一个用于钩 端螺旋体 生物膜定量、结构和功能分析的模块化工作流程

Summary

该方案提供模块化的BSL-2工作流程，结合晶体紫生物质测定、延时相位对比动力学、共焦三维/基质映射、SEM超微结构以及 体内 仓鼠感染模块，培养、定量、表征并研究 钩端螺旋 体生物膜的功能角色，实现实验室间突变体和抗生物膜干预的标准化评估。

Abstract

本文介绍了一套整合的方案，用于培养、定量监测、结构和功能特性分析，分析Leptospira spp.生物膜的长期变化。该工作流程结合了晶体紫微滴定法测量多个时间点的生物膜生物量，以及区分附着（生物膜）和非附着（液相）细菌群体的时间分辨方法，进行无损动力学观察的延时相位对比成像，利用共聚焦激光扫描显微镜生成带有基质探针读数的完整三维重建，以及膜支持扫描电子显微镜进行超微结构分析。 同时，我们详细介绍了一种标准化程序，用于收集完整生物膜聚集体并准备用于腹腔注射至易感的金叙利亚仓鼠模型中，从而在体内直接评估生物膜相关毒力，同时结合匹配的浮游生物对照。

针对致病株 Leptospira interrogans Manilae L495进行了优化，每个模块都可以轻松迁移到其他 Leptospira 物种和突变文库中，以比较生物膜形成能力。这些协调模块共同为筛选抗生物膜策略、探究遗传决定因素以及阐明生物膜对 钩端螺旋体 持久性和致病机制的贡献提供了坚实基础。

Introduction

生物膜是结构化的微生物群落，其中细胞嵌入由多糖、蛋白质、核酸和脂质组成的自分泌胞外聚合物质（EPS）基^质中。该基质提供机械稳定性，介导表面附着，并通过赋予对干燥、氧化应激和抗菌剂等环境应激的耐受性，提升微生物存活率 ^2,3。在致病细菌中，生物膜促进持久性、免疫逃避和慢性感染 ^4,5。

与浮游细胞相比，浮游细胞是自由漂浮且代谢更均匀的，生物膜相关细胞表现出基因表达、生长速率和^{代谢活性的}改变6。这些差异增强了对环境挑战、抗生素和宿主防御的耐受性，同时允许协调行为，如群体感知、营养保持和^{空间组织 7,8}。

生物膜的形成在模式生物中已被广泛描述，如铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和霍乱弧菌，这些生物共同塑造了我们对生物膜生活方式遗传、结构和生理基础的理解。关于铜浆假单胞菌的研究显示，外多糖和群体感应协同作用，共同塑造复杂的三维生物膜结构 ^9,10。关于金黄色葡萄球菌的研究强调了表面蛋白和细胞外DNA在增强生物膜凝聚力和抗生素耐受性方面的作用^11,12。对弧菌物种的研究进一步凸显了生物膜形态的惊人多样性及其在水生环境中的生态意义¹³。这些系统共同为生物膜研究提供了坚实的概念和方法论框架，并由标准化协议¹⁴和对现有技术^{的关键评估15、16}强化，共同强调了在研究较少研究细菌（如钩端螺旋体）生物膜形成时需要统一的方法。

螺旋体属钩端螺旋体的成员，作为钩端螺旋体病的致病因子，长期以来被认为是主要浮游体。近期研究已实验证明多种物种间存在强健的生物膜^形成。虽然一些研究表明生物膜在环境¹⁸和宿主相关¹⁹环境中形成，但也有实验证明细端螺旋体能在Rattus norvegicus²⁰的肾小管和马²¹的玻璃体中形成生物膜，同时还能检测环境生物膜^22,23中的细螺旋物种。因此，解读钩端螺旋体生物膜的条件和机制对于理解环境传播、储存库的持续性和疾病发病机制至关重要^24,25。

现有的细螺旋体生物膜检测数据零散，范围从定性显微观察^17,26到终点比色或晶体紫染^27,28。虽然这些研究为生物膜形成提供了宝贵见解，但它们通常缺乏实时监测生物膜成熟和扩散所需的动力学分辨率，以及共聚焦或电子显微镜提供的超微结构背景。持续监测和三维结构分析被认为是捕捉生物膜形成和扩散动态特性的关键^14,15。这些局限性阻碍了各研究的可比性，并限制了对影响生物膜形成和扩散的因素或干预措施的系统评估，凸显了需要一个标准化、多读数的工作流程，以可复现且全面的方式捕捉钩端螺旋体和生物膜的结构和功能动态。

为弥补这些空白，我们开发了一个集成的模块化工作流程，统一了来自同一文化系列的六个互补读数。首先，高通量CV微量滴度测定法在多个时间点定量附着的生物量。其次，在96孔板中进行时间分辨分离测定，按OD₄₀₅划分总液相（未附着或部分脱离）和附着（生物膜）群体，以追踪其在形成和扩散过程中的演变。这里“液相”一词涵盖了浮游型和脱离型细胞，承认自由生活与表面相关表型之间的动态连续体^29,30。第三，延时相位对比成像提供了无损的粘附力、整体运动性和聚合动力学。第四，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）实现了全三维重建，包含活死和矩阵探针读数，实现深度依赖的可行性和矩阵映射。第五，膜或覆盖滑移支持的扫描电子显微镜（SEM）以高分辨率解析细胞外结构和基底-顶端极性。此外，还加入了一个体内模块，通过腹腔注射生物膜聚集体评估易感的金叙利亚仓鼠模型的毒力，该模型是钩端螺旋体^病31,32,33的敏感且成熟的模型。该方法将生物膜表型与致病潜力联系起来，提供功能背景，补充体外分析。

