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方法文章

大鼠膝关节软骨细胞的原代分离、培养及表型验证

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DOI：

10.3791/69509

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2025年11月7日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, Longfu Hospital, 2Department of TCM Rheumatology, China-Japan Friendship Hospital, 3Beijing Key Lab for Immune-Mediated Inflammatory Diseases, China-Japan Friendship Hospital

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了使用连续酶消化法分离和培养原代大鼠膝关节软骨细胞的方法。该方法获得的软骨细胞具有经过验证的表型特征，为研究人员提供了可靠的软骨研究应用手段。

摘要

由创伤、衰老或炎症性疾病引起的软骨损伤由于组织自身再生能力有限，仍然是一个重要的临床挑战。软骨细胞作为软骨中唯一的细胞成分，负责维持细胞外基质的结构与功能，因此在理解软骨生理学、病理学及再生机制方面至关重要。本研究提供了一种全面且标准化的原代大鼠膝关节软骨细胞分离、培养及表型验证的实验方案。该方法采用幼龄哺乳期大鼠以确保细胞活性最大化，并通过胰蛋白酶与II型胶原酶的序贯酶消化法实现高效的细胞提取。通过II型胶原免疫荧光染色、流式细胞术分析以及白细胞介素（IL）-1β刺激实验对软骨细胞表型进行验证，以确认细胞身份及其对炎症反应的敏感性。这一优化且可重复的操作流程能够获得高纯度的软骨细胞培养物，适用于药物筛选、机制研究及组织工程应用，推动软骨生物学研究的发展。

引言

软骨是一种特殊类型的结缔组织，具有多种重要功能，包括提供支撑、缓冲和吸收冲击1。它在维持骨骼系统的结构稳定性和保障活动能力方面发挥着关键作用2,3。机械性损伤、退行性改变、炎症或代谢异常均可导致软骨受损4,5,6。由于软骨本身缺乏血管和神经，且软骨细胞的增殖能力有限，其修复面临重大挑战。例如骨关节炎（由退行性改变和机械性损伤引起）和类风湿关节炎（由自身免疫性炎症反应引起）等疾病可造成不可逆的软骨损伤，显著降低患者的生活质量7,8,9。作为软骨组织中唯一的细胞类型，软骨细胞负责多项关键功能，包括细胞外基质的分泌与维持、骨骼发育的支持、参与关节缓冲与修复，以及对软骨生长和代谢的核心调控10,11,12。

软骨细胞被限制在无血管的基质陷窝内，导致其自身增殖和组织修复能力严重受限13,14。软骨细胞的功能状态直接决定了软骨组织的健康状况15。由于衰老、炎症、创伤或遗传因素引起的软骨细胞功能障碍，会导致基质合成减少和降解增加16,17。这一病理过程推动了软骨退变（如骨关节炎），进而损害其关键的支撑、缓冲和润滑功能。软骨有限的再生能力是其修复面临重大挑战的核心原因，也是现代骨科和再生医学研究的重要领域。目前，软骨研究已成为该领域的重点方向，基于药物干预、组织工程和基因治疗的研究均需要分离软骨细胞以进行体外（in vitro）研究18,19,20,21,22,23,24,25。因此，软骨细胞的分离与鉴定是许多实验方法中的关键步骤。尽管某些研究中使用了如SW1353等永生化的类软骨细胞系作为便捷替代，但这些细胞缺乏关键表型标志物的表达，尤其是对真实软骨细胞功能和基质形成至关重要的II型胶原26。因此，原代软骨细胞仍然是需要生理相关性研究的金标准。与以往报道的需要多种酶组合或大量机械操作的方法相比，简化的酶消化法降低了操作复杂性和处理时间。此外，通过引入全面的验证步骤，可确保功能性软骨细胞的一致性鉴定，并提高不同实验和实验室之间的可重复性。

软骨细胞的特征是分泌II型胶原蛋白，而在炎症因子刺激下，会大量合成并释放基质金属蛋白酶（MMPs）。27因此，在软骨细胞分离后，对细胞进行了鉴定 通过 II型胶原免疫荧光染色，并通过流式细胞术评估软骨细胞纯度。随后用白细胞介素（IL）-1β刺激，以验证其特征性的基质金属蛋白酶合成与分泌能力。本研究描述了从新生小鼠中提取和鉴定软骨细胞的过程，为后续软骨细胞相关实验奠定了基础。

