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使用贴壁或悬浮细胞进行单板线粒体应激与糖酵解应激测试

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DOI：

10.3791/69504

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2026年5月22日

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1Department of Biochemistry, Cancer Biology, Neuroscience and Pharmacology, School of Medicine, Meharry Medical College, 2Department of Biomedical Sciences, School of Graduate Studies, Meharry Medical College, 3Host-Tumor Interactions Research Program, Vanderbilt-Ingram Comprehensive Cancer Center, Vanderbilt University School of Medicine, 4Vanderbilt Institute for Infection, Immunology and Inflammation, Vanderbilt University School of Medicine

本文内容

摘要

本研究提供了在同一块培养板上同时进行线粒体应激和糖酵解应激测试的实时代谢分析的优化方案。该方法针对贴壁细胞（如BMDMs）和非贴壁细胞（如淋巴细胞）进行了优化，可实现对目标细胞线粒体功能和糖酵解功能的准确、可重复且并行的评估。

摘要

实时代谢分析可对线粒体呼吸和糖酵解进行无标记检测，使研究人员能够在不同领域中将细胞能量代谢与疾病机制及治疗反应相关联。在比较不同小鼠、其他动物、人类或经不同处理的细胞之间的能量代谢时，必须在同一次运行中完成检测，以确保结果的准确性和可靠性。此外，实验设计必须考虑所分析的细胞类型，例如，细胞是贴壁细胞（如骨髓来源的巨噬细胞，BMDMs）还是非贴壁细胞（如淋巴细胞）。因此，本研究建立了一种可在同一块培养板上同时进行线粒体应激和糖酵解应激检测的实验方案，尽管这两种检测需要不同的药物注射和分析程序。针对高度贴壁细胞（例如 BMDMs）和非贴壁的“悬浮”细胞（例如 T 细胞及其他淋巴细胞），分别优化了相应的操作流程。本文提供了高效且可重复地开展这些检测的详细实验方案。

引言

Seahorse XF 分析仪是一种独特的仪器，可实现实时测量多种细胞类型的线粒体呼吸和糖酵解。通过同时定量氧消耗速率（OCR）和细胞外酸化速率（ECAR），该技术能够在生理或应激条件下精确解析生物能量代谢通路。其多功能性使其在多个研究领域中不可或缺，包括癌症1、神经科学2、免疫学3、衰老3,4,5以及药物发现6，在这些领域中，代谢重编程是疾病进展和治疗反应的标志性特征。通过将功能性生物能量学与细胞表型关联7,8，该分析为揭示作用机制、识别代谢脆弱性以及评估基因或药物干预效果提供了强大的平台。

在许多研究领域中，比较药物、小分子、细胞因子或天然化合物对细胞代谢的即时效应时，最好在相同的实验条件、同一块培养板、相同的孵育时间、环境参数以及相同的时间段内进行。因此，本方法是在同一块培养板上接种具有不同处理或不同遗传背景的细胞，并同时分析多种代谢参数。该策略可确保对药物或遗传因素相关的细胞能量代谢变化进行最准确的比较。

许多细胞类型在培养中的行为各不相同。淋巴细胞保持悬浮状态，从不贴壁于培养板9；巨噬细胞则牢固贴附，难以传代；癌细胞增殖迅速，但不同细胞系的增殖速率存在差异。这些差异为实时代谢分析带来了挑战；因此，实验中每种细胞类型都需要采用定制化的实验方案。

本文提供了使用实时代谢分析进行这些检测的逐步操作方案，以确保实验的高效性和可重复性。这些方案可适用于市场上所有型号的分析仪。

方案

小鼠的饲养和管理严格按照美国国立卫生研究院（NIH）以及梅哈里医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）规程中所述的程序进行。本机构已获得国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC International）认证，并遵守公共卫生服务政策（Public Health Service Policy）在无病原体条件下对实验动物进行处理和使用的规定。材料表中列出了所用试剂和设备的详细信息。

1. 细胞密度的优化

注意：每种细胞类型都表现出独特的代谢特征以及在大小上的显著差异。这两个因素对于确定每孔加载的适当细胞数量以获得最佳结果至关重要。在进行初步实验测定之前，应使用所选的目标细胞，以不同的密度接种，制备并运行一块测试板。

