素处理组的卵巢均转移至新鲜培养基中，继续培养额外的 4 天。

我们发现，在采用稳定培养方法的对照培养基中培养的卵巢中，平均而言，单卵巢培养组的原始卵泡数量较多，而三卵巢组的原始卵泡数量较少。然而，这三个组之间并无显著差异。值得注意的是，采用漂浮培养方法培养的三卵巢组在所有四种培养条件下原始卵泡数量最少。然而，三卵巢组在稳定培养与漂浮培养方法之间的原始卵泡数量差异并不显著（图4A、B、E）。此外，采用漂浮培养方法培养的卵巢其发育中卵泡数量也最少。相比之...

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讨论

本研究展示了新生小鼠卵巢培养以及全组织卵巢卵泡定量的方法。该培养方法可在体外维持原始卵泡和早期发育卵泡的生长。全组织卵泡定量法所需的组织处理步骤极少，节省了时间并保持了组织完整性，从而确保卵泡定量的准确性。

对照组中观察到的原始卵泡数量表明，尽管与文献报道的出生后第10天卵巢中的卵泡数量（约每卵巢4,300个卵泡）相比略有减少，但我们的结果仍具有可比性17这种减少可能是由于未达到最优条件所致 体外 与培养相比 体内 条件。除了原始卵泡外，在培养的卵巢中还观察到发育中的卵泡，包括初级、次级和三级卵泡。该结果与文献报道的CD1品系小鼠出生后第10天卵巢中的卵泡发生情况一致，表明该培养方法能够有效支持卵泡发育。17.

卵泡定量结果表明，采用稳定化方法维持卵巢至关重要，因为该方法可提供一致的物理支撑。采用漂浮法培养的卵巢表现出原始卵泡丢失增加，这可能是由于细胞死亡所致，因为并未观察到发育中卵泡数量相应增加...

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披露

不存在需要披露的利益冲突。

致谢

本研究工作得到了美国国立卫生研究院下属国立普通医学科学研究所授予号 R35GM158131 的资助。EADM 得到拉洛基金会（Lalor Foundation）的支持。作者衷心感谢密苏里大学先进光学显微镜核心设施（University of Missouri Advanced Light Microscopy Core）提供的支持 & 本工作的协助

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
24孔细胞培养板Fisher scientific 09-761-146 
Alexa Fluor 488 驴抗兔二抗Jackson ImmunoResearch Laboratories711-546-152
双抗（100倍浓缩）Gibco15240-062
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA1470-25G
CD-1 IGS 小鼠Charles River Laboratories 022小鼠
细胞培养小室MilliporePICM01250
Comfort Point 胰岛素注射器，带针头，1 cc，28G × 1/2Exel26027
DAPIThermo Scientific62248
DDX4 兔单克隆抗体abcamab13840
DMEM/F12 (1:1) (1倍)Gibco11320-033
盐酸多柔比星 Sigma-AldrichPHR1789
DPBS (1倍)Gibco14190-144
胎牛血清Sigma-AldrichF0926-500ML
Fiji-ImageJNIH, USA (https://imagej.net/ij/)ImageJ 1.52p
Fisherbrand 可调速旋转混合仪Fisher scientific 88-861-043摇床
卵泡刺激素Sigma-AldrichF4021-10UG
Forma Steri-Cycle i160Thermo Scientific™i160CO2 培养箱
甘氨酸Fisher scientific BP381-500
Imaris Oxford Instruments (https://imaris.oxinst.com/)Imaris 10.2
Leica TCS SP8Leica MicrosystemsSN 8100001409共聚焦显微镜
正常驴血清Jackson ImmunoResearch Laboratories017-000-121
Olympus SZ61Olympus MicroscopesSZ61体视显微镜
多聚甲醛 Fisher scientific 15714
SecureSeal 成像间隔垫Grace Bio-Labs654002
Triton X-100Sigma-AldrichX100-500ML
TWEEN 20Sigma-AldrichP1379-500ML
VECTASHIELD 抗荧光淬灭封片剂Vector LaboratoriesH-1000

参考文献

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