方法文章

全细胞超分辨率成像 通过 使用光学光子重分配的旋转盘共聚焦显微镜进行DNA-PAINT成像

1.3K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/69531

⸱

2026年1月6日

 ,  ,  , 
1London Centre for Nanotechnology, University College London, 2Department of Chemistry, University College London

本文内容

摘要

本方案概述了使用配备光学光子重分配功能的转盘共聚焦显微镜进行深层全细胞单分子定位显微镜（SMLM）成像的实验步骤，从而无需定制光学元件或复杂照明即可实现DNA-PAINT成像。

摘要

单分子定位显微镜（SMLM）能够对细胞结构进行纳米尺度成像，但由于全内反射荧光（TIRF）和高倾斜光片（HILO）照明的局限性，通常仅限于盖玻片附近的成像。本文介绍了一种利用配备光学光子重分配技术（SDC-OPR）的转盘共聚焦显微镜在完整细胞中实现SMLM的实验方案。该方法结合DNA点积累纳米拓扑成像技术（DNA-PAINT），无需定制光学元件或复杂的照明方案，即可在整个细胞体积内实现高精度的单分子成像。本方案逐步说明如何配置商用转盘显微镜（例如CSU-W1 SoRA）以进行SMLM成像，包括针对深层成像优化的采集参数。同时概述了使用DNA偶联探针对细胞内靶标进行标记的样品制备步骤，涵盖多个靶标多色成像的策略。图像采集后，可使用标准软件包进行单分子定位与图像重建。文中还讨论了降低背景信号、优化横向分辨率以及确保全细胞深度范围内成像质量的关键注意事项。该易于实施的方案使研究人员能够利用标准共聚焦设备开展深层、全细胞SMLM研究，从而拓展单分子成像可解决的生物学问题范围，突破近膜区域的限制。

引言

单分子定位显微镜技术（SMLM）1 是一类通过在时间上分离单个荧光分子的发射信号并以高精度对其进行定位，从而实现纳米级分辨率的超分辨率成像技术。成功的单分子定位显微镜（SMLM）需要高信噪比（SNR）以检测单分子事件，这传统上限制了其应用范围，仅限于能够提供强而局域化激发光的光学系统。最常见的配置是全内反射荧光（TIRF）2 显微镜与高倾斜层光照明（HILO）3TIRF 通过产生倏逝场，选择性地激发盖玻片表面数纳米范围内的荧光分子，从而降低背景荧光，抑制非焦平面的照明。然而，这种限制使得 TIRF 不适用于对延伸至细胞外区域的深层生物结构（如细胞器）进行成像。HILO 显微镜可实现更大的穿透深度，允许在玻璃基底上方数百纳米范围内进行成像，但代价是视场（FOV）减小。4 以及随着焦平面升高而出现的照明不均，限制了其在较大细胞结构中的应用。最近，诸如晶格光片显微镜（lattice light-sheet）等光片显微镜（LSM）技术5,6,7 单目标单平面照明显微镜（soSPIM）8 已将SMLM拓展至三维及组织尺度成像。通过将激发光束塑造成薄而结构化的光片，LSM实现了光学切片，同时降低了背景信号与光毒性。soSPIM可在单次曝光中捕获与检测轴正交的焦平面，从而实现具有近各向同性分辨率的快速三维成像。soSPIM的应用已实现在完整细胞及小型细胞器中的三维SMLM>20 µm 深度，各向同性分辨率达到40 nm，且背景离焦信号极低9尽管这些方法具有优势，但通常需要透明的样本、专用的光学设备和复杂的校准，且在较厚的样本中仍对光学像差和散射敏感。

共聚焦显微镜通过在探测器前使用针孔并结合光束扫描镜，排除离焦光线，从而提供了一种替代方案10。这种光学切片能力可实现高信噪比（SNR）的深层三维成像。特别是旋转盘共聚焦（SDC）显微镜，结合了传统成像的高速性和宽场探测优势，以及点扫描系统的光学切片能力。在传统SDC中，这一目标通过采用带有平行针孔的旋转圆盘实现，通常还配合使用对齐的微透镜阵列。微透镜收集大部分发射的荧光信号，并将其聚焦穿过针孔，从而降低背景信号。该配置可在无需特殊光学元件或额外样品制备的情况下实现快速光学切片，是一种稳健的技术方案，易于实施并优化，适用于深层三维单分子定位显微镜（SMLM）图像采集11。

本研究采用了配备光学光子重分配技术（SDC-OPR）的 CSU-W1 转盘共聚焦扫描装置。与标准转盘共聚焦（SDC）不同，SDC-OPR 引入了第二组微透镜阵列，将发射的光子投射到互补的针孔图案上12，从而减少散射并回收原本会被丢弃的光子。这种光子重分配技术能有效锐化点扩散函数（PSF），在保持排除离焦光能力的同时，进一步提升横向分辨率13。具体而言，SDC-OPR 的微透镜阵列将离轴光子重定向至其最接近的来源点，从而相比标准 SDC 有效提高检测到的荧光亮度。此外，通过图像去卷积可进一步放大 SDC-OPR 的分辨率优势。via 迭代去卷积算法可在计算上优化 PSF、降低背景噪声，并提高信背比，而无需改变光学配置。这种联合方法在单分子定位实验中，相较于标准 SDC 显著提升了定位精度14。

本文介绍了一种利用配备光学光子重分配（SDC-OPR）功能的转盘共聚焦显微镜进行单分子定位显微成像的稳健且可重复的实验方案。该方法结合了DNA-PAINT的纳米级定位精度与转盘成像的速度、视场（FOV）以及深度穿透能力。DNA-PAINT是点累积成像纳米级拓扑结构（PAINT）技术的一种改进形式15，其原理依赖于荧光标记的“"成像链"”与锚定在分子靶标上的互补“"停靠链"”之间的瞬时杂交。这些可逆的结合事件产生随机的荧光信号，可被精确定位，从而实现对细胞超微结构的高分辨率重建。DNA-PAINT能够使用光稳定性极高的荧光染料，通过可调节的结合动力学精确控制成像条件，并且由于荧光成像链的持续补充，有效减轻了光漂白现象16。

为确保可重复性和特异性，该方法依赖于定制的DNA-抗体偶联物，以将锚定链连接至二抗。文中详细介绍了包括抗体-DNA偶联在内的样品制备步骤，以支持可靠的实验结果。本方案已在核孔复合体（NPCs）等特征明确的细胞结构上得到验证。17 以及固定样品中的微管，为评估重建准确性提供了参考点。分辨率的差异通过量化分析得出 通过 以定位精度作为代理指标，进一步评估其随视场（FOV）和成像深度的变化关系。

此外，本工作流程在多重成像中的高效性通过Exchange-PAINT18得以展示，这是一种基于DNA-PAINT的策略，能够在同一染料和单一激光光源下实现多个靶标的顺序可视化。Exchange-PAINT工作流程被应用于同一样本中线粒体、微管和核孔复合体（NPCs）的多色超分辨率成像。

综上所述，本实验方案为抗体-DNA偶联、样品制备、成像条件及数据分析提供了全面的指导和关键的适应性说明，使研究人员能够在SDC-OPR系统上实现可重复的DNA-PAINT成像。该方法突破了基于TIRF技术在成像深度和视场范围上的限制，从而拓展了单分子定位显微镜（SMLM）在多种生物体系中的应用范围。