与单模态方法相比，该平台具有多项优势：（i） 同步定量（CV和分馏OD）和结构（CLSM/SEM）读数;（ii）对早期附着、生长、成熟和扩散进行无损动力学监测;（iii）利用靶向探针进行三维可行性和基质表征;（iv）细胞外基质结构的超微可视化;以及（v）在易感仓鼠模型中直接评估生物膜相关与浮游生物毒力的差异，均可通过标准BSL-2基础设施实现。通过利用多孔格式和可拆卸的玻璃或聚碳酸酯基底，工作流程支持环境变量、抗菌化合物或突变体库的复现筛选，同时保持无菌性、通量和跨模块交叉验证。

专注于生态学、持久性、宿主-病原体相互作用或抗生物膜发现的实验室可以采用单个模块或完整流程。所需资源仅限于板读器、带环境控制的倒置显微镜以实现延时摄影、共聚焦显微镜和SEM设施，以及仓鼠模型的标准动物设施，从而实现广泛应用和可重复的实验比较。

Protocol

伦理声明：
本研究获得新喀里多尼亚巴斯德研究所动物护理与使用委员会批准，并按照巴黎巴斯德研究所动物护理与使用委员会制定的指导方针及欧洲建议2007/526/EC进行。动物研究实验注册号：IPNC-2018-ARE-001

注意：所有涉及活 钩端螺旋体 培养的作必须在生物安全二级（BSL-2）实验室进行，并遵守机构生物安全指南。所有培养作必须在生物安全柜内进行，以确保操作员安全并防止环境污染。

本研究中使用的 Leptospira interrogans serovar Manilae菌株L495最初来自法国巴黎巴斯德研究所收藏，现由新喀里多尼亚巴斯德研究所保存。为了保持毒力，该菌株会定期从受感染的仓鼠中重新分离。所有 体外 实验中，从动物宿主回收后，培养物未维持超过六个亚培养。

所有动物作必须遵守机构指南，并经相应动物护理与使用委员会批准。实验应遵守欧洲动物福利法规（欧盟指令2010/63）及公共卫生服务的建议，确保动物使用既合理又符合伦理规范。

1. 细菌接种剂的制备

1. 在需氧条件下，在30°C的EMJH培养基³⁴中培养Leptospira spp.细胞，且不抖动，使用平底螺旋盖玻璃管，直到培养达到中期对井阶段。在这种情况下，L. interrogans serovar Manilae菌株L495，一种通过仓鼠在体内定期维持的低传导菌株，通常在3-5天内达到适当的细胞密度。确保培养物在405纳米（2至5 x 10⁸细胞/mL）下达到0.2-0.4的O.D.，然后在新鲜EMJH培养基中稀释，并通过20倍放大的暗场显微镜检查其运动性和无凝聚。
   注意：EMJH具有本征吸收性。用无菌EMJH清除分光光度计，并从所有读数中减去该值。接种物可以通过测量光学密度或使用Petroff-Hausser腔进行直接细胞计数来标准化。对经验证的中期对井培养进行1：100稀释通常得到OD₄₀₅ = 0.02（≈1 x 10⁶ 细胞/mL）。通过倒转轻柔混音;不要旋转。
2. 在暗场显微镜下以20倍放大镜观察10微升的分量。确保≥90%的细胞高度活跃，且没有可见的团块。将验证的中期培养液1：100稀释于新鲜EMJH中，得到OD₄₀₅ = 0.02（≈1 x 10⁶ 细胞/mL）。通过倒转轻柔混音;不要旋转。
   注意：一个工作接种物支持本协议中描述的所有下游检测（见图1）。准备36毫升用于播种24孔板（1毫升/孔），或20毫升用于播种96孔板（200微升/孔）。调整体积以匹配所需的板数。

图1。 钩端螺旋体 生物膜分析的全局工作流程。指数级增长的 钩端螺旋体 培养物首先被评估生长情况，并通过光学密度进行标准化。培养物随后被分配到含玻璃或膜的板、显微镜微盘或96孔板中。工作流程包括七个模块：（1）接种制备;（2）用于生物量定量的晶体紫染色;（3）通过扫描电子显微镜（SEM）进行超微成像;（4）通过延时相差显微镜进行动态生物膜监测;（5）通过CLSM实现的三维可视化，采用活/死染色;（6） 通过 光学密度对生物膜形成过程中附着和未连接的分数进行时间分辨定量;以及（7）研究叙利亚仓鼠感染期间生物膜的功能作用。这种综合方法支持对生物膜的形成、结构和致病性的多模态分析。 请点击此处查看该图的放大版本。