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方案

本研究中动物实验的使用已获得中日友好医院实验动物福利伦理委员会的批准（编号：zryhyy21-21-05-16）。所用试剂和设备列于材料表中。

1. 实验动物与准备工作

注意：可用于软骨细胞分离的软骨组织来源包括大鼠、兔子以及接受全膝关节置换术后的患者关节。然而，由于乳鼠软骨细胞活力更高，本研究采用乳鼠进行软骨细胞提取。

  1. 使用专用转运容器将 suckling 大鼠从实验动物生产设施运送至实验室。
  2. 以 CO₂ 处死哺乳期幼鼠2 窒息法处死（遵循机构批准的方案）并用无菌溶液冲洗其体表。
  3. 将安乐死后的乳鼠浸入75%乙醇中10分钟，以消毒表面污染物。
  4. 将消毒后的新生大鼠转移至生物安全柜中，并置于无菌培养皿内。
    注意：对乳鼠进行彻底的表面清洁和乙醇浸泡是防止细菌或真菌污染的关键步骤，此类污染可能对后续实验产生不利影响。

2. 关节软骨组织的分离

注意：新生软骨呈覆盖在骨骺上的半透明蓝白色层状结构。此步骤必须严格遵循无菌操作技术，以避免污染，防止影响后续实验。

  1. 使用解剖刀和眼科剪分离新生大鼠膝关节，然后去除表面的皮肤组织。
  2. 将解剖好的膝关节转移至新的无菌培养皿中，并更换解剖刀和眼科剪。
  3. 使用解剖刀从膝关节采集关节软骨，再用眼科剪彻底修剪掉周围的结缔组织。

3. 软骨组织的消化

注意：使用胰蛋白酶消化软骨周围的结缔组织，随后用 0.2% II 型胶原酶消化软骨基质。

  1. 将收获的软骨加入3倍体积的0.25%胰蛋白酶中，在37 °C恒温摇床中振荡消化30分钟。
  2. 加入含10%胎牛血清（FBS）的PBS终止消化，用眼科剪去除软骨上的黏附组织，于4 °C下离心（500 × g，5分钟），弃去上清液。
  3. 用PBS重悬软骨组织，于4 °C下离心（500 × g，5分钟），弃去上清液，重复洗涤3次。
  4. 向处理后的软骨组织中加入0.2% II型胶原酶，在37 °C恒温摇床中振荡消化4小时。

4. 软骨细胞的分离与培养

注意：所有操作必须在生物安全柜内无菌条件下进行。使用注射器推杆在细胞筛上对软骨组织进行机械解离时，应佩戴无菌手套，以防止实验污染。在标准培养条件下，原代软骨细胞通常需要约2-3天达到80%-90%汇合度，用于首次传代。

  1. 将200 µm细胞筛置于无菌培养皿上，过滤消化后的软骨悬液，使其通过筛网。
  2. 使用无菌注射器活塞在筛网上研磨残留的软骨碎片，然后用完全DMEM培养基冲洗筛网。
  3. 收集所有滤液，离心（4 °C，500 × g，5 min），弃去上清液。
  4. 用PBS重悬沉淀，离心（4 °C，500 × g，5 min），弃去上清液。
  5. 用完全DMEM培养基重悬细胞，并转移至T25培养瓶中。
  6. 将培养瓶置于加湿培养箱中（37 °C，5% CO2）培养。
  7. 当细胞达到此融合度时，使用胰蛋白酶-EDTA进行传代，并以1:2比例进行继代培养。

5. 软骨细胞鉴定的II型胶原免疫荧光染色

注意：贴壁的软骨细胞表现为纺锤形和多边形形态。本研究中所有生物标志物分析均使用第2代细胞进行。第3代软骨细胞开始出现更明显的去分化现象，表现为向纺锤形、成纤维细胞样形态转变，并伴随增殖速率减慢。该表型变化在第4代之后更加明显。到第6代时，绝大多数细胞呈现细长的成纤维细胞样形状。抗体稀释比例依据制造商的建议确定，并通过我们的预实验验证，以确保最佳的特异性和信号强度。