  1. 对于贴壁细胞（例如癌细胞），测试每孔20,000–100,000个细胞的接种密度。对于高代谢活性和/或体积较大的细胞（例如人癌细胞或成纤维细胞），密度优化应从每孔10,000个或更少细胞开始。
  2. 对于非贴壁细胞（例如淋巴细胞），将接种密度优化在每孔 100,000–500,000 个细胞范围内。对于所有细胞类型，应力求形成均匀的单细胞单层，以获得最佳结果（参见 图1 例如样品的板布局。
  3. 运行线粒体应激测试（如下所述）. 初步实验的数据可用于确定主实验的最佳细胞密度。选择在检测条件下差异最大的密度。
    注意：本方案不适用于三维样品（如细胞球体、类器官）的分析。然而，可通过修改以考虑样品厚度和不平整表面的影响。

2. 检测前的准备

  1. 在进行检测的前一天，轻轻将传感器盒从工具板中取出，并向工具板的每个孔中加入 200 µL 无 RNA酶/DNA酶的水，然后将传感器盒放回工具板中，直至传感器完全浸没于水中。
    注意：水位必须足够高，以确保传感器在过夜期间完全浸没，因为若传感器盒中的荧光染料未充分水合，则无法正常工作。如果使用 XF Hydrobooster 对传感器盒进行水合，则可直接将传感器盒放入校准液中，无需进行水合步骤。
  2. 将已水合的传感器盒/工具板置于 37 °C、无 CO2 的培养箱中过夜。为防止板内液体蒸发，同时在培养箱内放置一个盛有重蒸水的容器。
  3. 在检测当天，从无 CO2 的培养箱中取出传感器盒/工具板，轻轻将传感器盒从工具板中取出，并将传感器面朝上放置于实验台上。
  4. 弃去工具板中的水，甩干残留液滴，并向每个孔中加入 200 µL XF 校准液。
  5. 轻轻将传感器盒重新放入工具板中，确保传感器完全浸没于校准液中，然后将其放回 37 °C、无 CO2 的培养箱中。

3. 检测培养基的制备

  1. 线粒体应激检测培养基的配制：
    1. 在50 mL离心管中，向45 mL XF RPMI培养基中加入以下成分：500 µL 100倍浓度的丙酮酸钠（终浓度：1 mM）、500 µL 100倍浓度的L-谷氨酰胺（终浓度：2 mM）以及550 µL 45%葡萄糖溶液（终浓度：25 mM）
  2. 调节pH至7.4，再用XF RPMI培养基定容至终体积50 mL。使用前将配制好的培养基置于37 °C水浴或干浴中保温。
  3. 糖酵解检测培养基的配制：
    1. 在50 mL离心管中，向45 mL XF RPMI培养基中加入250 µL 100倍浓度的L-谷氨酰胺。
  4. 调节pH至7.4，再用XF RPMI培养基定容至终体积50 mL。使用前将配制好的培养基置于37 °C水浴或干浴中保温。
    注意：在添加可能改变pH的补充物后，必须重新将线粒体应激检测和糖酵解检测培养基的pH调整至7.4，因为即使微小的pH偏差也可能显著影响检测结果。

4. 分析前的细胞洗涤与换液

注意：XFe96/XF Pro 细胞培养微孔板的洗涤步骤将根据所使用的贴壁或非贴壁细胞类型而有所不同。请参阅第9步，针对贴壁细胞（如癌细胞、原代骨髓来源巨噬细胞）和非贴壁细胞（如T细胞及其他淋巴细胞），以确定适用于所用细胞类型的最佳洗涤方法。

  1. 使用多通道移液器从每个孔中移除 160–180 µL 培养基，每次操作一行或一列，以防止细胞干燥。避免接触孔底。
  2. 使用单通道移液器从孔中移除剩余的 20–30 µL 液体，注意避免触碰孔底的细胞层。
  3. 根据 图 1 的布局，向每个孔中加入 180 µL 糖酵解或线粒体应激检测试剂（见步骤 3）。为避免扰动细胞层，应沿每孔侧壁轻轻加入试剂，直至所有孔均加满。两种检测在同一块微孔板中进行。
    注意：不含细胞的孔和对照孔也必须加入检测试剂。
  4. 将微孔板放入 37 °C、无 CO2 的培养箱中孵育 40–45 分钟，以准备开始检测，同时开始配制药物。