2. 基于晶紫的生物膜定量，覆盖膜或膜上的生物膜

1. 在BSL2生物安全罩内，使用无菌镊子在无菌24孔板带盖板底部平铺12毫米无菌玻璃盖片或0.1微米无菌亲水聚碳酸酯膜。预先在30°C下浸泡膜/玻璃盖片2小时，并加入1毫升无菌EMJH。
   注意：虽然非必需，但预先浸泡底物于EMJH中可以改善润湿性并略微增强细菌的附着力。
2. 取出浸泡溶液，向每个孔加入1.5毫升稀释的细菌悬浮液（OD₄₀₅ = 0.02 ≈ 1 x 10⁶ 细胞/mL）。确保盖膜或防水膜牢固地固定在底部。
3. 在30°C的静止条件下、潮湿的氛围下孵育平板，通过在培养箱内放置装满水的托盘以防止培养基蒸发来维持。对于生长缓慢的菌株，建议潜伏3周，以形成成熟且附着的生物膜。
4. 在指定时间点，小心地从每个孔中尽可能多地去除培养基，同时不扰动生物膜。用1毫升无菌磷缓冲生理盐水（PBS）轻柔冲洗每个孔，去除残留的不粘附细胞，保持盖片贴合井底，避免易碎生物膜细胞脱落。在此条件下，生物膜的生长主要发生在覆盖泥浆的上表面，底部生长较少，因此只需冲洗而不抬起即可富集表面附着细胞，以便下游分析。
   注意：生物膜在此阶段极其脆弱，容易误吸入。钻管应沿井壁缓慢且精确地进行，以避免破坏生物膜。
5. 通过在37°C的PBS中加入1毫升4%对甲醛（PFA）30分钟，固定生物膜样品。去除固定剂，并用1毫升PBS小心冲洗两次。
   注：固定时，需新鲜制备4%甲醛溶液（16%无甲醇高料，1：4稀释于PBS），使用后丢弃，因为聚合转化为对甲醛会降低交联活性。
6. 向每个孔加入1毫升0.1%（w/v）水晶紫（CV）溶液，并在室温下培养15分钟，确保膜或盖片完全覆盖。
7. 丢弃染料，用1毫升PBS冲洗两次。
   注意：水晶紫罗兰和对甲醛（PFA）有毒，可能刺激皮肤和眼睛。务必戴手套，并小心处理这两种化学品，最好在排气柜内使用。按照机构安全指南，将废物处理在指定的危险染料或化学废弃物容器中。
8. 倾斜盘子，排干残留液体。在室温下自然风干，直到基底完全干燥（≥4小时，最好过夜）。
   注意：此阶段，覆盖膜表面可能可见点状或网状结构（见图2A）。
9. 每孔加入500微升洗脱缓冲液（50%乙醇，50%冰川醋酸（体积/体积））。将培养盘孵化15分钟。上下移液器，完全溶解与生物膜结合的晶体紫。
10. 将每个样品200微升转移到光学透明的96孔微板中，测量570纳米的吸收率。减去仅用底物空白，该空白片通过固定、CV染色、洗涤和洗脱处理未接种覆盖片或膜，去除内在结合/背景。记录至少三次技术重复±的平均标准差。如果吸收度超过分光光度计的线性范围，则用洗脱缓冲液稀释样品。

3. 利用扫描电子显微镜（SEM）进行生物膜可视化

1. 在BSL2生物安全罩内，使用无菌镊子在无菌24孔板带盖板底部平铺12毫米无菌玻璃盖片或0.1微米无菌亲水聚碳酸酯膜。预先在30°C下浸泡膜/玻璃盖片2小时，并加入1毫升无菌EMJH。
2. 取出浸泡溶液，向每个孔加入1.5毫升稀释的细菌悬浮液（OD₄₀₅ = 0.02 ≈ 1 x 10⁶ 细胞/mL）。确保盖膜或防水膜牢固地固定在底部。
3. 在湿度控制培养箱中，以30°C静止条件下培养板，以防止培养基蒸发。对于生长缓慢的菌株，建议孵育3周，以形成成熟且附着的生物膜
4. 在指定时间点，小心地从每个孔中尽可能多地去除培养基，同时不扰动生物膜。
5. 然后用1毫升无菌PBS轻柔冲洗每个凹槽，去除残留的不粘附细胞，保持盖片贴平于井底，避免剥落脆弱的生物膜细胞。在此条件下，生物膜的生长主要发生在覆盖泥浆的上表面，底部生长较少，因此只需冲洗而不抬起即可富集表面附着细胞，以便下游分析。
   注意：生物膜在此阶段极其脆弱，容易误吸入。钻管应沿井壁缓慢且精确地进行，以避免破坏生物膜。
6. 直接向井中加入4%对甲醛（PFA）和1%戊二醛，含钠麙二甲酸缓冲液（0.2 M，pH 7.4）以固定生物膜。
7. 在37°C下孵育30分钟，然后去除固定剂，并用PBS冲洗盖膜或膜两遍。这种方法既能保护表面附着的生物膜，又能最大限度地减少脱落，因为在我们这里的条件下，大多数生物膜的生长发生在覆层的上表面。
   注：固定时，需新鲜制备4%甲醛和1%戊二醛溶液（16%无甲醇高汤，1：4稀释于钠二甲酸盐缓冲液中），使用后丢弃，因为聚合转化为对甲醛会降低交联活性。
8. 将底物浸泡在稀释于PBS中的1%四氧化锇（OsO₄）中1小时，以增强SEM对比度。用PBS冲洗两遍。
9. 通过依次浸泡在浓度逐渐增加的分级乙醇序列中进行脱水：25%、50%、70%、90%和100%（v/v），每个序列10分钟。
10. 加入500微升六甲基二硅嗪，培养5分钟，然后更换为新的HMDS，再培养5分钟。去除多余的HMDS，让样品在排气罩下完全自然风干。
    注意：戊二醛、PFA、砷酸钠、四氧化锇和六甲基二硅烷有毒，必须在化学熏风罩下并配备适当的个人防护装备处理。
11. 用双面导电碳带将干燥样品固定在SEM短板上。在样品上涂覆一层薄薄（~10纳米）的金或铂，提供足够的电子对比以支持SEM成像。这使得高分辨率可视化生物膜结构，包括细胞间接触、细胞外基质形态、密度和异质性，无需额外的染料或染色。
12. 使用相应的样品架将短管装入SEM。尽量在夜间抽空腔室以提升成像质量，然后采集5-15 kV的次级电子图像，并配合合适的放大倍率，以揭示生物膜超微结构（见图2）。

