本方案提供了一种模块化的生物安全二级（BSL-2）工作流程，结合结晶紫生物量测定、延时相差动力学分析、共聚焦三维/基质成像、扫描电镜超微结构观察以及一种 体内 仓鼠感染模型用于培养、定量、表征及研究 钩端螺旋体 生物膜功能作用，支持在不同实验室间对突变体和抗生物膜干预措施进行标准化评估。
本文内容
摘要
摘要
在此，我们介绍一套整合的实验方案，用于培养、定量监测、结构与功能表征 钩端螺旋体 随时间推移对 spp. 生物膜进行分析。该工作流程结合了结晶紫微量滴定板法，用于在多个时间点定量生物膜生物量；采用时间分辨的分步分离方法，区分附着态（生物膜）与非附着态（液相）的细菌群体；结合延时相差显微成像，实现无损的动力学观察；利用共聚焦激光扫描显微镜生成完整的三维重建图像，并结合基质探针信号读出；以及采用膜支撑的扫描电子显微镜进行超微结构分析。同时，我们详细描述了一种标准化操作流程，用于收集完整的生物膜聚集体，并将其制备后经腹腔注射至易感的金黄地鼠模型，从而实现对生物膜相关毒力的直接评估。 体内 以及配对的浮游生物对照组。
该方案针对致病性菌株Leptospira interrogans Manilae L495 进行优化，各模块可便捷地应用于其他Leptospira物种及突变体文库，以比较其生物膜形成能力。上述协调统一的模块共同为筛选抗生物膜策略、探究遗传决定因素以及阐明生物膜在Leptospira持久定植与致病过程中的作用提供了坚实的基础。
引言
生物膜是由微生物形成的结构化群落，其中细胞被自身分泌的胞外聚合物基质（EPS）所包埋，该基质由多糖、蛋白质、核酸和脂类组成1。该基质提供机械稳定性，介导细胞对表面的黏附，并通过增强微生物对干燥、氧化应激和抗菌剂等环境压力的耐受性，提高其存活能力2,3。在致病菌中，生物膜有助于细菌长期存留、逃避免疫识别并导致慢性感染4,5。
与自由漂浮且代谢相对均一的浮游细胞相比，生物膜相关细胞表现出改变的基因表达、生长速率和代谢活性6。这些差异使细胞对环境压力、抗生素和宿主防御具有更强的耐受性，同时支持群体感应、营养保留和空间有序性等协调行为7,8。
生物膜的形成已在Pseudomonas aeruginosa、Staphylococcus aureus和Vibrio cholerae等模式生物中得到广泛表征，这些研究共同塑造了我们对生物膜生活方式在遗传、结构和生理基础方面的理解。Pseudomonas的相关研究表明，胞外多糖和群体感应共同作用，塑造复杂的三维生物膜结构9,10。对Staphylococcus的研究则强调了表面蛋白和胞外DNA在增强生物膜凝聚力和抗生素耐受性方面的重要作用11,12。对Vibrio属物种的研究进一步揭示了生物膜形态的显著多样性及其在水生环境中的生态意义¹³。总体而言，这些系统为生物膜研究提供了坚实的理论和方法框架，这一框架由标准化实验方案14以及对现有技术的批判性评估所强化15,16，共同凸显了在研究Leptospira等研究较少的细菌的生物膜形成时，采用统一方法的必要性。
螺旋体属成员 钩端螺旋体，钩端螺旋体病的致病因子，长期以来被认为主要以浮游状态存在。近期研究通过实验已证实多种钩端螺旋体均能形成稳定的生物膜17尽管一些研究表明环境中的生物膜形成18 以及宿主相关联的19 环境中，其他研究已通过实验验证了钩端螺旋体在肾小管中形成生物膜的能力 Rattus norvegicus20 马的玻璃体液21以及检测环境生物膜中的钩端螺旋体属物种22,23. 解析调控这些条件与机制的因素 钩端螺旋体 因此，生物膜对于理解环境传播、储存库持续存在以及疾病发病机制至关重要24,25.
现有的Leptospira生物膜检测方法较为零散，从定性的显微镜观察17,26到终点比色法或结晶紫染色27,28均有涉及。尽管这些研究为生物膜的形成提供了宝贵的见解，但往往缺乏实时监测生物膜成熟与分散过程所需的动力学分辨率，也缺少共聚焦显微镜或电子显微镜所提供的超微结构背景信息。持续监测和三维结构分析被认为是全面揭示生物膜形成与分散动态特性的关键14,15。这些局限性阻碍了不同研究之间的可比性，也限制了对影响生物膜形成与分散的因素或干预措施进行系统性评估，凸显出建立一种标准化、多读数输出的工作流程的必要性，以可重复且全面的方式捕捉Leptospira生物膜的结构与功能动态。
为了解决这些不足，我们开发了一种集成化、模块化的实验流程，可从同一系列培养物中整合六种互补的检测读数。首先，采用高通量结晶紫（CV）微量滴定板法，在多个时间点定量测定附着生物量。其次，在96孔板中进行时间分辨的分步分离检测，通过OD₄₀₅对总菌体、液相（未附着或部分脱落）以及附着（生物膜）群体进行分馏，以追踪其在生物膜形成与分散过程中的动态变化。术语 液相 用于涵盖浮游样和脱离的细胞，承认自由生活表型与表面相关表型之间存在的动态连续性29,30第三，延时相差成像可非侵入性地记录细胞黏附、聚集体运动及融合过程的动力学变化。第四，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）可获得完整的三维重建图像，并结合活/死细胞及基质探针信号，实现基于深度的存活率分析和基质分布图谱。第五，基于膜或盖玻片支撑的扫描电子显微镜（SEM）能够以高分辨率解析细胞外结构以及基底-顶端极性。此外，一个 体内 采用腹腔注射生物膜聚集体至易感的金黄叙利亚仓鼠模型中，以评估毒力，该模型是钩端螺旋体病研究中一种敏感且成熟的动物模型31,32,33将生物膜表型与致病潜力相关联，提供补充功能背景 体外 分析。
与单一模态方法相比，该平台具有多项优势：（i）可同步获取定量数据（循环伏安法和分步光密度）和结构信息（共聚焦激光扫描显微镜/扫描电子显微镜）；（ii）非破坏性地动态监测早期黏附、生长、成熟及分散过程；（iii）利用靶向探针进行三维活性和基质特性表征；（iv）对胞外基质结构进行超微结构成像；（v）在易感仓鼠模型中直接评估生物膜相关性与浮游状态下的毒力功能，上述各项均可在标准BSL-2设施条件下实现。通过采用多孔板格式以及可拆卸的玻璃或聚碳酸酯基底，该工作流程支持对环境变量、抗菌化合物或突变文库进行重复筛选，同时保持无菌性、高通量以及各模块间的交叉验证。
专注于生态学、持留性、宿主-病原体相互作用或抗生物膜发现的研究实验室可采用其中的单个模块或完整流程。所需资源仅限于酶标仪、配备环境控制功能以进行延时成像的倒置显微镜、共聚焦显微镜和扫描电镜（SEM）设施，以及适用于仓鼠模型的标准动物实验设施，从而实现广泛的适用性及在不同研究间的可重复比较。