5. 药物制备与加样至 cartridge

警告：某些药物（FCCP、Antimycin A/Rotenone、Oligomycin）具有危害性，应小心操作。需采取适当措施以保护人员安全，包括使用手套及其他个人防护装备（PPE），并将废弃物置于经机构批准的化学废液桶或容器中妥善处理。

注意：FCCP/寡霉素的最佳浓度取决于细胞类型，在使用特别敏感的细胞进行实验前，需通过实验确定其最佳工作浓度。不同细胞类型所需药物的最终浓度可能有所不同。所有药物及检测用培养基均需在使用当天新鲜配制，禁止冷冻或重复使用。为获得最佳结果，建议在此45分钟内完成检测所需药物的配制。

  1. 使用第3步中预热的线粒体应激和糖酵解检测试剂，根据表1和/或表2将化合物稀释至适合每种细胞类型的浓度。每种化合物分别置于单独的15 mL离心管中（若使用全部六种化合物，则需六个离心管）。
  2. 从37 °C、无CO2的培养箱中取出传感器微板/工具板，打开盖子，小心地将试剂盒附带的XF加样引导装置（对应注射端口的引导装置，如A端口使用引导装置A）牢固地放置在传感器微板顶部（参见图2）。
  3. 使用多通道移液器和每种药物对应的试剂储液槽，缓慢将所需体积的药物加入对应的端口（体积请参见表1和表2）。加样时移液器必须严格保持垂直（参见图2）。
  4. 每次加样后更换或彻底冲洗并干燥加样引导装置，以供各端口（A、B、C和D端口）重复使用，并在每次加样后丢弃移液器吸头。
    注意：移液器吸头应能牢固插入引导端口中，但不宜过紧，以免吸头卡在引导装置中！建议在正式加样前先测试所用移液器吸头与引导装置的匹配性，以避免样品加样错误。
  5. 将所有化合物加入相应端口后，取下引导装置，目视确认所有端口均已充满，并盖上微板盖以固定微板。各药物应与同一微板各部分的检测类型相对应（参见图1）。
    注意：线粒体应激检测推荐的终孔浓度为1 µM 寡霉素、1 µM FCCP 和 0.5 µM 鱼藤酮/抗霉素A；糖酵解检测推荐的终孔浓度为10 mM 葡萄糖、1 µM 寡霉素和50 mM 2-DG。

6. 设置 Seahorse XFe96 分析仪

  1. 打开分析仪并启动WAVE软件（参见图3）。
  2. 选择XF线粒体应激测试。
    注意：只要使用适当的检测培养基和化合物，分析仪即可在同一块微孔板上同时进行线粒体和糖酵解检测，使用XF线粒体应激测试。
  3. 根据微孔板设置选择“组”数量，并为每组命名。进入下一个标签页以分配微孔板图谱中的孔位（参见图3）。两种检测均在同一块微孔板上进行。
  4. 根据微孔板加样方式，标出每组对应的孔位。
  5. 根据细胞类型和实验目的调整程序。例如，如果实验设置中包含分析前预先激活的组别，或在运行过程中添加激活剂，则应延长每个循环的孵育时间，以确保激活反应充分发生。
  6. 选择下一个标签页“运行检测”，并填写必要的信息以保存数据文件。
  7. 当仪器提示初始化时，将预水化的加药试剂盒（来自步骤5）装入仪器中。初始化步骤将显示传感器是否已充分水化并正常工作。
  8. 根据程序提示开始检测，并按提示加载和卸载微孔板。
    注意：将试剂盒或微孔板装入分析仪时，务必移除所有盖子！尽管部分分析仪型号具备可检测盖子的安全功能，但早期型号不具备此功能。若在运行过程中未移除盖子，可能会损坏仪器。

7. 标准化方法：（SRB）和细胞核计数（DAPI 染色与成像）

警告：SRB 检测试剂盒中的某些试剂具有腐蚀性，接触皮肤可能造成灼伤。DAPI 可能引起过敏性皮肤反应。建议佩戴手套及其他个人防护装备，并将废弃物丢弃于经机构批准的化学废液桶或容器中。

注意：应根据所分析细胞的特性和预处理方式选择归一化方法。当比较具有不同增殖速率的细胞时，两种方法均适用，因为二者均可校正此类差异。然而，如果药物处理诱导细胞衰老，导致增殖停止但细胞体积增大，则推荐使用 DAPI 染色作为归一化方法。对于难以观察到细胞核染色的细胞类型（例如脂肪细胞、红细胞），或可能为多核的细胞（例如实质肝细胞、肌细胞），DAPI 染色可能不适用。