4. 生长生物膜的延时相位对比成像

1. 将500微升工作接种物（OD₄₀₅ = 0.02 ≈ 1 x 10⁶ 细胞/mL;见 第1节）移液器，注入无菌35毫米玻璃底Hi-Q4皿，配备平面平行盖以消除半月板变形。避免引入气泡，并立即关闭碗碟。
   注意：35毫米玻璃底Hi-Q4天线包含4个不同的培养区，可用于同时成像4种不同病况。分配一个区间给无菌EMJH培养基作为负面对照，另外三个区间用于技术复制或不同菌株/突变体。
2. 将天线放置在配备相差光学、电动对焦驱动（生物站IMQ）和湿度为30°C、相对湿度95%的倒置显微镜的环境台上。这些条件有助于在长时间成像（长达8天）中减少蒸发。
3. 启动BioStation IMQ应用程序，在主界面中打开 新的延时设置 窗口以访问配置面板。开始实验前，检查状态显示上的环境参数，确保舱室和水温指示器均显示稳定，以防止采集时帧漂移。
4. 在“新缩时设置”界面，选择 “实时 ”标签，在 观测条件 面板中选择相 位对比（pH） 作为滤镜，并将 放大 倍数设置为 20倍，配置成像参数。
5. 在 手动模式下，调整 光强 和 曝光时间 ，以优化对比度同时避免饱和。请使用饱 和度检查 按钮验证。定义四个采集点，对应四个区室的中心。
6. 使用Jog Dial或直接点击 实时观测图像 显示，依次将舞台置于每个舱室上方。
7. 用对焦按钮细化对焦，并通过点击 延时实验点注册 按钮记录每个位置。注册点在观测点验证显示中以蓝色框形式显示，并在点标签页中确认。
8. 通过打开 时间 标签页并点击 “新” 来编程采集计划，进入延 时摄影对话框 ，获取 周期 设置为 30分钟 ， 总时间 为 7天。
9. 点击应用后，软件会自动计算获得回合数。通过 右键点击标题栏，选择 偏好设置并启用 自动对 焦模式，确保每个关卡位置都能重新对焦。验证曝光设置、增益和光强在所有点的一致性，然后用 保存 按钮保存整个配置。
10. 点击 开始延时摄影开始采集。软件会自动切换到延时影像，实现7天实验期间对采集进度和腔室稳定性的持续监控。所有图片都会自动以TIFF格式保存在软件创建的实验文件夹中。
11. 通过将图像堆栈导入FIJI（图3A、B、C）处理和量化图像序列。
12. 通过 导入 > 图像序列文件>打开对应的图像堆栈，确保帧按时间顺序加载。
13. 使用 图像>类型> 8位 将对齐堆栈转换为8位灰度，以标准化像素强度。
14. 使用 图像>调整阈值 以分离细菌生物膜区域>施加阈值化。通过选择 应用，在所有帧中应用一致的阈值设置，然后使用 Process > Binary > Make Binary，将结果保存为二进制遮罩。
15. 使用 “分析”>“分析粒子”进行量化，记录面积、面积百分比和平均强度等参数。
16. 通过 结果窗口 （文件>另存为> .csv）自动导出每帧结果到电子表格，进行动力学分析。将所有测量表示为生物膜覆盖田地面积（表面积）的比例。

5. 利用共焦点扫描激光显微镜（CLSM）进行生物膜可视化

1. 将1.5毫升工作接种剂（OD₄₀₅ = 0.02 ≈ 1 x 10⁶ 细胞/毫升;见 第1节）接种到无菌的35毫米玻璃底盘中。静置于含水储备箱的加湿箱中，培养箱内温度为30°C，直到达到预期发育阶段（最多21天）。
2. 在选定时间点，小心地沿着碟壁缓慢吸取培养基，同时不扰动生物膜。用2毫升无菌PBS冲洗一次以去除浮游细胞，务必极度小心，避免脱落或破坏生物膜。
3. 准备需要与未固定（活体）生物膜一起孵育的染色溶液（在固定前进行）。
   1. 对于活/死染色，将3微升SYTO9绿色荧光核酸染色（1.67毫米）和3微升碘化丙二醇（18.3毫米）加入10毫升PBS中，形成染色溶液。将200微升染色液直接加入形成生物膜的细菌上，然后在室温下黑暗中孵育30分钟，再用PBS冲洗一次。
   2. 活细胞示踪剂也可用于固定前染色细胞。用10 μM CFDA/SE示踪剂培养活细胞30分钟。或者，也可以用5 μg/mL浓度的FM4-64标记膜。在PBS上冲洗一次。
4. 通过在PBS中加入2毫升4%的对甲醛溶液，并在37°C下培养30分钟，固定生物膜。 去除固定液，用PBS冲洗两次。
5. 加一滴防褪色装裱介质覆盖生物膜，避免气泡。
6. 在配备可调白光激光器（WLL）和HC PL APO CS2 63×/1.4 NA油浸物镜的倒置共軛焦显微镜上获取Z叠。对于CFDA/SE，将激发设置为488纳米，并利用1艾里单位（AU）的针孔采集500-550纳米的发射。对于FM4-64，将激发设为561纳米，探测发射波长为630-700纳米，同样带有1天文单位的针孔。
7. 在整个生物膜厚度中，以0.5-1.0微米间隔获得Z堆叠。调整激光功率和探测器增益，以最大化动态范围，同时避免饱和（<1%像素饱和）。
8. 使用线平均法（2-4×）来提升信噪比，并保持所有成像参数（激光功率、探测器带宽、针孔大小、扫描速度）在样品间保持不变。
9. 将图像栈保存为12位文件，并导出为.lif格式，用于FIJI（ImageJ）中的定量分析。
   注意：成像前，确保显微镜设置（如激光功率、探测器增益、针孔大小）使用相同染料染色的对照样品进行标准化。这一校准步骤对于最小化采集间的变异性并实现实验间的可靠比较至关重要。
10. 使用配备COMSTAT插件（或同等3D分析软件）的FIJI处理和量化共聚焦图像堆栈¹⁰。测量生物体积、平均厚度和最大厚度、表面覆盖率以及活死比（或其他预定义指标）。输出代表性正交视图和最大强度投影，用于说明（图3D， E）。