  1. 将软骨细胞接种于24孔板中，培养24小时以促进细胞贴壁。
  2. 弃去培养基，用 PBS 洗涤细胞 3 次（向每孔加入 PBS，孵育 5 分钟，然后吸除）。
  3. 用4%多聚甲醛固定细胞10分钟，然后用PBS洗涤3次。
  4. 用0.3% Triton X-100（溶于PBS中）孵育细胞10分钟以进行细胞通透处理。
  5. 用 PBS 洗涤细胞 3 次，然后使用无动物成分的封闭液（150 µL/孔，稀释5倍× 在室温下于PBS中孵育1小时。
  6. 除去封闭液，加入一抗（抗Col II，1:200稀释），4℃孵育过夜 °C.
  7. 取出一抗，用 PBS 洗涤细胞 3 次。
  8. 加入Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG二抗（1:50稀释），37℃孵育 °在避光条件下于 C 反应 1.5 小时。
  9. 移除二抗，并用 PBS 洗涤细胞 3 次。
  10. 使用含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂封片，避光干燥 10 分钟。
  11. 使用倒置荧光显微镜观察并采集图像。

6. 软骨细胞纯度的流式细胞术分析

注意：软骨细胞的特征是能够合成并分泌II型胶原蛋白，后者可作为其鉴定的明确标志物。软骨肉瘤细胞系SW1353虽表现出部分软骨细胞特性，但缺乏分泌II型胶原蛋白的能力，因此在本实验中作为阴性对照。

  1. 使用无EDTA的胰蛋白酶消化软骨细胞和SW1353细胞。
  2. 用完全DMEM培养基中和消化反应，并将细胞重悬于PBS中。
  3. 将细胞与固定/透化溶液孵育15分钟，然后加入1 mL洗涤缓冲液。
  4. 离心（500 × g，5分钟），弃去上清液，在避光条件下用100 µL抗II型胶原抗体（1:100稀释）孵育15分钟，随后加入1 mL洗涤缓冲液。
  5. 离心（500 × g，5分钟），弃去上清液，在避光条件下用Alexa Fluor 488标记的抗兔IgG二抗孵育30分钟，然后加入1 mL洗涤缓冲液。
  6. 离心（500 × g，5分钟），弃去上清液，将每份样品重悬于200 µL洗涤缓冲液中，进行流式细胞术分析。

7. 软骨细胞的 IL-1β 刺激

注意：软骨细胞在 IL-1β 刺激下产生基质金属蛋白酶（MMPs）是其典型特征。因此，本研究采用 IL-1β 刺激以验证分离所得软骨细胞的这一表型特性。

  1. 从培养瓶中消化软骨细胞，并用完全DMEM培养基重悬。
  2. 计数细胞，并用完全DMEM培养基调整细胞浓度至 5 × 105 cells/mL。
  3. 将细胞接种至6孔板（共24孔），其中12孔设为空白对照组，12孔设为IL-1β刺激组。
  4. 将培养板置于细胞培养箱中孵育12小时。
  5. 待细胞完全贴壁后，向刺激组加入10 ng/mL IL-1β。
  6. 24小时后收集细胞培养上清液，用于酶联免疫吸附试验（ELISA）分析。
  7. 用PBS洗涤细胞两次。
  8. 使用RIPA裂解液裂解6个对照孔和6个IL-1β刺激孔的细胞，用于后续Western blot分析。
  9. 使用TRIzol从6个对照孔和6个IL-1β刺激孔中提取RNA，用于qPCR分析。

8. 定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）分析

注意：所有与 RNA 相关的实验均使用经 DEPC 处理的耗材进行。简言之，离心管和枪头用 0.1% DEPC 浸泡 12 小时，经高压灭菌（121 °C，20 分钟）以灭活 RN 酶及残留的 DEPC，并在使用前烘干。