  1. 在实时代谢分析后，使用SRB法（磺酰罗丹明B细胞毒性检测试剂盒）对细胞进行归一化处理：将培养板从仪器中取出，向每孔加入固定液，体积为培养基体积的¼（例如，在200 µL培养基中加入50 µL）。
    1. 室温孵育1小时，或4 °C过夜。
    2. 移除溶液，并用200 µL无RNase/DNase的水轻柔洗涤各孔3次，注意不要破坏细胞层。如需短期保存（如有必要），最后一次洗涤改用PBS，并于4 °C保存。
    3. 若需立即进行SRB法归一化处理，移除洗涤液后，将培养板置于室温下完全自然晾干。
    4. 向每孔加入25 µL SRB染色液，在室温避光条件下染色15分钟，或在孵育期间用铝箔纸包裹培养板。
      注意：SRB溶液对光敏感，本实验步骤必须在低光照环境中进行。
    5. 移除染色液，向每孔加入100 µL 1×洗涤液，洗涤2–3次。
    6. 尽可能快速完成洗涤以避免褪色，并通过真空抽吸尽可能彻底移除洗涤液。
    7. 向每孔加入100 µL 1×溶解液，将培养板置于摇床上，室温震荡10分钟。
    8. 使用酶标仪在565 nm波长下测定吸光度（O.D.），根据颜色饱和度确定各孔细胞密度（参见图3以获取视觉参考）。
    9. 将O.D.值数据导出为Excel文件。该电子表格将被粘贴至WAVE软件中用于归一化处理（步骤8）。
      注意：若因细胞过多导致颜色过深（> O.D. 3.5），可选用次优波长（如490–530 nm）使读数回归仪器线性范围。通过从所有样本读数中减去仅含培养基的对照孔（背景对照孔）的O.D.值，校正背景信号。
  2. 进行DAPI染色时，将DAPI储存液用1×PBS稀释至300 nM。
    1. 用200 µL 1×PBS轻柔洗涤细胞培养板每孔3次。
      注意：若存在非贴壁细胞，每次洗涤后需将培养板以200 × g离心3分钟（无刹车），以确保细胞沉降至各孔底部。
    2. 用1×PBS稀释的2%–4%多聚甲醛（PFA）在室温下固定细胞10–15分钟。
    3. 用200 µL 1×PBS轻柔洗涤细胞培养板每孔3次。
    4. 向每孔加入约150 µL稀释后的DAPI染色液，确保各孔中的细胞被完全覆盖。
    5. 在低光照环境（或用铝箔纸覆盖培养板）中室温孵育1–5分钟。
    6. 移除各孔中的DAPI染色液。
    7. 用200 µL 1×PBS轻柔洗涤细胞培养板每孔3次。
    8. 移除残留的PBS。
    9. 在显微镜下使用358–461 nm范围内的任意激发/发射波长或任意DAPI滤光片设置对细胞成像。
    10. 将发射光强度数据导出为Excel文件。该电子表格将被粘贴至WAVE软件中用于归一化处理（步骤8）。

8. 数据的分析与标准化

注意： 对于数据分析，可以使用“Wave”或其他软件。提供的方案适用于 Wave 软件。

  1. 在 Wave 中打开分析结果（参见图3）。归一化使用微孔板读数仪在 SRB 染色后生成的 Excel 文件中的数值进行（步骤 7）。
  2. 点击“归一化”。
  3. 在打开的窗口中，选择“全选”，然后选择“粘贴”，以粘贴在归一化步骤中从 Excel 表格复制的数据。点击“应用”。此过程将自动完成所有实验数据的归一化。
  4. 要生成报告，请点击“导出至”，在右侧打开的面板中选择“XF 细胞线粒体应激测试报告生成器”。保存生成的文件。在分析过程中，仅选择分配给线粒体应激测试的孔（参见图3）。
  5. 要生成报告，请点击“导出至”，在右侧打开的面板中选择“XF 细胞糖酵解应激测试报告生成器”。保存生成的文件。在分析过程中，仅选择分配给糖酵解应激测试的孔（参见图3）。