6. 在96孔微量滴定法中，定量生物膜形成过程中附着和未连接组分的时间分辨

1. 将工作接种剂（OD₄₀₅ = 0.02 ≈x 10⁶ 细胞/毫升;见第1节）接种到96孔板的孔中。在30°C静止孵育，直到目标时间点（第3、5、7、10、12、14、17或21天）。
   注意：使用96孔板时，尤其是当培养箱缺乏湿度控制时，边界效应和蒸发很常见。为减少这些影响，应在所有周边井中添加200微升无菌蒸馏水。此外，板材被放置在一个加湿箱内，箱内有水库，然后放置在孵化器内，以进一步减少蒸发并保持井间湿度的稳定。
2. 在每个时间点准备三种样品类型：
   1. 全悬浮——通过多次轻柔移液，均匀化含生物膜的一口井的全部内容，避免气泡形成。该比例代表了细菌的总数量，包括未附着的细粒螺旋和半附着生物膜中的细粒。这一均质步骤有助于分散可能干扰后续吸光度测量的细胞聚集体。
   2. 液相——从第二孔中小心去除180微升的上清液，同时不扰动生物膜层。转移到空井中，加入20微升新鲜EMJH培养基。轻轻上下移液几次，以分散细胞聚集体。该部分代表液相中存在的非附着细胞，可能包括自由悬浮的细粒细胞和脱落的生物膜聚集体。
   3. 生物膜——在第2.2步使用的同一井中，通过加入180微升新鲜EMJH培养基并轻柔地上下移液，重新悬浮剩余生物膜。该比例对应生物膜中的细端态。
3. 在确保每口井完全均质后，使用分光光度计测量每个悬浮液在405纳米处的吸光度，并绘制取值以生成具有代表性的图表（图4A）。

7. 研究生物膜在宿主感染期间的功能作用

1. 将工作接种剂（OD₄₀₅ = 0.02 ≈x 10⁶ 细胞/毫升;见第1节）接种到96孔板的孔中。在30°C下静止孵育，直到达到预期发育阶段（最多21天）。
2. 要确定接种物浓度，应专门设立专门用于生长监测的“生物膜防治”井，不用于动物注射。当生物膜在宏观上可见后，轻轻从一个对照井中取出180微升上清液，且不扰动生物膜。更换为180微升新鲜EMJH培养基，小心地重新休眠生物膜聚集体，避免产生气泡，并测量OD₄₀₅ 以估算细菌浓度。
   注意：原则上，在定量前清洗孔洞有助于去除不粘附的细胞。然而，由于 钩端螺旋体 生物膜在96孔板中附着力较弱，洗涤会导致生物膜材料失控流失。因此，重新封存步骤在未进行预洗的情况下进行，以确保孔间的重复性和细菌浓度的一致性。
   生物膜控制井通常含有~2 x 10 8^个细端螺旋体，这被选为仓鼠感染实验的标准接种物。该浓度也决定了用作对照的浮游细粒蛋白的目标数量。在加入时，浮游对照剂通过在EMJH培养基中新鲜亚培养，在30°C的摇晃条件下，持续长达5天，对应于中后期指数生长阶段，细胞密度相近。
3. 动物接种时，使用独立的生物膜孔（不要用对照组）。小心从孔中去除180微升上清液，以消除大多数液相细螺旋体。
4. 使用200微升移液器尖端收集剩余的含20微升生物膜集合体，以避免破坏结构。
   注意：生物膜很脆弱。确保骨料在收集前后都可见。准备额外的井以备不时之需。
5. 将骨料转移到预装300微升新鲜EMJH培养基的注射器中。让骨料通过重力沉降。
6. 连接一根21克针头，轻柔地排出多余的EMJH，直到达到最终体积200微升。确保没有气泡残留，生物膜聚集体保持可见。
   注意：等待总量结算可以最大限度地减少成交量调整期间的损失。在 体内使用 前，确认骨团通过21克针头后是否保持完整（图4C、D）。
7. 在200微升EMJH培养基中进行2个10⁸细端螺旋体腹腔注射。
   注意：使用7-8周大的金色叙利亚仓鼠（两性），并在标准饲养条件下饲养。对于阴性对照，仅注射200微升EMJH培养基（每次复制一次只注射一只动物）。
8. 每天监测两次动物，最长可达21天，以观察钩端螺旋体病的临床迹象（毛发蓬乱、俯卧和刺激反应减退）。如果观察到疼痛， 应立即吸入 二氧化碳安乐死，并将安乐死时间记录为死亡时间。
9. 第21天，安乐死所有存活的动物。
   注意：使用不同日期制备的培养物进行三次独立的生物复制。每次复制包括每个病症的两只动物和一只负性对照动物。