  1. 向细胞沉淀中加入 1 mL Trizol，使用匀浆器充分匀浆。室温孵育 5 分钟。
  2. 加入 0.2 mL 氯仿，剧烈涡旋振荡 30 秒。室温孵育 3 分钟。
  3. 在 4 °C、12,000 × g 条件下离心 15 分钟。将无色水相转移至新的微量离心管中，并加入等体积的异丙醇。
  4. 充分混匀后室温孵育 10 分钟。在 4 °C、12,000 × g 条件下离心 10 分钟。弃去上清液，保留 RNA 沉淀。
  5. 向 RNA 沉淀中加入 1 mL 预冷的 75% 乙醇。充分涡旋振荡后，在 4 °C、12,000 × g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，保留 RNA 沉淀。
  6. 在生物安全柜中将 RNA 沉淀空气干燥。用 20 µL 无 RNase 水溶解 RNA。
  7. 使用 Nanodrop 分光光度计测定 RNA 浓度和质量。
  8. 使用逆转录试剂盒将总 RNA 逆转录为 cDNA。
  9. 配制反应体系：含 1 µg 总 RNA、4 µL 氯化镁溶液、2 µL dNTP 混合液、0.5 µL RNase 抑制剂、0.6 µL AMV 逆转录酶、1 µL 随机引物，以及无 RNase 水补足至终体积 20 µL。
  10. 在 42 °C 孵育 15 分钟，随后 95 °C 孵育 5 分钟。冷却至 4 °C 5 分钟后，用无 RNase 水稀释 cDNA。
  11. 配制 PCR 反应体系：含 2 µL cDNA、10 µL SYBR Green 实时 PCR 主混合液、上下游引物（表 1）各终浓度 0.2 µmol/L，以及无 RNase 水补足至终体积 20 µL。
  12. 设定 PCR 程序如下：95 °C 预变性 1 分钟，随后进行 40 个循环，每循环包括 95 °C 变性 15 秒、60 °C 退火 15 秒、72 °C 延伸 45 秒。在 72 °C 延伸步骤中采集荧光信号。
  13. 反应结束后，记录各样本及其内参的 CT 值。采用 2-ΔΔCT 法计算目的基因的相对表达水平。

9. ELISA 检测

注意：使用前新鲜配制生物素化抗体工作液和酶结合物工作液。

  1. 提前30分钟将ELISA试剂盒从冰箱中取出，使其平衡至室温。
  2. 根据试剂盒说明书配制所有所需溶液。
  3. 向指定孔中加入100 µL样品或不同浓度的标准品溶液（零孔仅加入标准品/样品稀释缓冲液）。用自粘膜密封板孔，于37 °C孵育90分钟（空白对照孔除外）。
  4. 弃去液体，每孔加入350 µL洗涤缓冲液，孵育30秒后弃去液体，并在厚吸水纸上拍干。重复洗涤4次。
  5. 每孔加入100 µL生物素化抗体工作液。用自粘膜密封板孔，于37 °C孵育60分钟（空白对照孔除外）。
  6. 弃去液体，每孔按步骤4所述方法洗涤4次。
  7. 每孔加入100 µL酶结合物工作液。用自粘膜密封板孔，于37 °C孵育30分钟（空白对照孔除外）。
  8. 弃去液体，每孔按步骤4所述方法洗涤4次。
  9. 每孔加入100 µL底物溶液。避光并于37 °C孵育15分钟。
  10. 每孔加入100 µL终止液，充分混匀后立即在450 nm处测定吸光度（OD）。
  11. 使用CurveExpert软件生成标准曲线，并计算样品浓度。

10. 蛋白质印迹分析

注意：实验前，预先配制电泳缓冲液、转膜缓冲液、TBST、5%脱脂奶粉，并将PVDF膜剪裁至合适尺寸。随后，使用化学发光成像系统捕获化学发光信号。将仪器设置为自动或手动模式进行梯度曝光，曝光时间通常为10秒至5分钟，以确保信号处于线性动态范围内，并避免像素饱和。信号捕获后，选择目标条带清晰且背景低的曝光图像用于后续定量分析。

  1. 配制 RIPA 裂解缓冲液（含 1% PMSF 和 1% 磷酸酶抑制剂），按 250 的比例加入 RIPA 裂解缓冲液 µ6 孔板每孔 1 L
  2. 使用超声波破碎仪裂解细胞（3个循环，每次7-10秒），并在冰上孵育30分钟。
  3. 4 ℃下离心裂解液 °C,12,000 × g 孵育10分钟，然后收集上清液用于蛋白质定量。
  4. 使用二辛可宁酸（BCA）法测定蛋白浓度。
  5. 使用 RIPA 裂解缓冲液将蛋白质浓度调整至相同水平。
  6. 加入5× 以4:1的比例（样品：缓冲液）将上样缓冲液加入样品中。
  7. 将样品煮沸10分钟，然后在4℃下离心 °C，12,000 × g 10 分钟后，收集上清液用于电泳。
  8. 将SDS-PAGE凝胶安装至电泳槽中，并加入电泳缓冲液至梳子完全浸没。
  9. 移除梳子，将样品加入上样孔，并在参考泳道中加入蛋白质ladder。
  10. 电泳运行至溴酚蓝染料迁移至凝胶底部，然后拆卸装置并取出凝胶。
  11. 组装转移装置 "三明治" 并在恒定电压下进行湿转。
  12. 用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭PVDF膜1小时。
  13. 4℃下与稀释的一抗孵育过夜 °C.
  14. 回收一抗，并用 TBST 洗涤膜（5 × 5 分钟）。
  15. 室温下与HRP标记的二抗孵育90分钟。
  16. 回收二抗，用TBST洗涤膜（5 × 5 分钟）。
  17. 配制ECL底物溶液，并避光保存。
  18. 将ECL底物加入膜上，使用具有梯度曝光功能的成像系统捕获化学发光信号。
  19. 使用 ImageJ 软件分析条带强度，并计算相对蛋白表达水平以进行后续分析。