9. 贴壁 与 非贴壁细胞

注意：贴壁细胞与非贴壁细胞在生长行为、表面附着能力及操作要求方面存在差异。贴壁细胞（如癌细胞、骨髓来源的巨噬细胞）会附着于培养表面，因此铺板和洗涤时无需特殊预防措施。非贴壁细胞（如T细胞及其他淋巴细胞）则保持悬浮状态，需要采用不同的离心、重悬和铺板方法。明确这些差异对于准确的细胞接种、药物处理及实验结果的一致性至关重要。

  1. 在开始实验前，确保所有用于实验的细胞已在选定的培养基和细胞培养容器中进行培养，然后转移至微孔板中进行检测。
    注意：虽然本方案中所述细胞类型推荐使用XF RPMI培养基，但对于其他细胞类型，请咨询制造商以确保使用适当的培养基。
  2. 对于贴壁细胞（如癌细胞、BMDM细胞），在检测前4–5小时将细胞以优化的细胞密度（见步骤1）接种至XFe96/XF Pro细胞培养微孔板中，每孔加入200 µL培养基，并置于37 °C含CO2的培养箱中。
    注意：BMDM细胞可在检测前最多24小时接种，因其不增殖，可维持细胞密度不变。对于生长迅速的贴壁细胞（如癌细胞系），若无需额外处理，建议在检测当天接种，并在细胞贴壁后立即进行分析，以避免额外的细胞增殖。若无法实现此设计，则必须对每孔蛋白含量或每孔细胞核数量进行归一化处理。
  3. 确保微孔板四个角的孔内不接种细胞，但需加入培养基，作为背景对照孔进行测量。
  4. 孵育3–5小时后，观察微孔板，确保每个孔底部的细胞已均匀贴壁。
  5. 若细胞尚未完全贴壁，可将微孔板继续置于37 °C含CO2的培养箱中孵育，直至细胞充分贴附。
  6. 随后，按照步骤4所述方法对含贴壁细胞的微孔板进行洗涤准备，以继续后续检测。
  7. 对于非贴壁细胞（如T细胞及其他淋巴细胞），在向微孔板中加入细胞前，需先用多聚赖氨酸（Poly-D-Lysine）对微孔板进行包被。
    注意：尽管本方案推荐使用多聚赖氨酸包被，但根据细胞类型的不同，其他包被材料（如胶原蛋白、纤连蛋白、明胶）可能更为合适。若使用替代包被材料，请遵循制造商提供的使用说明。
  8. 为进行微孔板包被，使用0.1 M碳酸氢钠溶液（pH 8.0）配制2.5 mL浓度为20 µg/mL的Poly-D-Lysine溶液（即1 mg/mL水溶液的50倍稀释）。此步骤可在检测前或检测当天完成。（碳酸氢盐可提供利于吸附的最适pH环境。）
  9. 向每孔加入25 µL上述溶液，在室温下于实验台或微孔板摇床上孵育20–30分钟。
  10. 吸除或用移液器移去残留液体，并用200 µL无RNase/DNase的水对每孔清洗两次。
  11. 在向微孔板接种细胞前，等待孔内完全干燥（1–2小时）。
  12. 随后，将含非贴壁细胞的微孔板以200 × g离心3分钟（无刹车），以确保细胞沉降至各孔底部，完成洗涤步骤前的准备。
  13. 进入步骤4，并按步骤5–7所述继续完成后续检测流程。

结果

该联合方案旨在使两种检测可在同一块板上进行。例如，本方法曾用于阐明mGluR1−TCR串扰信号在CD8+ T细胞活化过程中对其代谢能力的影响。10以评估mGluR1抑制对糖酵解转换及线粒体呼吸变化的影响，这两个过程对T细胞的最佳功能至关重要，同时最大限度减少每次实验所用的T细胞数量。相同的单板技术也成功应用于其他细胞类型，例如贴壁的骨髓来源巨噬细胞（BMDMs； 图4 和 图5），以及非贴壁细胞，例如人外周血单个核细胞（PMBCs； 图3). 结果显示，在活化的CD8+ T细胞中阻断mGluR1信号传导会影响线粒体和非线粒体的能量产生。相比之下，初始T细胞的能量代谢谱未表现出显著变化图6A，B). 活化的CD8+ T细胞的线粒体应激测试显示较高的基础呼吸、最大呼吸以及呼吸储备能力（图6C）。经CPCCOEt处理的T细胞——CPCCOEt是一种非竞争性拮抗剂，可阻断谷氨酸与mGluR1结合后产生的下游信号传导——其氧消耗率（OCR）降低，与初始细胞相似，并导致ATP生成减少（图6C）。糖酵解实验还显示，只有未经处理的活化CD8+ T细胞产生了ATP 通过 糖酵解，且CPCCOE处理显示出与初始状态相当的代谢活性（图6D这些结果证实，mGluR1 信号转导对于 CD8⁺ T 细胞活化后的正常功能至关重要。