Results

当接种物正确制备时，培养物在3-5天内进入对井中期，OD₄₀₅值为~0.2-0.4，暗场显微镜下呈现明亮且高度运动的场（≥90%的细胞活动），且无可见团块。次优制剂表现为细菌迟缓和田间运动异质;此类培养物常常产生较弱的生物膜，应予弃置。实际上，在播种前立即并排确认运动力和内线，可以最大限度地减少失败的跑动。在接种阶段建立这些质量控制门槛，是下游应用成功的最佳预测指标。虽然该方法针对L. interrogans serovar Manilae L495进行了优化，但同样的程序也应用于Leptospira biflexa Patoc菌株，以验证跨物种适用性。与L. interrogans相比，双屈线杆菌通常形成的生物膜凝聚力更差且更薄，但通过适当参数调整，其特征性的发育序列和结构特征仍可检测。因此，包含这两个物种强调了该工作流程对致病性和腐生性Leptospira的适应性。

在加湿室中静止孵育21天后（或适合使用 钩端螺旋体 属的适当时间），生物膜在玻璃盖片和亲水聚碳酸酯膜上肉眼可见。成功生长后2-3周会产生典型的CV图案，如点状、分枝或网状足迹附着于表面（图2A）。

在典型的测试中，野生型L . interrogans Manilae L495在第3周达到~50%的表面覆盖率，而低生物膜突变体的平台约~20%，高生物膜表型接近~70-80%，建立了实用的筛查动态范围。生物膜形成的程度也可能因 细端螺旋体 属种类和菌株而异;例如， L. biflexa Patoc菌株能更快形成可见生物膜，先前研究认为接种后120小时内的结构即为成熟生物膜³⁵。

晶体紫染色为定量生物膜生物量提供了一种可靠且可重复的方法。在高度发育的生物膜中，染色会导致覆盖膜区域局部出现深紫色，表明附着生物量含量较高（图2A）。染色和溶解步骤中的视觉线索也为方案成功的有用指标提供参考。例如，CV分布不均或染色浅色可能是由于播种不足、蒸发或过度洗涤导致早期生物膜脱落所致。

570 nm的吸收读数反映了残留染色的量，因此反映了相对生物膜密度（图2B）。在代表性实验中，在最佳条件下培养的 L. interrogans 培养物在复制品间显示出一致且可重复的OD₅₇₀读数，反映出稳定的生物膜形成。相比之下，当样本在介质变化时进行过度移液时，复制品间常出现较大差异，表明粘附不良或部分生物膜脱落。这种变异应被视为技术问题的信号，应排除受影响样本或仔细审查该方案。值得注意的是， 双卷叶菌 在类似条件下在玻璃覆膜和聚碳酸酯膜上形成更广泛的生物膜，这反映在更高的 CV 吸收值上，证明该方案在细 螺旋体 属物种中具有适应性和有效性。

成功的SEM制备能在第3天揭示细胞外基质沉积，随后成熟生物膜呈现显著偏振结构：基面粗糙且通道状（通常有>5微米通道），锚定着多孔的内部结构;螺旋体缠绕在致密基质中，顶端面更为光滑（图2C， D、E、F）。高倍率场常捕捉到分支的细胞外丝状物和偶尔出现的蘑菇状突起;这些特征对应于延时摄影中观测到的聚合动力学（补充视频1）。在不理想的制剂中，可能会观察到基质塌陷、充电和细胞轮廓不清晰，通常反映固定后不充分、导电涂层不足或干燥不良。当基底-顶端极性和普遍通道明显时，SEM读数与共聚焦厚度和孔隙度估计高度一致，确认制备和成像均成功完成。

在有效的延时序列中，孤立的点点在24-72小时内出现，逐渐凝聚成较大的聚集体，在空间限制减缓其运动前横扫地表（图3A、B、C）。定量分割导致覆盖面积单调增加，而总计量在约12至216小时之间随着碰撞和合并的主导性上升、峰值，随后下降。这些动力学（面积上升，集合体数字下降）表明的是活跃的吸积，而非单纯的沉积。失败或边缘运行缺乏早期点点，显示平坦的面积随时间曲线，或因温度/湿度不稳定而出现焦点漂移。保持稳定的30°C环境，湿度95%，并在每个时间点使用自动对焦，通常能恢复清晰的轨迹，以便比较突变体或处理方法。

成熟生物膜中的代表性Z堆叠显示出泡沫状多层结构，厚度通常超过50微米，大多数细胞染色为活体（SYTO 9阳性），偶尔有中央空洞，表明生长过程中集体重排（图3D）。基质探针可用于研究基质成分：WGA突出多糖表位，BOBO-3标记丰富的细胞外DNA，蛋白质选择性染色对细胞外部信号贡献甚少（图3E）。次优结果包括以碘化丙苣为主的薄或不连续堆栈、强烈的光漂白或增益设置不一致，这些都削弱了数量上的可比性。结合解释厚度、生物体积和活死比（同时保持激光功率、探测器增益和针孔在不同条件下保持恒定）可以确认成熟状态，并支持与SEM超微结构和CV生物质的直接比较。

钩端螺旋体的生物膜形成过程通常遵循不同阶段，但具体时间和数值可能因物种或菌株而异。以L. interrogans菌株Manilae L495为参考，预计21天的进展包括一个初始阶段（第0-3天），细菌主要保持浮游状态，生物膜极少（图4A）。随后进入指数增长阶段（第3-7天），浮游细菌和生物膜相关细菌数量增加，达到约9 x 10⁸细胞/mL，伴随着生物膜聚集体的形成和扩展。在第7天到第12天之间，浮游细菌显著减少，而生物膜相关细胞达到峰值，约占总数的80%。最后，在成熟期（第12-21天），生物膜细菌数量减少，但浮游细胞数量并未增加，但生物膜的大小和复杂度仍持续增长。观察这一变化序列表明该方案有效捕捉了钩端螺旋体生物膜的动态发育和成熟过程。