方案
伦理声明：
本研究已获得新喀里多尼亚巴斯德研究所动物护理与使用委员会的批准，并依据巴黎巴斯德研究所动物护理与使用委员会的指南以及欧洲推荐标准2007/526/EC进行。动物研究实验注册编号：IPNC-2018-ARE-001
注意：所有涉及活体钩端螺旋体（Leptospira）培养物的操作必须在生物安全二级（BSL-2）实验室中进行，并遵守机构的生物安全指南。所有培养操作均须在生物安全柜内执行，以确保操作人员安全并防止环境污染。
的 问号钩端螺旋体 本研究使用的曼氏血清型L495株最初取自法国巴黎巴斯德研究所菌种保藏中心，现保存于新喀里多尼亚巴斯德研究所。为保持其毒力，该菌株定期从感染的仓鼠体内重新分离获得。所有实验 体外 实验中，自动物宿主复苏后，培养物的传代次数未超过六代。
所有动物实验操作必须遵守机构指南，并经相应的动物护理与使用委员会批准。实验应遵循欧盟关于动物福利的法规（欧盟指令2010/63）以及公共卫生服务部门的建议，确保动物的使用具有科学合理性并受到伦理规范的监管。
1. 细菌接种物的制备
- 培养 钩端螺旋体属 30 °C 下 EMJH 培养基中的细胞34 在有氧条件下，于平底带螺帽玻璃管中静置培养，直至菌液达到对数中期。在这些条件下， L. interrogans 血清型 Manilae 菌株 L495，一种常规保藏的低传代菌株 在体 通过仓鼠传代，通常在3-5天内达到适当的细胞密度。确保培养物在405 nm处的光密度（O.D.）达到0.2–0.4（相当于2至5 × 10⁶ 个细胞/mL）。8 细胞/mL）后，在新鲜EMJH培养基中稀释，并在20倍放大下通过暗视野显微镜检查运动性和无聚集现象。
注意：EMJH 培养基具有固有吸光度。使用无菌 EMJH 培养基作为空白对照校准分光光度计，并从所有读数中扣除该值。接种物可通过测量光密度或使用 Petroff-Hausser 计数板进行直接细胞计数来标准化。通常，经验证的对数中期培养物以 1:100 稀释后可得到 OD405 = 0.02（≈ 1 × 106 细胞/mL）。轻轻倒置混匀；切勿涡旋。 - 在20倍暗视野显微镜下检查10 µL样品，确保≥90%的细胞具有高度运动性，且无可见的细胞团块。将经验证的对数中期培养物用新鲜EMJH培养基按1:100比例稀释，以获得OD405 = 0.02（≈ 1 × 106 细胞/mL）。轻轻颠倒混匀；切勿涡旋。
注意：一个工作浓度的接种物可支持本方案中详述的所有后续检测图1）。准备36 mL用于接种24孔板（1 mL/孔）或20 mL用于接种96孔板（200 µL/孔）。根据所需板数调整体积。
图1全球工作流程 钩端螺旋体 生物膜分析 指数生长 钩端螺旋体 首先通过光密度对培养物的生长情况进行评估并进行标准化。随后将培养物分配至含玻璃片或膜的培养板、显微镜用微型培养皿或96孔板中。该实验流程包含七个模块：（1）接种物制备；（2）结晶紫染色用于生物量定量；（3）通过扫描电镜进行超微结构成像；（4）通过延时相差显微镜进行生物膜动态监测；（5）结合活/死染色利用共聚焦激光扫描显微镜进行三维可视化；（6）在生物膜形成过程中对附着与非附着组分进行时间分辨定量 通过 光密度；（7）在叙利亚仓鼠感染过程中研究生物膜的功能作用。这种整合方法可对生物膜的形成、结构及致病性进行多模式分析。 请点击此处以查看此图的放大版本。
2. 基于结晶紫的盖玻片或膜上生物膜定量分析
- 在BSL2生物安全柜内，使用无菌镊子将一片12 mm无菌玻璃盖玻片或一片0.1 µm无菌亲水性聚碳酸酯膜平整地放置于带盖无菌24孔板每个孔的底部。用1 mL无菌EMJH溶液在30 °C下预浸泡膜或玻璃盖玻片2小时。
注意：尽管非必需，但在EMJH中预浸泡基质可改善润湿性，并略微增强细菌黏附。 - 移除浸泡液，并向每孔中加入1.5 mL稀释后的细菌悬液（OD405 = 0.02 ≈ 1 × 106 个细胞/mL）。确保盖玻片或膜牢固地位于孔底。
- 将培养板置于30 °C、湿润环境中静置培养，通过在培养箱内放置盛水托盘以防止培养基蒸发。对于生长缓慢的菌株，建议培养3周，以形成成熟且牢固的生物膜。
- 在预定时间点，小心尽可能多地移除每孔中的培养基，避免扰动生物膜。用1 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻冲洗每孔，以去除未黏附的残余细胞，同时保持盖玻片紧贴孔底，防止脆弱的生物膜细胞脱落。在此条件下，生物膜主要生长在盖玻片的上表面，下表面生长极少，因此无需抬起盖玻片进行冲洗即可有效富集表面黏附细胞，用于后续分析。
注意：此时生物膜极为脆弱，容易被误吸。移液操作应沿孔壁缓慢而精确地进行，避免破坏生物膜。 - 向每孔中加入1 mL 4%多聚甲醛（PFA）PBS溶液，在37 °C固定30分钟。移除固定液后，用1 mL PBS小心冲洗两次。
注意：固定所用的4%甲醛溶液为现配（将16%无甲醇甲醛原液按1:4比例用PBS稀释），使用后即弃去，因为其聚合为多聚甲醛后会降低交联活性。 - 向每孔中加入1 mL 0.1%（w/v）结晶紫（CV）溶液，在室温下孵育15分钟，确保膜或盖玻片完全被覆盖。
- 弃去染液，并用1 mL PBS冲洗两次。
注意：结晶紫和多聚甲醛（PFA）具有毒性，可能刺激皮肤和眼睛。操作时务必佩戴手套，并谨慎处理这两种化学品，最好在通风橱中进行。废液应根据机构安全指南，丢弃至指定的有害染料或化学废弃物容器中。 - 倾斜培养板以排尽残留液体，在室温下空气干燥孔内样品，直至基质完全干燥（≥ 4小时，建议过夜）。
注意：此时可在盖玻片或膜表面观察到点状或网状结构（图2A）。 - 向每孔中加入500 µL洗脱缓冲液（50%乙醇，50%冰醋酸（体积比）），孵育15分钟。反复吹打以充分溶解与生物膜结合的结晶紫。
- 将每份样品200 µL转移至光学透明的96孔微孔板中，在570 nm处测定吸光度。通过处理未接种的盖玻片或膜（经历固定、CV染色、洗涤和洗脱步骤）制备仅含基质的空白对照，用以扣除本底结合信号。记录至少三个技术重复的平均值±标准差。若吸光度超出分光光度计的线性范围，应用洗脱缓冲液稀释样品。
3. 使用扫描电子显微镜（SEM）进行生物膜可视化