Seahorse 细胞培养板示意图；96 孔板中线粒体应激和糖酵解检测的设置。
图 1：本图展示了在同一块微孔板中同时进行线粒体应激检测和糖酵解检测的实验板布局概览。 请点击此处查看该图的放大版本。

用于线粒体应激和糖酵解检测的96孔药物盒及多通道移液器装置示意图。
图2：加载药物盒。（A）药物盒背面和前面的传感器与加样口详细布局图，标明每种药物应加入的对应加样口。（B）推荐的药物盒顶部导板方向，用于准确定位对应加样口，以及使用多通道移液器时导板上的推荐操作位置。请点击此处查看该图的放大版本。

代谢检测工作流程图；包含试剂表、分析软件和结果的实验设置。
图3：使用WAVE程序运行和分析检测。（A）程序设置流程包括选择检测类型、分配分组、创建板图以及编程药物进样口。（B）将药物加载到相应进样口的顺序取决于样本是线粒体应激（Mito Stress）还是糖酵解（Glycolysis）检测。（C）归一化最后一步中SRB染色的特写图像。（D）归一化后，同一块板的数据可分别导出为糖酵解和线粒体应激检测结果。（E）可通过编辑当前选择，仅保留线粒体应激样本，从而选择线粒体应激数据。（F）可通过编辑当前选择，仅保留糖酵解样本，从而选择糖酵解数据。本图所用示例数据来自人外周血单个核细胞的分析。请点击此处查看该图的放大版本。

Mitostress test graph showing OCR changes over time; bar charts display ATP, proton leak, respiration.
图4在同一块板上同时进行线粒体应激测试。 从2月龄的野生型（WT）和Tusc2基因敲除（KO）小鼠中分离获得骨髓来源的巨噬细胞，并对其进行两种类型的分析。细胞要么保持未处理状态（假处理，sham），要么在铺板前用LPS（100 ng/mL）刺激5小时（每孔30,000个细胞）。线粒体应激测试和糖酵解应激测试平行进行，以实现准确比较，如图所示 图1. (A不同细胞类型（WT 和 KO）及条件（naïve 与激活状态）的线粒体应激谱，使用 Wave 软件生成。已进行归一化处理 通过 步骤7中所述的SRB染色。（B各测试中分析参数的比较柱状图 ∗p ≤ 0.05, ∗∗p ≤ 0.005，学生t检验。 请点击此处以查看该图的放大版本。

Glycolysis stress test graph; ECAR vs. time; bar charts on glycolytic metrics; metabolic analysis.
图5同一块板上同时进行的糖酵解应激测试。 从2月龄的野生型（WT）和Tusc2基因敲除（KO）小鼠中分离获得骨髓来源的巨噬细胞，并对其进行两种类型的分析。细胞要么保持未处理状态（假处理，sham），要么在铺板前用LPS（100 ng/mL）刺激5小时（30,000个细胞/孔）。线粒体应激测试和糖酵解应激测试平行进行，以实现准确比较，如图所示。 图1. (A不同细胞类型（WT 和 KO）及条件（naïve 与激活状态）的糖酵解应激谱，使用 Wave 软件生成。数据已进行标准化处理 通过 步骤7中所述的SRB染色。（B) 各项测试中分析参数的比较柱状图。 ∗p ≤ 0.05, ∗∗p ≤ 0.005，学生t检验。 请点击此处查看此图的放大版本。