方案

所用试剂和设备列于材料表中。

1. 缓冲液的制备

  1. 细胞骨架缓冲液（CB）的配制：
    1. 在1×过滤的磷酸盐缓冲液（PBS）中配制含10 mM MES（pH 6.1）、150 mM NaCl、5 mM EGTA、5 mM D-葡萄糖和5 mM MgCl2的溶液。
    2. 4 °C保存，使用前过滤。
  2. 40×原儿茶酸（PCA）储备液的配制：
    1. 将154 mg PCA溶解于10 mL蒸馏过滤水中。
    2. 用NaOH调节pH至9.0。
    3. 分装后于-20°C保存，最长不超过6个月。
      注意：若任何分装样品呈现棕色，请弃用，因这表明已发生氧化。
  3. 100×原儿茶酸-3,4-双加氧酶（PCD）储备液的配制：
    1. 配制含50 mM KCl、1 mM EDTA和100 mM Tris缓冲液的50%甘油溶液。
    2. 将2.2 mg PCD溶解于3.4 mL甘油溶液中。
    3. 分装后于-20 °C保存，最长不超过6个月。
  4. 100×Trolox储备液的配制：
    1. 在通风橱内，佩戴适当的个人防护装备（PPE），将50 mg Trolox（6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸）溶于215 µL甲醇中，直至溶液变为绿色。
    2. 加入1.6 mL蒸馏过滤水，使溶液逐渐变白并开始凝固。
    3. 加入175 µL 1 M NaOH，使溶液重新开始液化。
    4. 以10 µL为单位，继续加入1 M NaOH，直至溶液完全澄清（约40 µL）。
    5. 分装后于-20 °C保存，最长不超过6个月。最终溶液呈淡黄色。
      注意：最终100×溶液的pH为11，但稀释至1×后pH为7–8。
  5. 缓冲液C+
    1. 在1× PBS中配制含1 mM EDTA、500 mM NaCl和0.02% Tween-20的溶液。
    2. 根据需要，用HCl和/或NaOH调节pH至7.4。
    3. 可选Trolox补充：加入适量PCA（40×）、PCD（100×）和Trolox（100×）储备液，使其稀释至1×，室温（23 °C）平衡1小时后使用。
      注意：每周新鲜配制。若使用Trolox，应在混合后4小时内使用。
  6. 免疫染色缓冲液（多聚甲醛PFA、甘氨酸和Triton）：
    1. 从10 mL 16% PFA安瓿瓶配制4% PFA：
      1. 在通风橱内，小心折开安瓿瓶。
      2. 将10 mL 16% PFA倾倒入50 mL锥形离心管中。
      3. 用1× PBS进行1:4稀释，得到4% PFA，小心加入约30 mL 1×过滤PBS至倾倒出的16% PFA中，最终体积约为40 mL。
      4. 分装至1 mL微量离心管中，-20 °C保存备用。
    2. 配制PBS中的60 mM甘氨酸溶液：
      1. 称取225 mg甘氨酸至50 mL锥形离心管中。
      2. 加入50 mL 1×过滤PBS。
      3. 涡旋振荡至完全溶解，过滤。
      4. 4 °C保存备用。
    3. 配制0.1% Triton X-100溶液：
      1. 首先，通过将1 mL 100% Triton X-100加入9 mL 1×过滤PBS中（终体积=10 mL），配制10% Triton X-100工作液，用移液器缓慢混合，避免产生过多气泡。4 °C保存备用。
      2. 从10%工作液中取0.1 mL加入9.9 mL 1×过滤PBS中，得到0.1%终浓度工作液，同样缓慢混合。4 °C保存备用。

2. 抗体-DNA 偶联

  1. 使用100 kDa超滤离心过滤装置浓缩抗体：
    1. 用100 µL 1×过滤PBS在14,000 × g、4 °C条件下洗涤100 kDa超滤离心过滤装置30分钟。
    2. 将100 µL抗体与200 µL 1×过滤PBS加入先前已洗涤的100 kDa超滤离心过滤装置中，在14,000 × g、4 °C条件下离心30分钟。确保超滤离心过滤后抗体浓度高于1.5 mg/mL。该方法通常可使抗体浓缩约3倍。
    3. 将100 kDa超滤离心过滤装置倒置放入洁净离心管中，在1000 × g、4 °C条件下离心6分钟。所得即为PBS中的浓缩抗体。
    4. 测定浓缩抗体体积（1或2 μL），使用微量紫外-可见分光光度计记录其紫外-可见吸收光谱。以1× PBS作为空白背景，并保存光谱数据。
  2. 还原巯基化DNA接头链：
    1. 将7.7 mg预称量DTT溶于100 µL过滤水中，转移至新离心管中。
    2. 向原DTT管中加入100 µL含1.5 mM EDTA的1× PBS，涡旋混匀后转移至步骤2.2.1的同一管中，最终得到200 µL含250 mM DTT和1.5 mM EDTA的1× PBS溶液。
    3. 将巯基化DNA接头链溶于1×过滤PBS中，使其终浓度为1 mM。取DNA接头链溶液（稀释至10 µM于1× PBS中）用微量紫外-可见分光光度计记录紫外-可见光谱并保存。
    4. 取13 µL巯基化DNA（1 mM）与30 µL DTT（250 mM）混合，在室温（23 °C）下振荡反应2小时。
      注：将剩余未使用的DNA接头链分装为13 µL等份，于-20 °C保存以备后续反应使用。
  3. 抗体与交联剂偶联：
    1. 将马来酰亚胺-PEG2-琥珀酰亚胺酯交联剂溶于DMSO中，配制成10 mg/mL（23.5 mM）溶液。分装为10 µL等份，-20 °C保存备用。
    2. 将步骤2.1所得浓缩抗体与20倍摩尔过量的交联剂混合，在4 °C条件下振荡孵育90分钟。
  4. 使用含尺寸排阻树脂（7 kDa分子量截断值）的7.0 kDa脱盐离心柱纯化抗体-交联剂偶联产物：
    1. 取下7.0 kDa脱盐离心柱底部封盖并松开盖帽，将其放入低吸附蛋白离心管中，在1500 × g、4 °C条件下离心1分钟。
      注：首次离心后标记树脂倾斜方向。后续每次使用该柱时，均应将倾斜面朝外放置于离心机中。加样及洗涤液应加至中心位置，避免接触树脂床。
    2. 向7.0 kDa脱盐离心柱中加入300 µL 1×过滤PBS，松开盖帽，在1500 × g、4 °C条件下离心1分钟，重复此步骤两次。
      注：最后一次洗涤后，保持7.0 kDa脱盐离心柱内含300 µL 1× PBS直至抗体-交联剂反应完成；切勿让柱体干燥。
    3. 再次在1500 × g、4 °C条件下离心1分钟，去除最后300 µL PBS洗涤液。
    4. 将抗体-交联剂溶液逐滴加至树脂床中心，将7.0 kDa脱盐离心柱放入洁净离心管中，在1500 × g、4 °C条件下离心2分钟。此时抗体-交联剂产物已位于离心管中；请保持于4 °C或冰上保存。
  5. 使用含Sephadex G-25（用于DNA纯化的尺寸排阻树脂）的脱盐离心柱纯化DNA-DTT混合物：
    1. 涡旋混匀脱盐离心柱（DNA纯化用），使树脂均匀分布。取下底部封盖并松开盖帽，放入洁净离心管中。
    2. 在735 × g条件下离心1分钟，去除储存缓冲液。
    3. 将脱盐离心柱（DNA纯化用）放入新的离心管中，缓慢将DNA/DTT混合物加至树脂中心。在735 × g条件下离心2分钟。此时纯化后的还原态DNA即位于离心管中。
  6. 合并DNA与抗体-交联剂产物：
    1. 将还原后的DNA以10倍摩尔过量（DNA:抗体）的比例加入抗体-交联剂产物中。纯化完成后应立即混合纯化DNA与抗体-交联剂产物，以防DNA重新结合。
    2. 在4 °C条件下振荡孵育过夜。
      注：建议在傍晚混合DNA与抗体，并于次日清晨立即进行纯化。延长孵育时间可能导致较高的DNA:抗体比例。
  7. 次日清晨使用100 kDa超滤离心过滤装置去除多余DNA：
    1. 用300 µL 1×过滤PBS在14,000 × g、4 °C条件下洗涤100 kDa超滤离心过滤装置30分钟。
    2. 将DNA-抗体混合物与300 µL 1×过滤PBS加入100 kDa超滤离心过滤装置中，在14,000 × g、4 °C条件下离心30分钟。
    3. 将超滤离心过滤装置倒置放入洁净离心管中，在1000 × g、4 °C条件下离心6分钟。所得即为PBS中的浓缩产物。
    4. 用1×过滤PBS将产物稀释至100 µL。
    5. 取产物1或2 μL，使用微量紫外-可见分光光度计记录其紫外-可见光谱，以1× PBS为空白背景，并保存光谱数据。
    6. 根据光谱数据计算最终浓度及DNA:抗体比例。由于DNA的额外吸收，可观察到抗体吸收峰从280 nm向260 nm偏移。参照步骤2.8方法确定浓度及DNA:抗体比例。
    7. 将产物按所用抗体的原始储存条件保存。如需冷冻，请避免反复冻融。
  8. 根据紫外-可见光谱计算DNA:抗体比例：
    1. 根据纯DNA（10 µM于1× PBS中）的光谱，测量其在260 nm（DNA浓度测定，A260公式，吸收光谱法，示意图，分子分析。）和280 nm（DNA在280 nm处的吸光度符号，蛋白质定量关键参数，光谱分析。）的吸光度值。将这两个值除以DNA浓度（10 µM），得到DNA的摩尔吸光系数（DNA吸光系数，ε260，用于分光光度分析；核酸纯度公式符号。 和 DNA吸光系数ε280公式，教学内容，光谱分析，示意图。）。
    2. 同理测定抗体的 摩尔消光系数方程ε260，用于光谱研究中的吸光度分析。 和 光学消光系数ε280Ab，光谱分析，吸光度测量示意图。，注意需除以用于光谱测定的抗体浓度。
    3. 在产物光谱中，260 nm和280 nm处的吸光度由DNA和抗体共同贡献：
      DNA浓度方程，公式，吸收系数ε，核酸定量示意图。
      DNA、抗体浓度吸光度方程；光谱分析公式。
      其中cDNA和cAb分别为最终产物中DNA和抗体的浓度。联立求解上述两式，可得产物中DNA和抗体的摩尔浓度，并据此计算DNA:抗体比例。
      注：首次光谱所用抗体浓度可通过测量超滤离心过滤装置（100 kDa）过滤后剩余抗体体积，并与原始已知浓度的抗体体积比较来计算。