- 在BSL2生物安全柜内，使用无菌镊子将一片12 mm无菌玻璃盖玻片或一片0.1 µm无菌亲水性聚碳酸酯膜平整地放置于带盖无菌24孔板每个孔的底部。用1 mL无菌EMJH培养基于30 °C预浸泡膜或玻璃盖玻片2小时。
- 移除浸泡液，向每孔中加入1.5 mL稀释后的细菌悬液（OD405 = 0.02 ≈ 1 × 106 个细胞/mL）。确保盖玻片或膜牢固贴附于孔底。
- 将培养板置于30 °C恒温高湿培养箱中静置培养，以防止培养基蒸发。对于生长缓慢的菌株，建议培养3周，以形成成熟且牢固附着的生物膜。
- 在预定时间点，小心吸除每孔中尽可能多的培养基，避免扰动生物膜。
- 随后用1 mL无菌PBS轻柔冲洗每孔，以去除未附着的残留细胞，同时保持盖玻片紧贴孔底，防止脆弱的生物膜细胞脱落。在此条件下，生物膜主要生长于盖玻片的上表面，下表面生长极少，因此无需抬起盖玻片进行冲洗即可有效富集表面附着细胞，用于后续分析。
注意：此时生物膜极为脆弱，容易被误吸。移液操作应沿孔壁缓慢而精确地进行，避免破坏生物膜。 - 直接向孔中加入含4%多聚甲醛（PFA）和1%戊二醛的0.2 M二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.4），以固定生物膜。
- 37 °C孵育30分钟，随后移除固定液，并用PBS冲洗盖玻片或膜两次。该方法可在最大程度保留表面附着生物膜的同时减少其脱落，因为在本实验条件下，生物膜主要形成于盖玻片的上表面。
注意：固定液需新鲜配制（将16%无甲醇甲醛原液用二甲胂酸钠缓冲液1:4稀释），使用后即弃去，因甲醛聚合为多聚甲醛会降低交联活性。 - 将样品基质浸入含1%四氧化锇（OsO₄）的PBS溶液中1小时，以增强扫描电镜（SEM）对比度。随后用PBS冲洗两次。
- 依次将样品浸入浓度递增的梯度乙醇溶液（25%、50%、70%、90%和100% v/v）中进行脱水，每步10分钟。
- 加入500 µL六甲基二硅氮烷（HMDS），孵育5分钟，随后更换新鲜HMDS再孵育5分钟。吸除多余HMDS，并将样品置于通风橱中彻底空气干燥。
注意：戊二醛、多聚甲醛、二甲胂酸钠、四氧化锇和六甲基二硅氮烷均具有毒性，必须在化学通风橱中佩戴适当的个人防护装备进行操作。 - 使用双面导电碳胶带将干燥后的样品固定于SEM样品台。对样品进行溅射镀膜，覆盖一层约10 nm的金或铂，以提供足够的电子反差用于SEM成像。该方法可实现对生物膜结构的高分辨率观察，包括细胞间连接、胞外基质形态、密度及异质性，无需额外染料或染色。
- 使用合适的样品台将样品台装入扫描电镜。如条件允许，建议对样品室抽真空过夜以提高成像质量，随后在5–15 kV电压及适当放大倍数下采集二次电子图像，以揭示生物膜的超微结构（图2）。
4. 生物膜生长的延时相差成像
- 用移液器将 500 µL 工作菌液（OD405 = 0.02 ≈ 1 × 106 个细胞/mL；见第 1 节）加入无菌的 35 mm 玻璃底 Hi-Q4 培养皿中，该培养皿配有平面平行盖，以消除弯月面畸变。避免引入气泡，并立即盖上培养皿。
注意：35 mm 玻璃底 Hi-Q4 培养皿包含 4 个独立的培养区域，可用于同时成像 4 种不同条件。将其中一个区域分配给无菌 EMJH 培养基作为阴性对照，其余三个区域用于技术重复或不同菌株/突变体。 - 将培养皿置于倒置显微镜的环境载物台上，显微镜需配备相差光学系统、电动聚焦驱动装置（Biostation IMQ）以及设定为 30 °C 和 95% 相对湿度的加湿腔。这些条件有助于在长时间成像过程中（最长可达 8 天）最小化蒸发。
- 启动 BioStation IMQ 应用程序，在主界面中打开新建延时成像设置窗口以访问配置面板。在开始实验前，检查状态显示中的环境参数，确保“腔室”和“水温”指示器均显示为“稳定”，以防止采集过程中出现图像漂移。
- 在“新建延时成像设置”界面中，选择实时选项卡，并在观察条件面板中配置成像参数：选择相差（Ph）作为滤光片，并将放大倍数设置为20 X。
- 在手动模式下，调整光照强度和曝光时间，以优化对比度并避免饱和。使用饱和度检查按钮验证设置。定义四个采集点，分别对应四个区域的中心位置。
- 使用微调旋钮或直接在实时观察图像显示区域内点击，依次将载物台移动至每个区域上方。
- 使用聚焦按钮精细调节焦距，并通过点击延时实验点注册按钮记录每个位置。注册的点将以编号的蓝色框形式显示在“观察点验证显示”区域，并在“点”选项卡中确认。
- 通过打开时间选项卡并点击新建，进入延时对话框，设置采集周期为30 分钟，总时间为7 天，以编程采集时间表。
- 点击“应用”后，软件将自动计算采集轮数。通过右键点击标题栏，选择偏好设置，并启用AF 模式以激活自动对焦功能，确保在每个载物台位置重新对焦。验证所有采集点的曝光设置、增益和光照强度的一致性，然后使用保存按钮保存整个配置。
- 点击开始延时成像以启动采集。软件将自动切换至延时图像界面，允许在整个 7 天实验期间持续监控采集进度和腔室稳定性。所有图像将自动以 TIFF 格式保存在软件创建的实验文件夹中。
- 通过将图像序列导入 FIJI 对图像系列进行处理和定量分析（图 3A, B, C）。
- 通过文件 > 导入 > 图像序列打开对应每个位置的图像堆栈，确保帧按时间顺序加载。
- 使用图像 > 类型 > 8 位将对齐后的图像堆栈转换为 8 位灰度图像，以标准化像素强度。
- 使用图像 > 调整 > 阈值进行阈值分割，以分离细菌生物膜区域。通过选择应用在所有帧中使用一致的阈值设置，然后使用处理 > 二值化 > 转为二值图像将结果保存为二值掩膜。
- 使用分析 > 分析颗粒进行定量分析，记录面积、面积百分比和平均强度等参数。
- 通过结果窗口（文件 > 另存为 > .csv）将每帧的结果自动导出至电子表格，用于动力学分析。所有测量值均以生物膜覆盖的视野面积比例（表面覆盖率）表示。
5. 使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进行生物膜可视化
- 接种1.5 mL的工作菌液（OD405 = 0.02 ≈ 1 × 106 细胞/毫升；参见 第1节将样品加入无菌的35 mm玻璃底培养皿中。置于含有水槽的湿盒内，在30 °C培养箱中静置培养，直至达到所需发育阶段（最长21天）。