在正确执行时，感染方案使用含有~2 x 10⁸细粒粒的接种剂，剂量为200 μL EMJH，由明确定义的浮游（5天）或生物膜（21天）培养物制备。尽管这两种培养类型代表不同的生理状态，但这种差异是有意为之，实验旨在确定瘦端螺旋体生物膜——以代谢活动减少和结构分化为特征——是否仍保有发起感染的能力。这一对比得到了转录组研究的支持，显示浮游生物与生物膜Leptospira^35,36之间基因表达发生了重大变化。生物膜聚集体经过仔细采集，以保持结构并保持完整，经过21克针后，这在注射前已确认（图4C，D）。腹腔注射后，金叙利亚仓鼠通常在3到5天内表现出钩端螺旋体病的临床症状（如嗜睡、毛发凌乱、俯卧）。仅注射EMJH培养基的阴性对照组无病变迹象。临床症状的进展和严重程度以及安乐死时间因接种而异：浮游细菌通常会引发更早且更急性的症状，而生物膜来源的聚集体则可能引起延迟但持续的感染（图4B）。每天监测两次，最长可达21天，可以全面掌握疾病病程。

图2。《结晶紫染色、定量及细粒螺旋体生物膜的超微成像》。（A） 对不同基底生长的生物膜进行晶紫（CV）染色。CV染色可以可视化不同物种和基底的生物膜结构和初始附着模式。i. 聚碳酸酯过滤器上的L. interrogans;ii. 聚碳酸酯滤器上的双刃L.iii. 玻璃盖片上的L. interrogans;iv. L. biflexa，玻璃盖片上。（B）通过CV吸收率（OD570 nm）评估L. interrogans和L. biflexa的定量生物膜形成示例。该动力学读数捕捉了早期粘附和生物质积累动态，突出病原体与腐生物种之间生物膜生长的差异。这个数字已从²⁷人调整。（C-E） L. interrogans生物膜的扫描电子显微镜（SEM）：（c） 3天前的生物膜，显示早期微群落形成及细胞外基质初期沉积;（d） 14天前的生物膜，展现成熟结构，具有广泛的基质结构和三维组织;（E-F）3周前的生物膜，展示结构巩固和基质成熟过程。这种结合CV染色、定量OD测量和SEM成像的技术，全面概述了从早期附着到成熟超微结构组织的生物膜发育，从而实现跨物种和培养持续时间的直接比较。请点击此处查看该图的放大版本。

图3。 钩端螺旋体 生物膜形成的可视化。用BioStation拍摄的相位对比图像显示生物膜在（A）48小时、（B）96小时和（C）144小时形成。（D）CLSM重建钩 端螺旋体 生物膜，显示总生物体积，并以正交切片进行三维可视化。（E） 用DAPI（绿色）和WGA（红色）对成熟生物膜进行共焦染色，突出细菌细胞和细胞外基质成分。这个数字是从³⁷个调整过来的。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4。浮游生物和生物膜分数的时间分辨定量及 钩端螺旋体 生物膜的功能评估。（A） 通过405纳米吸收测量生物膜形成动力学。对每个时间点，均取总孔、生物膜分数和含浮游轻质螺旋体的上清液读数，从而区分附着细菌和游走细菌。（B）注射生物膜聚集体、浮游细螺旋体或EMJH对照的仓鼠存活曲线示例。注射生物膜的动物毒性较低，有些存活21天，而浮游细端体则导致快速死亡。（C-D）生物膜完整性的初步验证：注射前（C）内可见聚集体，经过21克针头（D，白色箭头）后保持完整，确认生物膜结构在处理过程中得以保存。这个数字是从³⁶个调整过来的。 请点击此处查看该图的放大版本。

Discussion

该方案提供了模块化和整合的工作流程，用于研究钩端螺旋体生物膜，整合定量生物质（晶体紫）^9,27、动力学（延时相位对比）、三维组成（带靶探针的共聚焦激光扫描显微^镜）、超微结构（扫描电子显微镜）和功能评估（仓鼠感染）。通过在不同模块中使用相同的培养序列，批量效应最小化，并实现实验内交叉验证，这对生长缓慢、脆弱的螺旋体尤为重要。每个模块相互补充：CV量化“含量”，延时显示“速度”，CLSM揭示“内部内容”，SEM解析“构建方式”，体内测试提供“功能验证”。引入双屈曲杆菌展示了跨物种的适应性，强调了生物膜形成更快更密集，并强调方法学的灵活性³⁵。

每个模块的成功取决于接种物质量和生理状态。中段浮游培养（3-5天），高度运动且无聚集体，可重复地产生粘附和生物膜形成。仅应使用低传代分离株，以确保生物膜的稳健形成和可重复性。

CV测定通过其速度、可扩展性和吞吐量来锚定工作流程，^9,27。它能够快速筛查突变体、培养基或抗生物膜化合物。然而，由于钩端螺旋体生物膜脆弱且异质性强，温和的作和复制验证至关重要。CV无法区分紧致结构与多孔结构，也无法检测基质成分——因此它作为更深入结构分析的筛选门槛。

延时成像通过实时揭示生物膜动力学，弥合了这一空白。它捕捉了运动聚体的出现、聚合和固定过程，揭示了终点测定所忽略的瞬时现象。环境稳定性（温度、湿度、自动对焦）至关重要。这些记录表明，即使CV生物量看似稳定，动态仍可能出现分歧——这表明深层发生结构重排或生存能力丧失。