3. 细胞培养

  1. HeLa Kyoto mEGFP-Nup107 细胞。
    1. 配制细胞培养基，即添加了 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素（P/S）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），并在 4 °C 下保存。使用前在 37 °C 水浴中预热培养基 30 分钟。根据实验条件，建议分装并过滤所需用量，以防止污染。
    2. 在 T25 培养瓶中加入 7 mL 预热的含补充物的 DMEM 培养基，以 2 × 105 个细胞/mL 的密度接种细胞。将细胞培养瓶置于 37 °C、5% CO2 的适宜培养箱中培养。
    3. 确保每 48–72 小时传代一次，以防止细胞过度生长。
      1. 取含有融合培养物的 T25 培养瓶，吸除培养基。
      2. 加入 1 mL 胰蛋白酶-EDTA（TE），通过轻轻倾斜培养瓶确保完全覆盖。在 37 °C 下孵育 7 分钟，使细胞从培养瓶表面脱落。
      3. 加入 2 mL 含补充物的 DMEM 培养基并吹打混匀。
      4. 将细胞悬液转移至 15 mL 圆锥形离心管中，并额外加入 7 mL 含补充物的 DMEM 培养基。
      5. 以 400 × g 离心 5 分钟。小心检查管底是否形成细胞沉淀，避免扰动沉淀。
      6. 吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于含补充物的 DMEM 培养基中。
      7. 在新的 T25 培养瓶中加入 7 mL 预热的培养基，以 2 × 105 个细胞/mL 的密度接种细胞。在 37 °C、5% CO2 条件下孵育。
        注：若不确定细胞密度，可使用血细胞计数板测定细胞数量。建议在计数前先用 1 mL 培养基重悬细胞沉淀。
  2. U2OS CRISPR mEGFP-Nup96 细胞
    1. 参照步骤 3.1.1，配制添加 10% FBS 和 1% P/S 的 McCoy's 5A 培养基。
    2. 在 T25 培养瓶中加入 7 mL 含补充物的 McCoy's 5A 培养基，以 2 × 105 个细胞/mL 的密度接种细胞。在 37 °C、5% CO2 条件下孵育。
    3. 每 48 小时传代一次，以保持培养物生长密度低于 80% 融合度：
      1. 吸除培养瓶中的培养基，并用 2 mL 过滤并预热（37 °C）的 1× PBS 轻柔洗涤贴壁细胞。
      2. 吸除 PBS，加入 2 mL Accutase，缓慢倾斜培养瓶以确保完全覆盖，然后在 37 °C 下孵育 7 分钟。
      3. 加入 2 mL 含补充物的 McCoy's 5A 培养基并吹打混匀。
      4. 向细胞悬液中加入 7 mL 培养基，转移至 15 mL 或 50 mL 圆锥形离心管中进行离心。以 400 × g 离心 5 分钟，并检查管底是否形成沉淀。
      5. 将细胞沉淀重悬于含补充物的 McCoy's 5A 培养基中。
      6. 在新的 T25 培养瓶中加入 7 mL 预热的培养基，以 2 × 105 个细胞/mL 的密度接种细胞。在 37 °C、5% CO2 条件下孵育。
        注：所有添加至细胞的溶液均需在水浴或金属浴中预热至 37 °C。对于 Accutase，仅需将 2 mL 分装液预热不超过 5 分钟，以避免降解。