- 在选定的时间点，沿培养皿壁小心缓慢地吸出培养基，避免扰动生物膜。用 2 mL 无菌 PBS 轻柔冲洗一次，以去除浮游细胞，操作时需格外小心，避免使生物膜脱落或受到破坏。
- 制备需要与未固定（活体）生物膜孵育的染色溶液（在固定前进行）。
- 活/死染色时，将3 µL SYTO9绿色荧光核酸染料（1.67 mM）和3 µL碘化丙啶（18.3 mM）加入10 mL PBS中，配制染色液。取200 µL染色液直接加入形成生物膜的细菌样品中，室温避光孵育30分钟，然后用PBS冲洗一次。
- 活细胞示踪剂也可用于固定前的细胞染色。将活细胞与10 µM CFDA/SE示踪剂孵育30分钟。 alternatively，也可使用5 µg/mL浓度的FM4-64对细胞膜进行标记。用PBS洗涤一次。
- 用2 mL含4%多聚甲醛的PBS溶液固定生物膜，在37 °C孵育30 min。移除固定液，用PBS冲洗两次。
- 加入一滴抗荧光淬灭封片剂以覆盖生物膜，并避免产生气泡。
- 在配备可调谐白光激光器（WLL）和HC PL APO CS2 63×/1.4 NA油浸物镜的倒置共聚焦显微镜上采集Z轴层扫图像。对于CFDA/SE，激发波长设为488 nm，收集500–550 nm的发射光，针孔大小为1艾里单位（AU）；对于FM4-64，激发波长设为561 nm，检测630–700 nm的发射光，针孔大小同样设为1 AU。
- 以 0.5–1.0 µm 的间隔在整个生物膜厚度范围内采集 Z 轴层扫图像。调整激光功率和探测器增益，以在避免信号饱和的前提下最大化动态范围。<1% 饱和像素。
- 使用线平均（2-4次）以提高信噪比，并在所有样品中保持成像参数（激光功率、检测器带宽、针孔大小、扫描速度）恒定。
- 将图像序列保存为12位文件，并以.lif格式导出，用于FIJI（ImageJ）中的定量分析。
注意：成像前，需使用相同染料标记的对照样品对显微镜设置（如激光功率、探测器增益、针孔大小）进行标准化校准。该校准步骤对于减少不同采集之间的变异性和实现跨实验的可靠比较至关重要。 - 使用配备 COMSTAT 插件（或同等 3D 分析软件）的 FIJI 对共聚焦图像序列进行处理与定量分析10测量生物体积、平均厚度和最大厚度、表面覆盖率以及活/死细胞比率（或其他预定义指标）。导出具有代表性的正交视图和最大强度投影图像用于图示说明图3D，E).
6. 在96孔微量滴定板实验中生物膜形成过程中附着与非附着组分的时间分辨定量分析
- 取200 µL工作接种液（OD405 = 0.02 ≈ 1 × 106 个细胞/mL；见第1节），接种至96孔板的各孔中。于30 °C静置培养至预定时间点（第3、5、7、10、12、14、17或21天）。
注意：使用96孔板时，边缘效应和蒸发现象较为常见，尤其是在培养箱缺乏湿度控制的情况下。为尽量减少这些影响，需向所有边缘孔中加入200 µL无菌蒸馏水。此外，将96孔板置于带有水槽的湿化盒内，再将湿化盒放入培养箱中，以进一步减少蒸发并保持各孔间湿度一致。 - 在每个时间点，准备三种类型的样品：
- 总悬液——通过轻柔地反复吹吸数次，使含生物膜的一个孔中的全部内容物充分混匀，避免产生气泡。该组分代表总细菌群体，包括未贴壁的钩端螺旋体以及半贴附性生物膜中的细菌。此混匀步骤有助于分散可能干扰后续吸光度测定的细胞聚集体。
- 液相组分——从第二个孔中，小心吸取180 µL上清液，避免扰动生物膜层。将上清液转移至一个空孔中，并加入20 µL新鲜EMJH培养基。轻柔吹吸数次以分散细胞聚集体。该组分代表存在于液相中的未贴壁细胞，可能包括自由悬浮的钩端螺旋体以及脱落的生物膜聚集体。
- 生物膜组分——在步骤2.2所用的同一孔中，加入180 µL新鲜EMJH培养基，通过轻柔反复吹吸数次，重悬剩余的生物膜。该组分对应于生物膜内的钩端螺旋体。
- 确保各孔样品充分混匀后，使用分光光度计在405 nm波长下测定每种悬液的吸光度，并绘制数值以生成代表性图表（图4A）。
7. 研究生物膜在宿主感染过程中的功能作用
- 接种200 µL的工作菌液（OD405 = 0.02 ≈ 1 × 106 细胞/mL；参见第1节）加入96孔板的各孔中。在30 °C静置培养，直至达到所需发育阶段（最长21天）。
- 为确定接种物浓度，需专门设置仅用于生长监测而不用于动物注射的“生物膜对照孔”。当生物膜肉眼可见时，轻轻从一个对照孔中移除180 µL上清液，避免扰动生物膜。随后加入180 µL新鲜EMJH培养基，小心重悬生物膜聚集体，避免产生气泡，并测定OD值405 以估算细菌浓度。
注意：原则上，在定量前洗涤孔板有助于去除未贴壁的细胞。然而，由于 钩端螺旋体 生物膜在96孔板中黏附较弱，洗涤会导致生物膜材料不可控地丢失。因此，为确保各孔之间具有可重复性及细菌浓度的一致性，重悬步骤未在洗涤前进行。
生物膜对照孔通常含有约 2 x 108 钩端螺旋体，被选作仓鼠感染实验的标准接种物。该浓度也定义了用作对照的浮游状态钩端螺旋体的目标数量。当设置浮游对照时，通过新鲜传代培养制备 钩端螺旋体 在30 °C、振荡条件下于EMJH培养基中培养至多5天，对应于中指数至晚指数生长期，以获得相似的细胞密度。 - 进行动物接种时，使用独立的生物膜孔（非对照孔）。小心移除孔中180 µL上清液，以去除大部分液相钩端螺旋体。
- 使用200 µL枪头吸取剩余的20 µL含生物膜聚集体的液体，以避免破坏其结构。
注意：生物膜较为脆弱。收集前后需确保可见聚集体存在。建议准备额外的孔位，以防需要重复实验。 - 将聚集体转移至预装有300 µL新鲜EMJH培养基的注射器中。静置，使聚集体依靠重力自然沉降。
- 连接21 G针头，轻轻挤出多余的EMJH培养基，直至终体积为200 µL。确保无气泡残留，且生物膜聚集体仍可见。
注意：等待聚集体沉降可最大限度减少体积调节过程中的损失。在此之前 体内 使用时，通过21 G针头后应验证聚集体是否保持完整图4C，D). - 在200 µL EMJH培养基中进行2 x 10⁸个钩端螺旋体的腹腔注射。
注意：使用7-8周龄的金黄叙利亚仓鼠（雌雄均可），在标准饲养条件下饲养。作为阴性对照，每只动物仅注射200 µL EMJH培养基（每个重复使用一只动物）。 - 每天观察动物两次，持续最多21天，监测钩端螺旋体病的临床症状（毛发竖立、衰弱卧倒、对刺激反应减弱）。一旦发现症状，立即实施安乐死 通过 若观察到动物痛苦，则通过吸入二氧化碳实施安乐死，并记录安乐死时间为动物死亡时间。