线粒体呼吸和糖酵解功能图表；OCR、ECAR 测量值；柱状图。
图 6：使用从小鼠脾细胞中纯化的 CD8⁺ T 细胞在单个培养板上进行的线粒体应激和糖酵解应激检测。（A）线粒体应激检测的代表性图谱，比较了在初始态、激活态以及激活态加 mGluR1 抑制剂处理的 CD8⁺ T 细胞组中，药物依赖性的氧消耗率（OCR）变化。（B）糖酵解检测的代表性图谱，比较了在初始态、激活态以及激活态加 mGluR1 抑制剂处理的 CD8⁺ T 细胞组中，药物依赖性的细胞外酸化率（ECAR）变化。（C）柱状图显示初始态、激活态以及激活态加 mGluR1 抑制剂处理的 CD8⁺ T 细胞在线粒体呼吸不同参数中的定量变化。柱状图表示均值 ± 标准误（n = 4）。（D）柱状图显示初始态、激活态以及激活态加 mGluR1 抑制剂处理的 CD8+ T 细胞在糖酵解不同参数中的定量变化。柱状图表示均值 ± 标准误（n = 4）。∗p ≤ 0.05，∗∗p ≤ 0.005，Student t 检验。本图改编自 Aquino 等人10。请点击此处查看此图的放大版本。

终孔浓度 (µM)储备液体积 (µL)培养基体积 (µL)10 倍加药孔浓度 (µM)加入加药孔的体积 (µL)
加药孔 A 寡霉素0.51502850520
1.545025501520
2.563018902520
加药孔 B FCCP0.12537.52962.51.2522
0.257529252.522
0.51502850522
130027001022
260024002022
加药孔 C 鱼藤酮/抗霉素0.53002700524

表1：用于Mito Stress检测的XFe96传感器微孔板加样化合物制备。

终孔浓度储备液体积 (µL)培养基体积 (µL)10x 加样口溶液加入加样口的体积 (µL)
加样口 A 葡萄糖250 mM100240020
加样口 B 寡霉素0.5 µM15028505 µM22
1.5 µM450255015 µM22
2.5 µM630189025 µM22
加样口 C 2-DG50 mM30000500 mM24

表2：糖酵解实验中用于加载XFe96传感器 cartridge 的化合物制备。

讨论

本方案可在单次实验中，对两种主要的能量生成途径——氧化磷酸化（线粒体ATP生成）和无氧糖酵解（线粒体外ATP生成，无需氧气参与）——以及两种不同的应激测试进行准确且可靠的比较。此外，实验设计考虑了所分析细胞的类型，有助于更全面地理解细胞代谢分析，同时最大限度地减少样本和试剂的使用量。

在安捷伦科技公司设计和销售的实时代谢分析仪器方案中，线粒体应激测试与糖酵解应激测试之间存在显著差异。这两种检测需要使用不同的检测培养基、特定的药物以及不同的仪器程序。线粒体应激测试采用含有葡萄糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠的检测培养基，而糖酵解应激测试则使用不含葡萄糖、仅添加L-谷氨酰胺的培养基。两种检测所使用的化合物也不同：线粒体应激测试依次加入寡霉素（Oligomycin）→ FCCP → 抗霉素A（Antimycin A）+ 鱼藤酮（Rotenone），而糖酵解应激测试则依次加入寡霉素（Oligomycin）→ 葡萄糖（Glucose）→ 2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）。因此，由于实时代谢分析仪一次只能容纳一块检测板，这两项测试通常需在不同时间、分别于不同的检测板上进行。

为解决这些局限性，已开发出一种联合方案，可在同一块培养板上结合使用先前文献中描述的线粒体应激测试（Mito Stress Test）设置，同时进行两种检测10。本文提供了针对不同类型细胞（包括免疫细胞、癌细胞、贴壁细胞和悬浮细胞）的分析建议。这些指南可根据实验人员的目标和可用资源单独或组合应用，具有较高的灵活性。

通过SRB法或DAPI对细胞进行归一化处理，也提供了更大的灵活性，特别是在使用具有不同生长速率/大小的多种细胞类型时9,11。此外，由于该技术仅需一块培养板即可完成两种检测，因此可与多种样本类型结合使用，以测量代谢过程。

影响该方法成功的关键因素包括：（1）每孔最佳细胞数量；（2）高效的细胞贴壁；以及（3）谨慎的微孔板加样，因为两组不同的药物必须分别加入微孔板的不同区域。

该方法的科学与实验优势 包括 在相同的生物背景下进行直接比较。在完全相同的培养条件下使用同一批细胞，可消除不同培养板或实验批次间的变异性，从而更准确地比较同一样本中线粒体功能与糖酵解功能。该方法还能提供细胞代谢的整体性视图。同时平行检测氧化磷酸化（OXPHOS）和糖酵解，可全面反映细胞整体能量代谢状况及其在不同代谢途径之间转换的灵活性。这种平行检测方式还可降低生物学变异。由于两项检测均在同一细胞群体中进行，细胞接种密度、传代次数或环境条件的差异被最小化，从而提高了实验的可重复性。同时进行两项检测还能减少因传感器微孔板校准、温度变化或试剂配制等因素引起的批次间变异。