4. Nup96、线粒体和微管的免疫染色

  1. 准备 U2OS mEGFP-Nup96 细胞
    1. 按照步骤 3.2 的说明，吸除 T25 培养瓶中的培养基，并用 2 mL 1× 过滤 PBS 轻柔洗涤贴壁细胞。
    2. 吸除 PBS，加入 2 mL Accutase，缓慢上下倾斜培养瓶，于 37 °C 孵育 7 分钟以促进细胞脱落。
    3. 加入 2 mL 添加物补充的 McCoy's 5A 培养基并吹打混匀。
    4. 将细胞悬液补加至 7 mL 添加物补充的 McCoy's 5A 培养基，转移至 15 mL 或 50 mL 圆锥形离心管中，在 400 × g 条件下离心 5 分钟。再次检查管底是否有细胞沉淀形成。
    5. 用添加物补充的 McCoy's 5A 培养基重悬细胞沉淀。
    6. 以 1 × 105 个细胞/mL 的密度将细胞接种于 8 孔显微培养板中，于细胞培养箱（37 °C，5% CO2）中过夜孵育。
      注意：应在固定和免疫染色操作前 24 小时接种细胞，以确保细胞充分贴壁。
  2. 对 U2OS mEGFP-Nup96 细胞进行 Nup96 成像的免疫染色
    1. 过夜孵育后，将 8 孔显微培养板中的 McCoy's 5A 培养基替换为 1× 过滤 PBS。迅速吸除 PBS，并在化学通风橱中加入预热（37 °C）的 4% 多聚甲醛（PFA）固定液。
    2. 室温（23 °C）固定 30 分钟，建议在化学通风橱内进行，之后洗去 PFA 并妥善处理废液。除非另有说明，后续所有步骤均可在室温下进行。
    3. 移除 4% PFA 固定液，用 1× PBS 洗涤 3 次，每次 3 分钟。
      警告：使用 PFA 时须佩戴适当的个人防护装备（PPE），并在化学通风橱中操作。
    4. 固定完成后，加入含 0.1% Triton X-100 的 1× PBS 溶液以通透细胞膜。静置 5 分钟后，用含 60 mM 甘氨酸的 1× PBS 洗涤 3 次，每次 3 分钟，以淬灭残留 PFA 的自发荧光。
      注意：Triton 通透溶液对时间极为敏感，若作用时间过长可能破坏细胞结构完整性。
    5. 加入含 5% BSA 的 1× PBS 溶液，避光孵育 1 小时，用于免疫染色前的封闭。
    6. 在封闭液（5% BSA 的 1× PBS 溶液）中配制 20 nM 的 DNA 偶联抗 GFP 纳米抗体，以防止非特异性结合。将载片与纳米抗体混合物于室温（23 °C）孵育 1 小时，随后用 1× 过滤 PBS 洗去未结合的 DNA 链，洗涤 3 次，每次 3 分钟。
      注意：暂停点：在固定、封闭及抗体孵育后，样品可在 4 °C 保存过夜。此暂停点主要出于样品制备所需时间的考虑，而非实验流程的严格要求。如条件允许，可立即进行成像。
  3. 对 U2OS mEGFP-Nup96 细胞进行线粒体和微管成像的免疫染色
    1. 过夜孵育后，将 8 孔显微培养板中的 DMEM 培养基同时替换为 200 µL 含 0.3% 戊二醛和 0.25% Triton X-100 的细胞骨架缓冲液（CB），预固定 2 分钟。
    2. 将预固定液替换为含 2% 戊二醛的细胞骨架缓冲液（CB），静置 10 分钟以完成细胞固定，随后参照步骤 4.2.4，用含 60 mM 甘氨酸的 PBS 洗涤 3 次，每次 3 分钟。
      警告：使用戊二醛时须佩戴适当的个人防护装备（PPE），并在化学通风橱中操作。
    3. 加入含 3% BSA 的 1× PBS 溶液，并添加剪切的鲑鱼精子 DNA，避光孵育 1 小时，用于免疫染色前的封闭。
    4. 在含 2% BSA 的溶液中加入 5 µg/mL 的 DNA 偶联抗微管蛋白抗体（用于微管成像）和/或 1:200 稀释的 TOM20 抗体（用于线粒体成像），室温（23 °C）孵育 2 小时。随后用 1× PBS 洗涤 3 次，每次 3 分钟。
    5. 加入 25 nM 的 DNA 偶联 sdAb 抗兔 IgG 抗体，室温（23 °C）孵育 1 小时。随后用 1× PBS 洗涤 3 次，每次 3 分钟。
      注意：暂停点：在固定、封闭及抗体孵育后，样品可在 4 °C 保存过夜。此暂停点主要出于样品制备所需时间的考虑，而非实验流程的严格要求。如条件允许，可立即进行成像。
  4. 准备 HeLa Kyoto mEGFP-Nup107 细胞
    1. 吸除 HeLa Kyoto mEGFP-Nup107 细胞的 T25 培养瓶中的培养基，并用 2 mL 1× 过滤 PBS 轻柔洗涤培养瓶。
    2. 吸除 PBS，加入 2 mL 胰蛋白酶 EDTA（TE），缓慢上下倾斜培养瓶，于 37 °C 孵育 7 分钟。
    3. 加入 2 mL 添加物补充的 DMEM 培养基并吹打混匀。
    4. 将细胞悬液转移至 15 mL 圆锥形离心管中，补加 7 mL 添加物补充的 DMEM 培养基，于 400 × g 离心 5 分钟。检查管底是否有细胞沉淀形成。
    5. 用添加物补充的 DMEM 培养基重悬细胞沉淀。
    6. 以 1 × 105 个细胞/mL 的密度将细胞接种于 8 孔显微培养板中。
      注意：应在成像前 24 小时接种细胞。
  5. 对 HeLa Kyoto mEGFP-Nup107 细胞进行微管成像的免疫染色
    1. 过夜孵育后，将 8 孔显微培养板中的 DMEM 培养基同时替换为 200 µL 含 0.3% 戊二醛和 0.25% Triton X-100 的细胞骨架缓冲液（CB），预固定 2 分钟。
    2. 将预固定液替换为含 2% 戊二醛的细胞骨架缓冲液（CB），固定 10 分钟。随后用含 60 mM 甘氨酸的 1× PBS 洗涤 3 次，每次 3 分钟。
      警告：使用戊二醛时须佩戴适当的个人防护装备（PPE），并在化学通风橱中操作。
    3. 加入含 5% BSA 的 1× PBS 溶液，避光孵育 1 小时，用于免疫染色前的封闭。
    4. 在含 5% BSA 的 1× PBS 溶液中加入 5 µg/mL 的 DNA 偶联抗微管蛋白抗体（如上所述偶联），室温（23 °C）孵育 2 小时，用于微管成像。随后用 1× PBS 洗涤 3 次，每次 3 分钟。
      注意：暂停点：在固定、封闭及抗体孵育后，样品可在 4 °C 保存过夜。此暂停点主要出于样品制备所需时间的考虑，而非实验流程的严格要求。如条件允许，可立即进行成像。
    5. 注意：当使用其他抗体或细胞系时，应根据制造商的建议调整 DNA 偶联抗体或纳米抗体的稀释比例。
  6. 成像前准备
    注意：此步骤适用于所有免疫染色方案。
    1. 将 90 nm 金纳米颗粒用去离子水按 1:2 比例稀释，直接加入每个孔中，使用全孔体积。孵育 5 分钟以用于后续成像过程中的漂移校正。用 1× PBS 洗涤 3 次。
    2. 对于 Nup96 成像，将所需成像链以 1 nM 浓度加入 C+ 缓冲液中，缓冲液需补充 1× Trolox、1× PCA 和 1× PCD。
    3. 对于线粒体和/或微管的 Exchange-PAINT 成像，仅将第一种所需成像链以 1 nM 浓度加入 C+ 缓冲液中。完成第一轮成像后，仔细彻底地洗涤样品，以去除所有残留的成像链，同时避免移动样品。通常进行 5 次洗涤，每次间隔 30 秒即可。随后将第二种成像链以 1 nM 浓度加入 C+ 缓冲液中，进行第二轮成像。

5. 成像设置与参数：单分子定位显微镜

注意：本方案中所示图像由英国伦敦大学学院LMCB超分辨率显微镜平台使用市售的转盘共聚焦显微镜采集，该显微镜配备sCMOS相机并进行操作 通过 NIS-Elements 软件