- 在第21天，处死所有存活的动物。
注意：使用不同日期制备的培养物进行三次独立的生物学重复实验。每次重复包括每种条件下两只动物以及一只阴性对照动物。
结果
当接种物制备正确时，培养物将在3-5天内进入对数中期，OD405值约为0.2-0.4，在暗视野显微镜下可见明亮且高度运动的菌群（≥90%的细胞具有运动性），无可见的菌体聚集体。制备不佳的接种物表现为细菌运动迟缓，视野中运动性不均一；此类培养物通常形成较弱的生物膜，应予以弃用。实际操作中，接种前立即平行检测运动性和OD值，可最大程度减少实验失败。在接种阶段建立这些质量控制标准，是预测后续各项应用成功与否的最重要指标。尽管该方法针对L. interrogans血清型Manilae L495优化，但同样适用于Leptospira biflexa Patoc菌株，以验证其跨物种适用性。L. biflexa通常形成的生物膜较L. interrogans更松散且更薄，但在适当调整参数后，其特征性的发育过程和结构特征仍可被检测到。因此，包含这两种物种可凸显该工作流程对致病性和腐生性Leptospira的广泛适应性。
在30 °C的湿化培养箱中静态培养21天后（或根据所用Leptospira物种的适当时间），生物膜在玻璃盖玻片和亲水性聚碳酸酯膜上均可用肉眼观察到。成功生长的生物膜在2至3周后会形成典型的结晶紫染色特征，如点状、分支状或网状的表面附着痕迹（图2A）。
在典型实验中，野生型 L. interrogans Manilae L495 在第3周时表面覆盖率达到约50%，而低生物膜表型突变株的平台期接近约20%，高生物膜表型则可达约70–80%，从而为筛选建立了实用的动态范围。生物膜形成的程度也可能因钩端螺旋体（Leptospira）的物种和菌株不同而有所差异；例如，L. biflexa Patoc 菌株形成可见生物膜的速度更快，既往研究认为接种后120小时即可形成成熟的生物膜结构35。
结晶紫染色法为定量生物膜生物量提供了一种可靠且可重复的方法。在发育良好的生物膜中，染色后盖玻片或膜区域会呈现深紫色，表明附着的生物量较高（图2A）。染色和溶解过程中的视觉提示也可作为判断实验方案是否成功的有用指标。例如，结晶紫分布不均或染色过浅，可能是由于接种细胞量不足、液体蒸发或洗涤过于剧烈导致早期生物膜脱落所致。
在570 nm处的吸光度读数反映了残留染料的量，因此可代表相对生物膜密度（图2B）。在代表性实验中，钩端螺旋体（L. interrogans）在最佳条件下培养时，各重复样本之间的OD₅₇₀读数一致且可重复，表明生物膜形成稳定。相比之下，若在更换培养基过程中对样品进行过度移液操作，则常观察到重复样本间出现较大差异，提示细胞贴附不良或生物膜部分脱落。此类变异性应被视为技术问题的信号，相关样本应予以剔除，或需仔细复查实验方案。值得注意的是，在相似条件下，短螺旋体（L. biflexa）Patoc菌株在玻璃盖玻片和聚碳酸酯膜上均能形成更广泛的生物膜，这体现在更高的CV吸光度值上，表明该方案适用于不同钩端螺旋体（Leptospira）物种，具有良好的适应性和有效性。
成功的扫描电镜（SEM）制备可在第3天即观察到细胞外基质的沉积，随后在成熟生物膜中呈现出显著的极性结构：粗糙且具有通道的基底面（通常含有> 5 µm的通道）锚定着多孔的内部结构，而较光滑的顶端面则嵌有密集体基质中的螺旋体（图2C, D, E, F）。高倍视野常可捕捉到分支状的细胞外丝状结构及偶见的蘑菇样突起，这些特征与延时成像所见的融合动态相对应（补充视频1）。在次优的制备样本中，可能出现基质塌陷、电荷积累及细胞轮廓模糊等现象，通常反映后固定不充分、导电涂层不足或干燥不良。当基底-顶端极性及广泛存在的通道清晰可见时，SEM的观察结果与共聚焦显微镜对厚度和孔隙率的估算高度一致，表明制备与成像均成功完成。
在有效的时间序列中，孤立的点状结构在24-72小时内出现，并逐渐融合成更大的聚集体，这些聚集体在空间受限之前横扫表面（图3A, B, C）。定量分割结果显示，总覆盖面积单调增加，而聚集体数量先上升、达到峰值后下降，此过程在约12至216小时之间以碰撞和融合为主导。这种动力学特征（面积增加、聚集体数量减少）表明为活跃的聚集过程，而非简单的沉降现象。失败或临界状态的实验缺乏早期点状结构，表现为平坦的面积-时间曲线，或因温度/湿度不稳定导致的焦距漂移。通常，在30 °C、95%湿度的稳定环境中，并在每个时间点使用自动对焦，可恢复清晰的动态轨迹，适用于突变体或不同处理之间的比较。
成熟生物膜的代表性Z轴层叠图像显示泡沫状、多层结构，厚度通常超过50 µm，其中大多数细胞染色呈活细胞（SYTO 9阳性），偶见中心空腔，提示生长过程中发生的集体重排现象（图3D）。可使用基质探针检测基质成分：WGA标记多糖表位，BOBO-3标记丰富的胞外DNA，而蛋白特异性染料在细胞相关信号之外贡献甚微（图3E）。结果不理想的情况包括堆叠过薄或不连续、以碘化丙啶信号为主、严重光漂白或增益设置不一致，这些因素均会削弱定量比较的可靠性。在激光功率、探测器增益和针孔大小保持恒定的条件下，结合分析厚度、生物体积及活/死细胞比例，可确认生物膜成熟状态，并支持与扫描电镜超微结构及结晶紫生物量的直接比较。
生物膜形成过程 钩端螺旋体 通常会经历不同的阶段，但具体时间和数值可能因物种或品系而异。使用 L. interrogans 以参考菌株 Manilae L495 为例，预期在 21 天内的发展过程包括初始阶段（第 0–3 天），此阶段细菌主要呈浮游状态，生物膜形成极少（图4A）。随后进入指数生长期（第3-7天），浮游细菌和生物膜相关细菌数量均增加，达到约9 × 10⁸ 个细胞/mL，并伴随生物膜聚集体的形成与扩展。在第7至12天期间，浮游细菌数量显著下降，而生物膜相关细菌数量达到峰值，约占总菌群的80%。最后，在成熟期（第12-21天），生物膜细菌数量减少，浮游细菌数量未见回升，但生物膜的尺寸和结构复杂性持续增加。观察这一系列变化表明，该方案能够有效捕捉生物膜动态发育与成熟过程 钩端螺旋体 生物膜
