新生小鼠卵巢培养与整体染色卵泡定量：一种高效方法 体外 研究原始卵泡调控的方法

摘要

本研究介绍了在膜插件上培养出生后小鼠卵巢以及对整个卵巢进行全封片卵泡定量的实验方案。结果表明，卵巢培养过程中的技术操作会显著影响原始卵泡计数，凸显了保持操作一致性的必要性，以尽量减少非生物学因素引起的变异。

摘要

在雌性哺乳动物中，原始卵泡在胎儿期卵巢发育过程中形成，并作为维持成年卵巢功能的唯一来源。原始卵泡如何组装、维持静息状态、启动卵泡发育以及发生细胞死亡的机制，对于理解卵巢生理及病理状况具有重要意义。本研究介绍了一种将出生后小鼠卵巢置于膜插件上进行培养的实验方案，该方法可实现完整卵巢的体外培养及药物处理，培养时间最长可达10天，具体时长取决于卵巢的发育阶段。通过将含有培养卵巢的插件在培养板的不同孔之间转移，即可实现培养条件的改变，从而避免在培养过程中对组织造成物理干扰。以P5期卵巢为例，将其分离后置于24孔板中的12 mm插件上进行培养。每个卵巢被置于一滴添加了10%胎牛血清（FBS）、3 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）、10 mIU/mL促卵泡激素（FSH）以及抗生素-抗真菌剂的DMEM/F12培养基液滴中，并轻柔地固定在 膜插件表面。每两天更换一次培养基，总培养时间为五天。培养结束后，卵巢组织用4%多聚甲醛固定2小时，并进行全组织免疫荧光染色，检测卵母细胞标志物DDX4的表达。根据卵母细胞大小及体性卵泡细胞的核形态对卵泡进行分期和定量分析。结果表明，卵巢组织在膜插件上的正确放置位置显著影响每个卵巢中原始卵泡的数量。此外，每个插件上放置卵巢数量的差异可能引入非生物学性变异，应予以避免。

引言

卵子发生是一个高度受调控且复杂的过程，最终产生成熟的卵母细胞。在哺乳动物中，卵子发生在胎儿卵巢中启动，原始生殖细胞（PGCs）在此分化为初级卵母细胞。每个初级卵母细胞被一层扁平的前颗粒细胞包裹，形成原始卵泡。大多数原始卵泡在形成后进入静止状态，构成卵巢储备^1,2,3。在成年卵巢中，原始卵泡周期性地被激活并进入卵泡发育过程，这一过程称为卵泡发生，对于维持成熟卵母细胞和卵巢类固醇激素的生成至关重要^4,5。在缺乏激活信号的情况下，人类的原始卵泡可保持静止长达50年。这种长期的静止状态可能导致卵母细胞质量下降，并加剧衰老卵巢中原始卵泡的丢失速率⁶。目前仍不清楚的是，特定群体的卵泡如何被选择性激活，而其他卵泡则保持静止并经历周期性的细胞死亡，其潜在机制仍是未解之谜。

卵子发生过程在哺乳动物中高度保守，因此小鼠是研究哺乳动物卵子发生的理想模型⁷。在小鼠中，原始卵泡的形成在出生后第4天（P4）完成。少量原始卵泡在形成后立即进入卵泡发育阶段。在卵泡发育过程中，由于器官发生增强以及mRNA和蛋白质合....

方案

CD-1 雄性和雌性小鼠以 1:1 的比例同笼饲养作为繁殖配对。新生幼崽的出生日期被定义为出生后第 0 天。所有动物实验均经机构动物护理 & 使用委员会（IACUC），密苏里大学（方案编号：36647）。

1. 试剂与培养基

1. 本研究中使用的所有试剂均列于材料表中。在卵巢培养前，请准备好所有材料和培养基。
2. 培养基：配制约 5 mL 的 DMEM/F-12 培养基，添加 3 mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）、10% 胎牛血清（FBS）和 10 mIU/mL 促卵泡激素（FSH）。
   注意：应将 BSA（30 mg/mL）、FBS 和 FSH 储液（10 IU/mL）加入 DMEM/F-12 培养基中，现用现配。将培养基置于培养皿中，在 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中平衡约 30 分钟。储液于 -20 °C 保存，使用前立即解冻。将储液分装成适当体积，避免反复冻融。

2. 卵巢培养

1. 通过断头法处死 P5 雌性小鼠。使用手术剪和镊子取出卵巢及其附着的包膜组织。将卵巢置于含有预冷的含抗生素-抗真菌剂的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）的 60 mm 培养皿中（图 2....