  1. 使用具有多焦点激发功能的转盘共聚焦系统和sCMOS相机。
  2. 在成像前30分钟启动系统：打开显微镜、相机和激光器，然后启动计算机。等待NIS-Elements软件完全加载。
  3. 在设置采集参数之前，在 NIS-Elements 中选择合适的成像模式：标准转盘共聚焦或 SDC-OPR SoRA 超分辨率模式。
  4. 选择60× Apo NA 1.49油镜物镜用于SDC或SDC-OPR成像，以最大化单分子事件的检测，从而提升后续处理效果。
  5. 根据研究目的、相机设置和待测样本选择合适的放大倍数（1×、2.8× 或 4×），并相应调整相机的像素合并模式：1× 放大对应 1× 合并，2.8× 放大对应 2× 合并，4× 放大对应 4× 合并。在本实验系统中，这对应的有效像素尺寸分别为：1×（无合并）或 4×（4× 合并）时为 108 nm，2.8×（2× 合并）时为 78 nm。为获得适用于单分子定位显微镜（SMLM）的像素尺寸（通常与点扩散函数（PSF）的标准差相匹配，约为 100–150 nm），必须进行像素合并。19,20.
    注意：更高的放大倍数（2.8× 或 4×）会增加激光功率密度，从而改善照明均匀性。这会减小视场（FOV），因此必须相应调整像素合并（即 2.8× 放大倍数时采用 2× 像素合并；4× 放大倍数时采用 4× 像素合并），以保持像素大小不变。
  6. 设置 DNA-PAINT 采集的曝光时间，并将其与转盘转速同步（可通过 CSU-W1 控制面板调节）。确保转速为曝光时间的整数倍，或按下 Sync 按钮以自动匹配最接近的兼容转速。检查屏幕是否存在条纹伪影，此现象表明设置未同步。本实验所用曝光时间为 300 ms。
    注意：SDC 单元旋转同步微透镜增强型 SoRa 圆盘的转速会影响光束激发轮廓，从而影响照射区域上的平均功率密度分布。因此，与 TIRF 系统相比，可能需要更长的曝光时间。
  7. 设置激光波长、功率和滤光轮（NIS-Elements 将推荐合适的滤光片）。激光波长应根据成像染料的光谱特性确定。
    注意：本研究中使用了Cy3B，其最佳激发波长为561 nm激光。Cy3B在DNA-PAINT中可提供最佳的信噪比，因此是该应用的首选染料。
  8. 调节激光功率 通过 激光功率（0%–100%）。对于DNA-PAINT成像，将激光功率设为最大值（100%）。在此系统中，这相当于1.75 mW（≈ 65 W/cm²）2) 在4倍物镜后测量，功率为3 mW（约50 W/cm²）2）两次，以及5 mW（≈ 15 W/cm²）21×。
    1. 在物镜后方测量功率时，使用经过校准的激光功率计，将传感器放置在显微镜载物台上，尽可能靠近样品平面所在的位置。注意避免与物镜镜头接触。记录每种配置下的功率值。
  9. 在干净的60× Apo NA 1.49油镜物镜上滴加一滴浸油。
  10. 使用载物台适配器将制备好的样品（来自步骤4.2–4.5）固定在载物台上。此步骤对于在图像采集过程中最大限度减少漂移，以及在缓冲液更换期间防止样品移动尤为重要，特别是在多色实验中。
  11. 切换至所选成像方法中的明场模式，并利用纳米颗粒作为参照物对玻璃平面进行聚焦。激活完美聚焦系统（Perfect Focus System, PFS）。在整个图像采集过程中，必须使用PFS或类似系统以维持焦点稳定，因为轴向漂移无法通过后期处理进行校正。
    注意：尼康PFS系统通过偏移透镜和线阵CCD检测器，持续监测并调节固定参考平面与样本焦平面之间的距离，从而保持样本始终清晰对焦。该系统独立于图像采集过程运行，可实时（约数毫秒）校正焦距漂移。
  12. 在启用PFS的情况下，选择感兴趣的成像平面。对于U2OS mEGFP-Nup96细胞或HeLa Kyoto mEGFP-Nup107细胞，利用GFP标记的核孔复合体产生的488 nm GFP信号来识别最平坦的细胞，并确定最佳焦平面。此步骤中应使用低激光功率（约最大激光功率的10%），以避免光漂白。
  13. 定义实验的名称和保存路径。勾选 时间 设置间隔、持续时间和循环次数。对于连续采集，将间隔设置为 无延迟 仅输入循环次数，该数值对应于总帧数。
    注意：确保已选中底部的 PFS 框，然后按“运行”。软件将自动提供预计的实验持续时间，并在实验完成后保存数据。若需在实验结束前停止，请按“完成”以保存当前进度，或按“中止”以结束实验且不保存数据。
  14. 对于第一种蛋白质，以300 ms的积分时间采集17,000–20,000帧。
    注意：在此步骤中需要优化成像链的浓度，以确保单分子信号不发生重叠，同时仍能提供足够数量的定位事件用于重构。该过程类似于典型的单分子定位显微镜（SMLM）图像采集，需调节成像链浓度，在尽量减少信号重叠的同时获得足够数量的定位事件用于重构。最佳浓度取决于所成像的结构。例如，标记密度较高的结构（如微管）通常需要较低的成像链浓度（低于1 nM）。
  15. 使用移液器小心移除用于下一种蛋白质的成像缓冲液，注意避免扰动样本。通过显微镜相机观察样本的同时，小心加入 200 µL 不含成像剂的 C+ 缓冲液，以洗去第一种染料。
  16. 重复此步骤，直至无法检测到第一种DNA成像溶液的荧光信号（通常需洗涤5次）。
  17. 加入第二种成像溶液，并检查是否再次检测到单分子事件。
  18. 以300 ms的积分时间采集第二种蛋白质的17,000至20,000帧。
  19. 对每种需要成像的额外蛋白质重复步骤 5.14–5.18。
  20. 用于三维成像，采集 z-以0.5–1 µm的间距对整个细胞高度进行层扫描。此操作通过特定的JOB方案完成21 专为采集软件（NIS Elements）设计，可在特定条件下以预设帧数进行视频拍摄 z 位置，在整个采集时间内保持点扩散函数（PSF）的稳定。
    注意：该软件包及详细使用说明已包含在 JOB 方案中21. 还提供了该 JOB 的完整描述。名为“MultiZ_DNAPaint.bin”的软件可从该出版物的“Materials”选项卡下载。要运行该 JOB，请下载此文件，并按照提供的分步说明将其导入 NIS-Elements JOBS Explorer。