当操作正确时，感染程序使用含有约 2 x 10⁸ 条钩端螺旋体的接种物，溶于 200 µL EMJH 培养基中，接种物来源于明确定义的浮游培养物（5 天）或生物膜培养物（21 天）。尽管这两种培养类型代表了不同的生理状态，但这种差异是有意设计的，因为实验旨在确定 钩端螺旋体 生物膜——以代谢活性降低和结构分化为特征——仍保留引发感染的能力。转录组学研究证实了这一差异，显示浮游状态与生物膜状态之间基因表达存在显著变化 钩端螺旋体35,36生物膜聚集体被小心收集，以保持其结构完整，经21 G针头推注后仍保持完整，注射前已确认。图4C，D）。腹腔注射后，金黄叙利亚仓鼠通常在3至5天内表现出钩端螺旋体病的临床症状（如精神萎靡、毛发竖立、卧地不动）。仅注射EMJH培养基的阴性对照组动物未见任何疾病症状。临床症状的发展进程和严重程度以及安乐死时间与接种物有关：浮游细菌通常引起更早且更急性的症状，而生物膜来源的聚集体可能引起延迟但持续的感染（图4B每日监测两次，持续最长21天，可完整捕捉疾病发展全过程。
图2结晶紫染色、定量分析及超微结构成像 钩端螺旋体 生物膜。（A）在不同基质上生长的生物膜经结晶紫（CV）染色。 CV染色可实现对不同物种和底物的生物膜结构及初始附着模式的可视化。 L. interrogans 在聚碳酸酯滤膜上；ii. L. biflexa 在聚碳酸酯滤膜上；iii. L. interrogans 在玻璃盖玻片上；iv. L. biflexa 在玻璃盖玻片上。 （B）通过结晶紫吸光度（OD570 nm）测定生物膜形成的定量示例 随着时间的推移 L. interrogans 和 L. biflexa该动力学读数可同时捕捉早期黏附和生物量积累的动态过程，凸显了致病性与腐生性物种在生物膜生长方面的差异。该图已根据原图修改。27. (C-E) 扫描电子显微镜（SEM）观察 L. interrogans 生物膜 (c) 3天龄生物膜，显示早期微菌落形成及初始胞外基质沉积；(d) 14天龄生物膜，呈现成熟结构特征，具有大量基质及三维空间组织；(e-f) 3周龄生物膜，表明长期培养下结构的进一步巩固及胞外基质的成熟。结晶紫（CV）染色、定量OD测定与扫描电镜（SEM）成像相结合，可全面概述生物膜从初始黏附至成熟超微结构形成的发育过程，从而实现不同物种及不同培养时长之间的直接比较。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图 3。Leptospira 生物膜形成的可视化。 使用 BioStation 获取的相差图像显示了在 (A) 48 小时、(B) 96 小时和 (C) 144 小时时的生物膜发育情况。(D) Leptospira 生物膜的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）三维重建图像，显示总生物体积及正交切片以实现三维可视化。(E) 成熟生物膜经 DAPI（绿色）和 WGA（红色）染色后的共聚焦图像，分别标记细菌细胞和胞外基质成分。本图经修改自37。请点击此处查看此图的放大版本。
图 4．浮游和生物膜组分的时间分辨定量分析及Leptospira生物膜的功能评估。 （A）通过405 nm吸光度测定的生物膜形成动力学。在每个时间点，从整个孔、生物膜组分以及含有浮游钩端螺旋体的上清液中读取数据，从而区分附着细菌与自由游动细菌。（B）注射生物膜聚集体、浮游钩端螺旋体或EMJH对照后仓鼠的典型存活曲线。注射生物膜的动物毒力降低，部分可存活21天，而注射浮游钩端螺旋体则导致快速死亡。（C-D）生物膜完整性的初步验证：注射前可在注射器中观察到聚集体（C），且在通过21 G针头后仍保持完整（D，白色箭头），证实生物膜结构在操作过程中得以保留。本图经修改自36。 请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
本方案介绍了一种模块化且整合性的研究流程，用于研究 钩端螺旋体 生物膜，整合定量生物量（结晶紫）9,27，动态变化（延时相差成像），三维结构组成（使用特异性探针的共聚焦激光扫描显微镜）38，超微结构（扫描电子显微镜）及功能评估（仓鼠感染）。通过在各模块中使用相同的培养体系，可最大限度减少批次效应，并实现实验内的交叉验证，这对于生长缓慢且脆弱的螺旋体尤为重要。各模块相互补充：CV定量 "多少" 延时显示 "多快，" CLSM 显示 "内部包含什么，" SEM可解析 "其构建方式" 以及 在体内 检测提供 "功能验证" 纳入 L. biflexa 展示了在不同物种间的适应性，凸显了更快更密集的生物膜形成能力，并强调了方法学的灵活性35.
每个模块的成功均依赖于接种物的质量和生理状态。处于对数中期的浮游培养物（3-5天），应具有高度运动性且无聚集体，以获得可重复的黏附和生物膜发育结果。应仅使用低传代次数的分离株，以确保生物膜形成的稳健性和可重复性。
结晶紫（CV）分析法因其快速、可扩展性和高通量而成为整个工作流程的核心9,27。该方法可用于对突变株、培养基或抗生物膜化合物进行快速筛选。然而，由于Leptospira生物膜脆弱且具有异质性，操作时必须轻柔，并需进行重复验证。CV染色法无法区分致密型与多孔型结构，也不能检测基质成分——因此其作用主要是作为深入结构分析的初步筛选手段。
延时成像通过实时揭示生物膜的动力学过程，弥补了这一空白。它能够捕捉运动性聚集体的出现、融合及固定过程，揭示终点检测法所遗漏的瞬时现象。环境稳定性（温度、湿度、自动对焦）至关重要。这些记录显示，即使结晶紫染色测得的生物膜生物量看似稳定，其动态过程仍可能存在差异——表明生物膜深层结构正在发生重组或活力丧失。
共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）可在无脱水假象的情况下提供三维结构和化学成分信息39。活/死细胞染色揭示了生物膜内部的细胞活力梯度，这与先前报道的氧气扩散受限及代谢分层现象一致6,40。凝集素和核酸染料可显示丰富的胞外DNA及特定糖类基序，从而实现对基质组分的定量与表征41,42。CLSM数据常显示出内部空腔结构，这与延时成像中观察到的集体性重排现象相呼应38。然而，其局限性包括探针特异性、光漂白效应以及衍射极限所限制的轴向分辨率；因此，应在实验前对显微镜设置和染料性能进行标准化校验，以确保不同实验间结果的可靠性与可比性。
SEM 提供互补的超微结构分辨率43在早期阶段，可分辨出新生的聚集体；在成熟阶段（≈ 15-21天），显示出极性结构：基部为粗糙、具通道的层，用于附着和物质交换；顶部为较光滑、富含基质的表面37仔细的固定、HMDS干燥以及与共聚焦数据的关联可减轻因脱水或塌陷造成的伪影44.