CLSM提供了体积和化学洞察，且无脱水伪影³⁹。活/死染色揭示了生物膜内细胞的存活梯度，这与氧气扩散有限和代谢分层的报告相符 ^6,40。凝集素和核酸染料暴露出丰富的细胞外DNA和特定糖链基序，从而实现基质成分的定量和表征^41,42。CLSM数据经常揭示内部空洞，呼应了延时³⁸中出现的集体重排。不过，局限性包括探针特异性、光漂白和绕射极限轴向分辨率;因此，显微镜设置和染料性能应事先标准化和测试，以确保各实验结果可靠且可比。

SEM提供互补的超微结构分辨率⁴³。早期阶段，它能分离新生聚集体;成熟时（≈15-21天），显示极化结构：基底层粗糙且通道状，用于锚定和交换，表面则为光滑的顶端基质丰富³⁷。仔细固定、HMDS干燥以及与共聚焦数据的关联可减少因脱水或塌陷引起的伪^影。

这四个模块共同实现了内部交叉验证：当CV、CLSM和SEM汇聚时，结论稳健;当它们出现分歧时，差异本身具有信息价值——例如，生物量增加但生存能力下降，或生物量未变但基质成分改变。

但仍存在若干内在的限制。 钩端螺旋体 生物膜异质且脆弱，容易被触碰和脱水。计算机分析整合总生物量但不整合生存能力¹⁶;CLSM不能超过^{光学限制38};SEM存在制备伪影的风险。由于氧梯度⁶，较深地层的死亡率是预期的，但这种偏差是系统性的，且在不同条件下是可比的。生物膜成熟期约在15-21天达到平台期，伴随营养限制的转录特征³⁶。后期阶段的特征仍然不明确。

体内 检测提供了功能性背景。注射腹膜内聚集体测试生物膜来源细胞在毒力或持久性上是否与浮游生物对应细胞不同。虽然腹腔内接种并非自然途径，但它提供了受控的比较模式³⁶。总异质性会带来一定的差异，但通过一致的处理和匹配的接种量可以缓解这一问题。重要的是，生物膜的持久性状（如ECM介导的应激耐受性）不一定转化为急性毒力增强，这凸显了生物膜形成的生态作用而非致病作用²⁴。

模块化设计实现了可扩展的使用。快速筛查时，简历和延时摄影就足够了。为了获得机械洞察，CLSM和SEM增加了成分和结构分辨率。模块可以集成酶促或化学扰动（DNase、糖苷酶）、糖链或核酸的替代探针，或微流控系统以测试流动响应。同一接种物可以进行转录组或蛋白质组分析，直接将生物膜表型与调控（例如c-di-GMP信号、饥饿反应）联系起来。该框架还包括突变体筛选、环境扰动测试以及抗生物膜或抗毒力化合物评估。

这一集成工作流程将孤立的观测数据转化为对 钩端螺旋体 生物膜的连贯多维理解。通过结合通量（CV）、动力学（延时）、化学与深度（CLSM）以及超微结构（SEM），该方法准确捕捉 了细螺旋体 群落的流动性、多孔性和极化特性。延续早期研究^17、35、36，它证明了协调的模块化实验揭示了单一方法研究看不到的现象——例如尽管生存能力下降，生物量却上升，或物种间动力学的分歧。最终，这种方法支持跨物种、突变体和疾病进行比较、可重复且功能相关的分析，为机制微生物学、生态韧性和抗生物膜策略设计奠定基础。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 和微型;M无菌亲水聚碳酸酯膜	it4ip	1000M25/861N101/13
12毫米无菌玻璃罩套	超级联赛	330164
16% 对甲醛（PFA）	热力科学	28908
21G针	BD医疗	304432
24孔微板	全国统一教会	143982
35毫米玻璃底盘	伊比迪	81218-200
35毫米玻璃底Hi-Q4天线	伊比迪	81156
96孔微板	NEST	701001
防褪入装载介质及nbsp;	生物辐射	29410
碳涂层机	徕卡微系统	Em ACE600
CFDA/SE示踪器	生物传说	423801
导电碳素胶	电子显微镜科学	77816
水晶紫罗兰（CV）	西格玛	C3886
暗场显微镜	徕卡微系统	11888846	徕卡DM4000 B，配备深色菲尔聚光器（cat n°11505142）
乙醇	VWR化学	83813.36
FM4-64	Invitrogen	T3166
冰川醋酸	苏佩尔科	1.00063
戊二醛溶液	西格玛-奥尔德里奇	G5882
六甲基二硅烷	阿克罗斯有机	120581000
孵化器	梅默特	IN30
倒置共軛焦显微镜	徕卡微系统	徕卡DMI6000 TCS SP8 X	共焦显微镜SP8
配备相位对比光学的倒置显微镜	尼康	细胞-S2	生物站 IM-Q
钩端螺旋体中基 EMJH	贝克顿·迪金森	BD 279410	EMJH培养基用于钩端螺旋体
四氧化锇（OsO4）与nbsp;	西格玛	BCCG9181
碘化丙蓌	生物体	40017
扫描电子显微镜	JEOL	JSM-IT300
钠砷酸钠缓冲液	热力科学化学	15453149
分光光度计 Varioskan Lux	热力科学	VLBL00GD0
无菌磷缓冲生理盐水	生物溶解	0016232301BS
注射器（1毫升）	奇拉纳	CH03002L
SYTO9绿色荧光核酸染色	Invitrogen	S34854