6. 图像处理与分析

注意：图像首先使用兼容软件进行去卷积处理，然后使用由Jungmann实验室开发的Picasso软件进行单分子定位分析16。

  1. 打开 ND2图像序列 在 NIS-Elements AR 软件中。
  2. 对于二维图像，选择 二维去卷积对于三维图像，需对每个单独的z-stack重复此操作。
  3. 选择盲反卷积，有效针孔设为 0.01，噪声水平设为“高噪声”。然后输入激光激发波长和发射波长，此处分别为 560 nm 和 571 nm。其他参数将从 ND2 元数据中自动获取，以对原始图像的点扩散函数（PSF）进行粗略估计。
  4. 指定迭代次数（此处为 12），选择“创建新文档”，然后点击“去卷积”。处理完成后保存生成的文件。
    注意：该算法通过执行卷积运算来优化点扩散函数（PSF），从而迭代地提升图像质量，直至达到收敛或指定的迭代次数。建议对去卷积后的图像进行视觉检查。根据计算资源限制和图像质量，需要调整迭代次数。
  5. 将去卷积后的图像序列加载到 Picasso Localize 模块中。
  6. 从菜单栏中选择 分析 → 参数，并根据制造商的规格输入相机特定参数。本研究中使用的sCMOS相机（Hamamatsu ORCA-Fusion BT）参数如下：EM增益：1，基线：100，灵敏度：0.23（转换系数，电子数/计数值），量子效率：0.95（取决于所用激发波长）。
    注意：自 Picasso 0.6.0 版本起，量子效率（Quantum Efficiency）不再使用，仅保留以实现向后兼容。
  7. 将盒子边长设为 7。盒子长度由公式 [6 × σ] 确定PSF + 1]，其中 σPSF 是点扩散函数（PSF）的标准差。该优化可提高定位精度，从而提升重建图像的分辨率。
  8. 根据第5.5节步骤选择合适的成像配置像素尺寸。
  9. 接下来，选择一个合适的最小网络梯度值（例如，约 1000，具体数值取决于样本），并启用预览功能以查看检测到的定位点。检查结果，并根据需要调整梯度阈值，以尽量减少背景信号的误检，确保定位的准确性。
  10. 从菜单栏中选择 分析 → 定位 (识别 & 合适）以开始在所有视频帧中进行斑点识别与拟合。完成分析后，该过程将自动保存一个 .hdf5 文件和一个 .yaml 文件。
    注意：.hdf5 文件存储每次高斯拟合的定位位置及其他参数；.yaml 文件保存有关视频和分析流程的信息，可使用文本编辑器查看。
  11. 在 Picasso Render 模块中加载 .hdf5 文件，以可视化重构的定位图并进行漂移校正。
  12. 在 Picasso Render 中选择 后处理 → 去漂移 由RCC输入一个分割值，起始值为1000。完成后，将显示计算得出的xy漂移图。随后依次重复该过程，使用更低的分割值（例如500，然后250），观察时间漂移的逐步改善情况。
    注意：也可使用纳米颗粒作为基准标记物进行漂移校正；然而，在成像较高焦平面时，纳米颗粒信号可能不可见。在此类情况下，仅应用冗余互相关（RCC）漂移校正。
  13. 务必保存经过漂移校正的文件，进行选择 文件 → 保存定位信息 在关闭 Picasso Render 窗口之前。
  14. 将第6.13步中经漂移校正的文件载入Picasso Filter模块，以对单分子定位的质量指标施加阈值，进行进一步的后处理，包括：（i）定位精度（lpx, lpy）；（ii）点扩散函数宽度（sx, sy）；（iii）光子计数；（iv）其他用于去除噪声、离群值或分辨不良斑点的附加标准。
    注意：lpx 和 lpy（x 和 y 方向上的定位精度）用于估计定位点在 x 和 y 轴方向上的位置不确定性，其值基于克拉美-罗下界（CRLB）计算得出。
  15. 要筛选某一属性，请在表格标题行中选择相应的列，然后选择 绘图 → 直方图 从菜单中。
    注意：选择两列可绘制二维直方图。
  16. 要按特定属性范围进行筛选，请在1D或2D直方图中所需区域内点击并拖动。选定区域将以绿色阴影显示，所有该范围之外的定位事件将立即从定位列表中排除。
  17. 根据光子数、sx、sy、lpx 和 lpy 对数据进行筛选，仅保留各参数分布的中心范围部分，以确保保留最可靠的定位结果。
    注意：点扩散函数（PSF）宽度分布的中心区域通常介于0.4至1.2倍像素尺寸之间。应排除由信号重叠或分辨率差的斑点所导致的次要分布。
  18. 通过选择保存过滤后的数据 文件 → 保存 从菜单中。
  19. 对每种成像剂溶液拍摄的所有视频，重复步骤6.1–6.18的过程。
  20. 在 Picasso Render 模块中打开已过滤的文件。该超分辨率图像中的强度表示定位点的数量。可通过选择调整对比度 视图 → 显示设置 并更改最大密度的值。
  21. 在“模糊”部分选择“单个定位精度”，以保存单通道的超分辨率图像。也可从“比例尺”部分添加比例尺。
  22. 为保存所有通道的超分辨率图像，打开所有已处理的 .hdf5 文件。可通过选择更改各通道的颜色 视图 → 文件 从菜单中。
  23. 对齐所有通道选择 后期处理 → 对齐通道.
  24. 选择 文件 → 导出完整图像 保存为 .png 图像或 文件 → 导出当前视图 用于图像的特定放大倍数。
    注意：为确保可重复性，应采用一致的文件命名和文档记录规范。Picasso 软件会自动为每个保存的文件添加后缀。克拉默-拉奥下限和基于最近邻分析（NeNA）22 可通过选择提取指标 视图 → 显示 从菜单中获取信息。NeNA 通过评估相邻定位点之间的欧几里得距离，来量化局域荧光分子的空间分布。虽然CRLB基于光子统计和背景噪声提供了定位精度的理论下限，但NeNA则从数据集本身直接得出定位精度的实验估计值。因此，NeNA在单分子定位显微镜（SMLM）中被广泛用作CRLB的补充指标，因为它不仅反映理论极限，还包含漂移校正、拟合误差和实验变异性等实际影响因素。NeNA指标由Picasso Render模块提取。单分子拟合的CRLB用于确定所提供的定位精度值（σ）SMLM）。报告的值为 σ 之间的平均值x 和 σy, 对于所有定位点，其定位精度分布的众数值 x 和 y分别。

结果

为了展示SDC-OPR系统在超分辨率成像方面的性能（图1A），通过进行 DNA-PAINT 成像实验评估其平面内分辨率（图1B) 关于核孔复合体（NPCs），其作为一种生物学参考结构17. 图1C 显示了U2OS细胞中核孔素96（Nup96）的代表性DNA-PAINT SDC-OPR图像，该蛋白标记有单体增强型绿色荧光蛋白（mEGFPs），并用DNA偶联的抗GFP纳米抗体进行标记。放大图显示了NUP的亚结构， 图1D 显示成对的Nup96蛋白（由箭头指示），符合核孔预期的8重对称性。在 图1E，通过将Nup96对进行比对并对叠加图像的横截面直方图进行绘图，测量了Nup96对之间的欧几里得距离（n = 16对）。分析结果显示其峰间距离为（13 ± 2）nm图1E)，与EM模型以及HILO和TIR成像的结果一致23每个峰拟合显示标准偏差为4 nm，证实了高定位精度（σSMLM = 3.3 nm，NeNA = 4.4 nm），该精度在53 × 53 µm²的整个视场范围内均得以保持，这在基于共聚焦的系统中极为出色。

为展示多色成像能力，对U2OS细胞中的Nup96、线粒体和微管进行了DNA标记，用于Exchange-PAINT18成像。该技术采用与单一荧光染料偶联的正交DNA成像链，使所有靶标均可由同一激光源激发（图2A）。该方法并非同时采集信号，而是通过连续成像轮次将信号分离，从而可简便地整合到任意商用的SDC-OPR系统中。图2B显示了以抗GFP纳米抗体标记呈蓝色的Nup96、以抗TOM20二抗标记呈红色的线粒体，以及以抗α-微管蛋白一抗标记呈绿色的微管。值得注意的是，在单色Nup96成像中获得的优异单分子定位精度在多靶标实验中得以在所有靶标上保持，其定位精度值分别为：核孔复合体（NPC）3.9 nm、α-微管蛋白4.0 nm、线粒体3.3 nm（图2B的图板1、2和3）。

对于大视场成像，使用SDC-OPR系统上可用的不同放大倍数结合不同的相机像素合并设置，对HeLa细胞中的微管进行了成像，以保持78 nm至108 nm之间的像素尺寸（图3）。图3A展示了10个HeLa细胞的微管细胞骨架，颜色表示定位精度。在1×放大倍数下，平均定位精度明显劣于更高放大倍数下的结果（图3B-D），且变异性更大。这是由于在更大的视场中激光功率密度降低，高斯照明轮廓变得明显，导致视场边缘区域的定位精度下降。尽管如此，在基于共聚焦的系统中，能够在211 × 211 µm²的广阔视场范围内实现9.5 nm的平均定位精度，已属优异，可支持对生物学异质性的高分辨率研究。