结果

本文中，我们展示了新生小鼠卵巢培养、全组织免疫染色、共聚焦成像以及卵泡定量的方法，用于评估培养过程中插入物内卵巢的数量和位置是否影响实验结果，特别是卵巢内的卵泡计数。我们采用以下设置进行卵巢培养：每个插入物中分别培养一个、两个或三个卵巢用于稳定培养，以及每个插入物中三个卵巢用于悬浮培养。卵巢在两种条件下进行培养：对照组或药物处理组，其中药物处理组使用 0.1 µg/mL 的多西环素（Dox）处理 24 小时。培养 24 小时后，将对照组和多西环素处理组的卵巢均转移至新鲜培养基中，继续培养额外的 4 天。

我们发现，在采用稳定培养方法的对照培养基中培养的卵巢中，平均而言，单卵巢培养组的原始卵泡数量较多，而三卵巢组的原始卵泡数量较少。然而，这三个组之间并无显著差异。值得注意的是，采用漂浮培养方法培养的三卵巢组在所有四种培养条件下原始卵泡数量最少。然而，三卵巢组在稳定培养与漂浮培养方法之间的原始卵泡数量差异并不显著（图4A、B、E）。此外，采用漂浮培养方法培养的卵巢其发育中卵泡数量也最少。相比之.......

讨论

本研究展示了新生小鼠卵巢培养以及全组织卵巢卵泡定量的方法。该培养方法可在体外维持原始卵泡和早期发育卵泡的生长。全组织卵泡定量法所需的组织处理步骤极少，节省了时间并保持了组织完整性，从而确保卵泡定量的准确性。

对照组中观察到的原始卵泡数量表明，尽管与文献报道的出生后第10天卵巢中的卵泡数量（约每卵巢4,300个卵泡）相比略有减少，但我们的结果仍具有可比性¹⁷这种减少可能是由于未达到最优条件所致 体外 与培养相比 体内 条件。除了原始卵泡外，在培养的卵巢中还观察到发育中的卵泡，包括初级、次级和三级卵泡。该结果与文献报道的CD1品系小鼠出生后第10天卵巢中的卵泡发生情况一致，表明该培养方法能够有效支持卵泡发育。¹⁷.

卵泡定量结果表明，采用稳定化方法维持卵巢至关重要，因为该方法可提供一致的物理支撑。采用漂浮法培养的卵巢表现出原始卵泡丢失增加，这可能是由于细胞死亡所致，因为并未观察到发育中卵泡数量相应增加.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24孔细胞培养板	Fisher scientific	09-761-146
Alexa Fluor 488 驴抗兔二抗	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-546-152
双抗（100倍浓缩）	Gibco	15240-062
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A1470-25G
CD-1 IGS 小鼠	Charles River Laboratories	022	小鼠
细胞培养小室	Millipore	PICM01250
Comfort Point 胰岛素注射器，带针头，1 cc，28G × 1/2	Exel	26027
DAPI	Thermo Scientific	62248
DDX4 兔单克隆抗体	abcam	ab13840
DMEM/F12 (1:1) (1倍)	Gibco	11320-033
盐酸多柔比星	Sigma-Aldrich	PHR1789
DPBS (1倍)	Gibco	14190-144
胎牛血清	Sigma-Aldrich	F0926-500ML
Fiji-ImageJ	NIH, USA (https://imagej.net/ij/)	ImageJ 1.52p
Fisherbrand 可调速旋转混合仪	Fisher scientific	88-861-043	摇床
卵泡刺激素	Sigma-Aldrich	F4021-10UG
Forma Steri-Cycle i160	Thermo Scientific™	i160	CO2 培养箱
甘氨酸	Fisher scientific	BP381-500
Imaris	Oxford Instruments (https://imaris.oxinst.com/)	Imaris 10.2
Leica TCS SP8	Leica Microsystems	SN 8100001409	共聚焦显微镜
正常驴血清	Jackson ImmunoResearch Laboratories	017-000-121
Olympus SZ61	Olympus Microscopes	SZ61	体视显微镜
多聚甲醛	Fisher scientific	15714
SecureSeal 成像间隔垫	Grace Bio-Labs	654002
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-500ML
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P1379-500ML
VECTASHIELD 抗荧光淬灭封片剂	Vector Laboratories	H-1000