该技术的技术优势包括通过整合检测提高了效率，节省了时间、试剂和板耗材，因此在大规模或高通量研究中具有重要意义。该方法降低了对样本量的需求，仅需使用一块细胞培养板，这在处理数量有限或稀有的原代细胞（如淋巴细胞、脑源性细胞）时尤为有利。由于两项检测使用同一块培养板，并采用相同的归一化方法（例如基于蛋白含量或细胞数量），因此不同检测间的归一化效果更佳，结果更加一致且可靠。这种一致性增强了数据之间的相关性。来自同一样本的线粒体和糖酵解参数可直接配对，有助于代谢谱分析和统计学分析。

该技术目前唯一的已知局限是，在同一块板上结合两种方案会减少可用的孔重复数。建议限制每块板的条件数量，以确保每个条件至少有8个孔重复。

致谢

本研究由美国少数族裔健康与健康差异研究所（NIMHD）资助，项目编号为5U54MD007586-37，为A. Ivanova的试点项目；同时获得美国国家人类基因组研究所（NHGRI）基因组研究多样性中心资助，项目编号UG3HG013248，研究项目2，项目负责人Ivanova；此外，Genprex Inc. 也提供了部分支持。  本研究在Meharry医学院核心设施开展，该设施获得美国国立卫生研究院（NIH）资助项目MD007586、CA163069和S10RR025497的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
15 mL 离心管，带螺旋盖，无菌，每单位 500 支Genesee Scientific21-408B
Biologix 移液器吸头 - 200 μl 加长型（包装，无菌）Biologix USASKU 21-0200
BioTek Synergy H1BIOSPX
BZ-X700 荧光显微镜Keyence
Corning Costar 无菌一次性试剂储液槽Fisher4873
D-(+)-葡萄糖溶液 45% 溶于 H2OSigmaG9769
DAPI 盐酸盐 Thermofisher ScientificD1306
Eppendorf Centrifuge 5810 REppendorf
GenClone 胎牛血清，热灭活Genesee Scientific25-514H
L-谷氨酰胺 200 mM (100x)Gibco25030-081
Olympus Plastics 22-284，Olympus 1.7 ml 微量离心管，透明，无菌聚丙烯，耐煮沸，50/袋，每单位 250 支Genesee Scientific22-284
Olympus Plastics 28-108，50 ml 圆锥形离心管，聚丙烯散装，无菌，20 袋 × 25 支，每单位 500 支Genesee Scientific28-108
16% 电子显微镜级多聚甲醛溶液Electron Microscopy Science15710
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐，冻干粉SigmaP6407
Precision 180 水浴锅Precision Scientific51221060
Precision Scientific GCA Model 26 培养箱Thelco51221091
QBI 120-095-671 青霉素/链霉素混合液，100x Pen/Strep 混合液，10 × 10 mL/单位Genesee Scientific25-827
QBI PBS，1x，不含 Ca、Mg 和酚红，0.1 μm 无菌过滤Genesee Scientific25-507B
RPMI 1640，含 L-谷氨酰胺Genesee Scientific25-506
Seahorse XF RPMI 培养基，pH 7.4，500 mLAgilent103576-100
Seahorse XFe96 分析仪Agilent
Seahorse XFe96/XF Pro FluxPakAgilent103792-100包含 18 个 XFe96/XF Pro 传感器 cartridge、18 块 XFe96/XF Pro 细胞培养微孔板、1 瓶 500 mL Seahorse XF 校准液和 3 对 XF 加载导引器
碳酸氢钠SigmaS6014
丙酮酸钠 (100 mM) 100XGibco11360-070
SRB 检测试剂盒（磺酰罗丹明 B 检测试剂盒）Abcamab235935
VWR Signature 人体工学高性能多通道移液器Avantor89079-956
XF 细胞线粒体应激检测试剂盒Agilent103015-100
XF 糖酵解速率检测试剂盒Agilent103344-100

参考文献

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