最后，通过使用系统的最高放大倍数（4×，53 × 53 µm² 视场），在约 500 nm 厚度、1 µm z 步进的共聚焦体积内对固定化的 HeLa 细胞中微管网络进行 DNA-PAINT 成像，展示了对完整细胞成像的可能性。图 4A 展示了每个 z 平面的单分子重构图像，以及相应的定位精度和 NeNA 值。此外，图 4C 提供了 HeLa 细胞中微管网络的三维彩色渲染可视化图像。随着成像深度增加，由于散射和光学像差，检测到的光子数减少，导致基于克拉默-拉奥下限（Cramér-Rao Lower Bound, CRLB）计算的定位精度（图 4A，右图）以及使用 NeNA 指标计算的定位精度均有所下降。然而，SDC-OPR 系统能够高效收集光子，使得在高达 9 µm 的成像深度下仍可实现 σSMLM ≤ 10 nm，且分布较窄。事实上，双层壁状的丝状微管结构在不同深度均被清晰分辨：靠近盖玻片-细胞界面处、中间轴向位置以及细胞顶部，其峰间距为 30 nm 至 40 nm（图 4C），与已有报道的数值一致24。这些结果突显了 SDC-OPR 系统在大视场范围内以及在整个细胞高度上实现高分辨率成像的能力。

SOD-CPR 显微镜与 DNA-PAINT 示意图，用于纳米级精度的蛋白质定位。
图 1： 不同细胞样本的平面内单分子定位显微成像及多色超分辨率成像。（A）配备光学光子重分配（SDC-OPR）系统的旋转盘共聚焦显微镜示意图，该系统采用微透镜阵列以最大化光子收集效率。（B）DNA-PAINT 原理示意图：荧光标记的 DNA 链（称为 成像器 链）与互补的 DNA 序列（对接 链）发生瞬时杂交，这些对接链被固定在靶向目标蛋白的抗体/纳米抗体上。这些短暂的结合事件产生随机闪烁的荧光信号。（C）在 SDC-OPR 系统上获得的 U2OS 细胞核孔复合体（NPC）DNA-PAINT 成像结果，放大倍数为 4×。插图展示了其高分辨率能力，可清晰分辨单个核孔复合体。（D）经 SDC-OPR 增强的 DNA-PAINT 可实现单个核孔复合体的可视化，其中白色箭头标示了孔结构中特征性的 Nup96 蛋白对。（E）单个核孔复合体对称单元内 Nup96 二聚体间距离测量值的分布（n=16 对）。本图改编自 Zaza 等人14。请点击此处查看该图的高清版本。

显微镜示意图；细胞结构与过程；蛋白质相互作用；荧光可视化。
图 2：利用 SDC-OPR 显微镜进行多色成像的 Exchange-PAINT 技术。（A）依次对三个靶标进行 Exchange-PAINT 成像的示意图。三个蛋白质靶标分别使用 DNA 功能化抗体、Fab 片段或纳米抗体进行标记。Cy3B 成像链按链的类型依次成像，每轮成像之间进行洗涤步骤。（B）利用 SDC-OPR 显微镜以 4× 放大倍数对 U2OS 细胞进行三色 Exchange-PAINT 成像，显示微管（红色；使用 DNA 偶联的抗 α-微管蛋白抗体标记）、线粒体（绿色；靶向 TOM20 的 DNA-纳米抗体）和核孔复合体（蓝色；mEGFP 标记的 Nup96，结合抗 GFP 的 DNA-纳米抗体）。比例尺：5 µm。放大区域突出了 SDC-OPR 系统获得的增强分辨率，分别聚焦于（1）线粒体，（2）微管和（3）核孔蛋白（NUP）。比例尺 = 1 µm。本图经 Zaza 等人14修改。 请点击此处查看此图的放大版本。

细胞结构显微镜；显示不同放大倍数的示意图；1x、2.8x、4x；光谱分析。
图3：在 SDC-OPR 显微镜上对大视场进行 DNA-PAINT 成像。在多个放大倍数下获取的微管 DNA-PAINT 图像（抗α-微管蛋白标记）：（A）1× 放大倍数和 1 binning（视场为 211 × 211 µm²），（B）2.8× 放大倍数和 2 binning（视场为 76 × 76 µm²），（C）4× 放大倍数和 4 binning（视场为 53 × 53 µm²）。颜色表示定位精度，1x 放大倍数下为 0–16 nm，其他为 0–4 nm。（D）在 1×（红色）、2.8×（黄色）和 4×（绿色）放大倍数下，距视场中心不同距离（以 µm 为单位）处测得的定位精度。该图改编自 Zaza 等人14。请点击此处查看此图的放大版本。

Super-resolution microscopy images and graph showing optical sectioning for nanostructure analysis.
图4全细胞DNA-PAINT成像 (A) 左侧。 中国台湾 HeLa 细胞中微管的容积成像 通过 使用 SDC-OPR 在 4 倍放大倍数下获取的 DNA-PAINT 图像，显示从 z = 0 到 9 µm（步长 1 µm）的轴向切片。每个平面均显示 z 位置、定位精度和NeNA指标。比例尺：5 µm（xy). 右侧所有层面的定位精度与穿透深度的关系。B) 同一HeLa细胞微管网络的3D渲染图，该细胞如(A）。颜色代表穿透深度，范围为 0 到 9 µm。C) 每个穿透深度所示高亮小区域的放大图像A）。该图已根据 Zaza 等人的研究修改。14. 请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

超分辨荧光显微镜突破了衍射极限，显著提高了空间分辨率。然而，其在生物研究中的广泛应用仍面临持续挑战。特别是视场（FOV）、分辨率和穿透深度之间的权衡，使得难以同时优化这三个因素。通过结合单分子定位显微镜（SMLM）与光学光子重分配增强的转盘共聚焦显微镜（SDC-OPR）的优势，上述问题得到了解决。通过在标准SDC配置中集成微透镜阵列（由商用SDC-OPR系统实现），提高了光子收集效率，同时减小了有效针孔尺寸，从而显著提升了分辨率。与标准SDC相比，SDC-OPR系统在分辨能力方面表现出明显提升，在焦平面内成功区分了相距10 nm14的结构，而标准SDC仅能分辨大于20 nm的距离11。这种增强的分辨能力凸显了光子重分配在实现分子尺度分离方面的优势。具体而言，在焦平面（z = 0 µm）实现了低于2 nm的横向定位精度，在深度达9 µm时横向定位精度仍保持在10 nm以下，同时具备高度可调的视场，分别为53 × 53 µm²或76 × 76 µm²。即使在211 × 211 µm²的大视场下，系统仍实现了9.5 nm的平均面内定位精度。这些结果突显了该系统在整个细胞范围内进行高分辨率成像的能力。

针对所用不同抗体的偶联反应，必须严格遵循方案以确保抗体与DNA的比例达到最佳。 若该比例过高，可能会降低定位精度，并对定量测量（如qPAINT25中进行的测量）产生不利影响。因此，必须使用微量紫外-可见分光光度计验证该比例，确保DNA与抗体的最终比例为1:1。

获得高质量微管超分辨率图像的关键步骤是适当的固定。仅依赖高浓度多聚甲醛（PFA）的传统固定方法常常会破坏微管结构。相比之下，单独使用戊二醛（GA）或将其与PFA联合使用可显著改善结构的保存效果26,27。