这四个模块共同实现了内部交叉验证：当结晶紫染色法（CV）、共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和扫描电子显微镜（SEM）结果一致时，结论具有较高可靠性；当结果出现分歧时，这些差异本身也具有信息价值——例如可揭示生物量增加但活力降低，或生物量不变但基质成分发生改变等情况。
目前仍存在若干内在局限性。Leptospira 生物膜具有异质性和脆弱性，因而对操作和脱水极为敏感。结晶紫染色法可测定总生物量，但无法反映细胞活性16；共聚焦激光扫描显微镜受限于光学分辨率极限38；扫描电镜则存在制样过程中产生假象的风险。由于氧气梯度的存在，深层菌体出现死亡属预期现象6，但此类偏差在不同实验条件下具有一致性和可比性。生物膜成熟通常在15至21天左右趋于平台期，此阶段与营养限制相关的转录特征密切相关36。而更晚期的发育阶段仍缺乏充分表征。
体内 实验可提供功能背景。通过腹腔注射，可检测生物膜来源的细胞在毒力或持留性方面是否与浮游细胞存在差异。尽管腹腔接种并非自然感染途径，但其提供了一种可控的比较模型36。聚集体的异质性会引入一定变异，但通过一致的操作和匹配的接种量可减轻该影响。重要的是，生物膜的持留特性（例如由胞外基质介导的应激耐受性）并不一定转化为更强的急性毒力，这凸显了生物膜形成的生态学意义而非致病性作用24。
该模块化设计支持可扩展的应用。若需快速筛选，结晶紫染色法和延时成像已足够；若需获得机制性认识，则共聚焦激光扫描显微镜和扫描电镜可提供组分与结构层面的更高分辨率。各模块可整合酶处理或化学干预（如DNase、糖苷酶）、针对多糖或核酸的替代探针，或微流控系统以检测生物膜对流动的响应。同一接种物还可用于转录组学或蛋白质组学分析，从而将生物膜表型与基因调控直接关联（例如c-di-GMP信号通路、饥饿应答）。该体系同样适用于突变株筛选、环境扰动测试以及抗生物膜或抗毒力化合物的评估。
这一整合性工作流程将孤立的观察结果转化为对Leptospira生物膜的多维度系统认知。通过结合高通量检测（CV）、动态监测（延时成像）、化学成分与三维结构分析（CLSM）以及超微结构观察（SEM），该方法能够真实地揭示Leptospira菌群的可移动性、多孔性及极性特征。在前期研究17,35,36的基础上，本方法进一步证明，协调性的模块化实验能够揭示单一方法无法观察到的现象——例如生物量上升而存活率下降，或不同物种间动力学行为的差异。最终，该方法支持在不同物种、突变株和实验条件下进行具有可比性、可重复性且功能相关的分析，为机制性微生物学研究、生态适应性探索以及抗生物膜策略的设计提供了坚实基础。
披露
作者声明不存在任何竞争性财务或非财务利益。所有作者均已审阅并批准了本声明。
致谢
我们衷心感谢AXA研究基金通过博士后奖学金（编号：15-AXA-PDOC-037）、新喀里多尼亚巴斯德研究所（IPNC）和新喀里多尼亚大学（UNC）通过博士生奖学金，以及法国国家科研署（ANR）在项目编号SPIraL-19-CE35-0006-01下的资助所提供的资金支持。本出版物中提及的商标或商业产品仅用于说明实验过程中所使用的材料，此类提及并不构成新喀里多尼亚巴斯德研究所对任何商业利益的认可、推荐或背书。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.1 µm 无菌亲水性聚碳酸酯膜 | it4ip | 1000M25/861N101/13 | |
| 12 mm 无菌玻璃盖玻片 | SPL | 330164 | |
| 16% 多聚甲醛（PFA） | Thermo Scientific | 28908 | |
| 21G 针头 | BD Medical | 304432 | |
| 24 孔微孔板 | NUNC | 143982 | |
| 35 mm 玻璃底培养皿 | Ibidi | 81218-200 | |
| 35-mm 玻璃底 Hi-Q4 培养皿 | Ibidi | 81156 | |
| 96 孔微孔板 | NEST | 701001 | |
| 抗荧光淬灭封片剂 | Biorad | 29410 | |
| 碳镀膜仪 | Leica Microsystem | Em ACE600 | |
| CFDA/SE 示踪剂 | Biolegend | 423801 | |
| 导电碳胶 | Electron Microscopy Science | 77816 | |
| 结晶紫（CV） | Sigma | C3886 | |
| 暗场显微镜 | Leica Microsystem | 11888846 | Leica DM4000 B 配备暗场聚光镜（货号° 11505142） |
| 乙醇 | VWR Chemicals | 83813.36 | |
| FM4-64 | Invitrogen | T3166 | |
| 冰醋酸 | Supelco | 1.00063 | |
| 戊二醛溶液 | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| 六甲基二硅氮烷 | Acros Organics | 120581000 | |
| 培养箱 | Memmert | IN30 | |
| 倒置共聚焦显微镜 | Leica Microsystem | Leica DMI6000 TCS SP8 X | 共聚焦显微镜 SP8 |
| 配备相差光学系统的倒置显微镜 | Nikon | CELL-S2 | BioStation IM-Q |
| 钩端螺旋体 EMJH 培养基基础 | Becton Dickinson | BD 279410 | 用于钩端螺旋体的 EMJH 培养基 |
| 四氧化锇（OsO4） | Sigma | BCCG9181 | |
| 碘化丙啶 | Biotium | 40017 | |
| 扫描电子显微镜 | JEOL | JSM-IT300 | |
| 二甲胂酸钠缓冲液 | Thermo Scientific Chemicals | 15453149 | |
| 分光光度计 Varioskan Lux | Thermo Scientific | VLBL00GD0 | |
| 无菌磷酸盐缓冲液 | Biosolve | 0016232301BS | |
| 注射器（1 mL） | Chirana | CH03002L | |
| SYTO9 绿色荧光核酸染料 | Invitrogen | S34854 |
参考文献
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 623-633 (2010).