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结果

II型胶原免疫荧光染色显示，分离的软骨细胞呈强阳性（图1A）。流式细胞术分析进一步表明，超过98%的细胞表达II型胶原（图1B），而阴性对照SW1353细胞为阴性（图1C）。用10 ng/ml IL-1β刺激24小时后，Western blot结果显示软骨细胞中MMP3和MMP13蛋白水平显著升高（图2A），RT-PCR分析显示软骨细胞中MMP3和MMP13的mRNA表达显著增加（图2B），ELISA检测到细胞培养上清液中MMP3和MMP13蛋白含量大幅上升（图2C）。

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讨论

本文所述方案在原代大鼠关节软骨细胞的分离与培养方面具有多项关键优势。使用 suckling 大鼠对于获得最佳的细胞产量和活性至关重要，因为幼龄动物的软骨相比成年软骨含有更多的增殖性软骨细胞和更少的矿化基质。这一年龄选择显著提高了酶消化的效率以及后续的细胞回收率。

逐步酶消化法是本方案的关键环节。初始的胰蛋白酶处理可有效去除周围结缔组织，并部分破坏软骨基质；随后的胶原酶II消化则特异性作用于软骨细胞周围富含II型胶原的细胞外基质。4小时的胶原酶消化时间经过优化，可在充分释放细胞的同时最大限度减少细胞损伤。消化时间过短可能导致细胞释放不完全，而消化时间过长则可能影响细胞活力和表型。

使用注射器活塞进行机械解离对于打碎软骨碎片并释放单个细胞至关重要。此步骤必须轻柔操作，以避免细胞过度损伤，同时确保充分的组织解离。整个操作过程中无菌技术至关重要，因为软骨细胞培养物特别容易受到污染。

本方案中采用的多方面验证方法可确保分离获得的软骨细胞具有真实性和功能性。II型胶原免疫荧光染色是鉴...

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披露

作者在本研究中无利益冲突。

致谢

本研究由国家高水平医院临床科研基金和中日友好医院精英医学人才项目（编号：ZRJY2025-QM05）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4% 多聚甲醛SolarbioP1110
5× 上样缓冲液SolarbioP1040
Alexa Fluor 488 标记的山羊抗兔 IgG中杉金桥生物技术ZF-0511
无动物源性封闭液Cell Signaling Technology15019
抗胶原蛋白 II 抗体Abcamab34712
二辛可宁酸（BCA）蛋白质定量试剂盒SolarbioPC0020
胶原酶 II翊圣生物40508ES60
含 DAPI 的荧光封片剂中杉金桥生物技术ZLI-9556
杜尔贝科改良伊格尔培养基Solarbio11995
胎牛血清（FBS）SolarbioS9010
辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔 IgG中杉金桥生物技术ZB-2301
IL-1βpeprotech400-01B
MMP13 兔单克隆抗体ABclonalA11148
MMP3 兔单克隆抗体ABclonalA11418
脱脂奶粉SolarbioD3840
磷酸盐缓冲液（PBS）SolarbioP1020
PVDF 膜Thermo Fisher Scientific88518
大鼠 MMP-13 ELISA 试剂盒NouvsNBP3-06931
大鼠 MMP-3 ELISA 试剂盒NouvsNBP3-06894
反转录试剂盒PromegaA3500
RIPA 裂解缓冲液SolarbioR0010
无 RNase 水SolarbioR1600
SDS-PAGE 凝胶EpizymePG112
SYBR Green 实时荧光定量 PCR 预混液ToyoboQPK-201
Triton X-100SolarbioT8200
TRIzolSolarbio15596026
胰蛋白酶SolarbioT1320
超敏 ECL 化学发光底物试剂盒NCM BiotechP10300
β-肌动蛋白兔单克隆抗体ABclonalAC026

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