- Sharma, S., et al. Microbial biofilm: A review on formation, infection, antibiotic resistance, control measures, and innovative treatment. Microorganisms. 11 (6), (2023).
- Flemming, H. C., et al. Biofilms: An emergent form of bacterial life. Nat Rev Microbiol. 14 (9), 563-575 (2016).
- Mendhe, S., Badge, A., Ugemuge, S., Chandi, D. Impact of biofilms on chronic infections and medical challenges. Cureus. 15 (11), e48204(2023).
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nat Rev Microbiol. 6 (3), 199-210 (2008).
- Nadell, C. D., Xavier, J. B., Foster, K. R. The sociobiology of biofilms. FEMS Microbiol Rev. 33 (1), 206-224 (2009).
- Donlan, R. M. Biofilms: Microbial life on surfaces. Emerg Infect Dis. 8 (9), 881-890 (2002).
- O'Toole, G. A. Microtiter dish biofilm formation assay. J Vis Exp. (47), e2437(2011).
- Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology (Reading). 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).
- Beenken, K. E., et al. Global gene expression in Staphylococcus aureus biofilms. J Bacteriol. 186 (14), 4665-4684 (2004).
- Wilson, C., et al. Quantitative and qualitative assessment methods for biofilm growth: A mini-review. Res Rev J Eng Technol. 6 (4), (2017).
- Yildiz, F. H., Visick, K. L. Vibrio biofilms: So much the same yet so different. Trends Microbiol. 17 (3), 109-118 (2009).
- Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Curr Protoc Microbiol. Chapter 1 (Unit 1B.1), (2005).
- Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Crit Rev Microbiol. 43 (3), 313-351 (2017).
- Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. J Microbiol Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
- Ristow, P., et al. Biofilm formation by saprophytic and pathogenic Leptospires. Microbiology. 154 (Pt 5), 1309-1317 (2008).
- Chiani, Y. T., et al. Presence of Leptospira spp. in a mosaic of wetlands used for livestock raising under differing hydroclimatic conditions. Appl Environ Microbiol. 89 (6), e0197122(2023).
- Yamaguchi, T., et al. Characterizing interactions of Leptospira interrogans with proximal renal tubule epithelial cells. BMC Microbiol. 18 (1), 64(2018).
- Santos, A. A. N., et al. Leptospira interrogans biofilm formation in Rattus norvegicus (Norway rats) natural reservoirs. PLoS Negl Trop Dis. 15 (9), e0009736(2021).
- Ackermann, K., et al. In vivo biofilm formation of pathogenic Leptospira spp. in the vitreous humor of horses with recurrent uveitis. Microorganisms. 9 (9), (2021).
- Dos Santos Ribeiro, P., et al. Environmental biofilms from an urban community in Salvador, Brazil, shelter previously uncharacterized saprophytic Leptospira. Microb Ecol. 86 (4), 2488-2501 (2023).
- Vinod Kumar, K., Lall, C., Raj, R. V., Vedhagiri, K., Vijayachari, P. Molecular detection of pathogenic leptospiral protein encoding gene (lipL32) in environmental aquatic biofilms. Lett Appl Microbiol. 62 (4), 311-315 (2016).
- Davignon, G., et al. Leptospirosis: Toward a better understanding of the environmental lifestyle of Leptospira. Front Water. 5, 1195094(2023).
- Dias, C. S., Pinna, M. H. Leptospira biofilms: Implications for survival, transmission, and disease management. Appl Environ Microbiol. 91 (2), e0191424(2025).
- Gomes, D. O., et al. Biofilm production of Leptospira spp. strains. Acta Sci Vet. 46 (1), 5(2018).
- Thibeaux, R., Kainiu, M., Goarant, C. Biofilm formation and quantification using the 96-microtiter plate. Methods Mol Biol. 2134, 207-214 (2020).
- Vinod Kumar, K., Lall, C., Vimal Raj, R., Vedhagiri, K., Vijayachari, P. Co-existence and survival of pathogenic Leptospires by formation of biofilm with Azospirillum. FEMS Microbiol Ecol. 91 (6), fiv051(2015).
- Chua, S. L., et al. Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles. Nat Commun. 5, 4462(2014).
- Rollet, C., Gal, L., Guzzo, J. Biofilm-detached cells, a transition from a sessile to a planktonic phenotype: A comparative study of adhesion and physiological characteristics in Pseudomonas aeruginosa. FEMS Microbiol Lett. 290 (2), 135-142 (2009).
- Haake, D. A. Hamster model of leptospirosis. Curr Protoc Microbiol. Chapter 12 (Unit 12E.12), (2006).
- Cagliero, J., Huet, K., Matsui, M. Use of golden Syrian hamster as an animal model to study leptospirosis-associated immune responses. Methods Mol Biol. 2134, 243-255 (2020).
- Gomes-Solecki, M., Santecchia, I., Werts, C. Animal models of leptospirosis: Of mice and hamsters. Front Immunol. 8, 58(2017).
- Guedes, I. B., et al. Improvement of the enrichment used in the EMJH medium (Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris) for the cultivation of Leptospira spp. Rev Argent Microbiol. 54, 95-99 (2022).
- Iraola, G., et al. Transcriptome sequencing reveals wide expression reprogramming of basal and unknown genes in Leptospira biflexa biofilms. mSphere. 1 (2), e00042-e00116 (2016).
- Davignon, G., et al. Leptospira interrogans biofilm transcriptome highlights adaption to starvation and general stress while maintaining virulence. NPJ Biofilms Microbiomes. 10 (1), 95(2024).
- Thibeaux, R., et al. The zoonotic pathogen Leptospira interrogans mitigates environmental stress through cyclic-di-GMP-controlled biofilm production. NPJ Biofilms Microbiomes. 6 (1), 24(2020).
- Lawrence, J. R., Neu, T. R. Confocal laser scanning microscopy for analysis of microbial biofilms. Methods Enzymol. 310, 131-144 (1999).
- Bridier, A., Briandet, R. Contribution of confocal laser scanning microscopy in deciphering biofilm tridimensional structure and reactivity. Methods Mol Biol. 1147, 255-266 (2014).
- Werner, E., et al. Stratified growth in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Appl Environ Microbiol. 70 (10), 6188-6196 (2004).
- Neu, T. R., Lawrence, J. R. Advanced techniques for in situ analysis of the biofilm matrix (structure, composition, dynamics) by means of laser scanning microscopy. Methods Mol Biol. 1147, 43-64 (2014).
- Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends Microbiol. 23 (4), 233-242 (2015).
- Relucenti, M., et al. Microscopy methods for biofilm imaging: Focus on SEM and VP-SEM pros and cons. Biology (Basel). 10 (1), (2021).
- Braet, F., De Zanger, R., Wisse, E. Drying cells for SEM, AFM and TEM by hexamethyldisilazane: A study on hepatic endothelial cells. J Microsc. 186 (Pt 1), 84-87 (1997).
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