为了获得最佳成像效果，必须使用高数值孔径（NA）物镜，以最大化单分子事件中的光子收集效率。在商用 SDC-OPR 系统中，激光功率被有意设置得低于用于 SMLM 的传统全内反射荧光（TIRF）显微镜，以尽量减少样品的光漂白。尽管 DNA-PAINT 可消除光漂白的顾虑，并理论上可采用更高的激光功率，但目前的商用系统仍存在限制，导致其曝光时间相较于 TIRF 照明更长。此外，由于 SDC-OPR 的照明方式为共聚焦，分子在曝光期间不会被持续激发。因此，与连续 TIRF 照明相比，需要更长的曝光时间；在本研究中，采用的曝光时间为 300 ms。然而，根据特定实验的分辨率需求，也可使用更短的积分时间（例如 150–200 ms），而分辨率损失极小28。

优化成像链的浓度是确保单分子信号保持良好分离，同时仍能产生足够定位点以实现精确重构的关键步骤。这一调整类似于标准的单分子定位显微镜（SMLM）成像过程，需精确控制事件密度与信号重叠之间的平衡。针对不同的靶标，应调整其最佳成像链浓度。例如，对于微管，建议初始成像链浓度低于1 nM，并根据需要进行调整。

在长时间采集过程中保持稳定的焦距至关重要，因为轴向（z）漂移无法在后期处理中校正。横向（xy）漂移可以被补偿 通过 RCC 或定位标记。在此设置中，显微镜的完美聚焦系统（PFS）可确保数小时成像过程中的焦点稳定性。

综上所述，将单分子定位显微镜（SMLM）与旋转盘共聚焦光学投影层析成像（SDC-OPR）相结合，为在完整细胞内部深处实现高分辨率成像提供了一个强大的平台，克服了传统成像技术在分辨率、成像深度和视场（FOV）之间的权衡限制。然而，要充分发挥该系统的潜力，必须严格控制实验条件，从抗体偶联与固定，到图像采集参数设置及数据处理，每一步都至关重要。从样品制备到漂移校正的每一个环节，均对获得可靠且高精度的数据起着关键作用。通过仔细优化实验方案，该方法为在复杂的生物样品中进行定量的纳米级成像提供了一种稳健且灵活的解决方案。本实验方案有望帮助科研界更广泛地采用单分子定位显微技术，并从那些使用传统全内反射（TIRF）或高倾斜照明（HILO）难以成像的样品层面获取超分辨图像。上述目标均可借助目前在全球各地显微成像平台普遍配备的商业化显微镜系统实现。

就其他及未来应用而言，该方法不仅适用于全细胞样品，也适用于成像深度更大的复杂组织样品，此前的研究已对此进行了验证。14与需要物理切片的方法不同，该技术能够对完整组织进行三维成像，保留其天然结构，并减少因物理切片引入的人工假象。使用较小的亲和探针（如纳米抗体）相较于全长抗体可进一步增强组织渗透性，从而实现对厚样本更均匀的标记。该方法为研究细胞空间组织及分子分布提供了可能 原位 保真度更高。除了这些应用外，该策略还可用于纳米结构和生物分子组装体的高通量筛选，从而实现对结构异质性与功能的系统性研究。此外，DNA-PAINT 的最新进展已开发出自猝灭成像探针，这类探针基于染料-猝灭剂或染料-染料相互作用29,30,31可有效降低背景信号、增强荧光强度并提高空间分辨率，从而实现更快的成像速度。将这些荧光探针整合到 SDC-OPR 框架中，有望进一步提升成像速度与分辨率。将这些技术进步与 SDC-OPR 系统的优势相结合，可拓展其在更复杂生物样本中的应用，使该平台成为在多种组织中精细解析细胞与分子结构的灵活工具。

披露

作者声明无任何利益冲突。

致谢

本研究由人类前沿科学计划组织（Human Frontier Science Program Organization, HFSP）资助，向 CZ 提供跨学科博士后奖学金（LT0025/2023-C），以及由工程与物理科学研究理事会向 M.T.（EP/R513143/1 和 EP/W524335/1）和 O.P.L.D（EP/R513143/1 和 EP/T513064/1）提供的资助。S.S. 还获得了英国皇家学会多萝西·霍奇金奖学金（DHF\R1\191019 和 DHF\R\251006）的支持。本工作还得到了陈-扎克伯格倡议基金（Chan Zuckerberg Initiative，项目编号 2023-321188）和英国生物技术和生物科学研究生理事会（BBSCR，项目编号 BB/Y513064/1）向 S.S. 提供的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
(±)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸Merck 238813-5GTrolox
3,4-二羟基苯甲酸 Merck 37580-25G-FPCA
60× Apo NA 1.49 物镜Nikon
7.0 KDA 离心脱盐柱（含尺寸排阻树脂） Fisher Scientific Ltd89882Zeba Spin Desalting Columns 用于步骤 2.4
Accutase - 酶解细胞解离液Promo CellC-41310
羊驼单域抗体 (1H1) 抗-GFP 偶联定制 DNA（sdAB-5’-TCCTCCTCCTCCT-3’）Massive PhotonicsCustom product果蝇用抗-GFP 纳米抗体
羊驼单域抗体 (1H1) 抗-GFP 偶联 DNAMassive PhotonicsMASSIVE-TAG-Q-FAST anti-GFP - F3NUP 用抗-GFP 纳米抗体
抗α-微管蛋白抗体 (YL1/2)Thermo Fisher ScientificMA1-80017
抗兔 IgG 抗体Massive PhotonicsMassive-sdAB-FAST 2-Plex, Secondary sdAB F2
抗 TCRζ 抗体 (6B10.2)BioLegend644102
牛血清白蛋白Merck A4503-10GBSA
15 mL 锥形离心管Fisher Scientific Ltd17705004
50 mL 锥形离心管VWR International734-0448
CSU-W1 SoRaNikonSDC-OPR 显微镜
含 Sephadex G-25 的脱盐离心柱（用于 DNA 纯化的尺寸排阻树脂） Fisher Scientific Ltd11743309品牌：Cytiva。步骤 2.5 使用的 G-25 柱
D-葡萄糖Merck G8270-1KG
DMEM 培养基Thermo Fisher Scientific11965092
无水 DMSOThermo Fisher ScientificD12345
DTT （二硫苏糖醇）Thermo Fisher Scientific15976082
EDTAThermo Fisher Scientific15575020
EGTAMarck324626
胎牛血清Thermo Fisher ScientificA5256701
戊二醛Serva2311402
甘油Merck G5516-500ML 
甘氨酸MP Biomedicals219482580
马来酰亚胺-PEG2-琥珀酰亚胺酯 Merck 746223-50MG
McCoy's 5A 培养基Fisher Scientific Ltd16600082
MES（2-(N-吗啉代)乙磺酸）MerckM3671-50G
甲醇Fisher Scientific Ltd32213-25L
MgCl2Fisher Scientific Ltd10418464
0.5 mL 微量离心管Fisher Scientific Ltd11508232
1.5 mL 微量离心管Eppendorf10509691 
微量紫外-可见分光光度计Thermo Fisher ScientificND-ONE-WNanodrop
NaCl2Sigma-AldrichS6546-1L 
90 nm 金纳米颗粒CytodiagnosticsG-90-100
Orca Fusion-BT cmos 相机Hamamatsu
青霉素-链霉素Thermo Fisher Scientific15070063P/S
磷酸盐缓冲液（1× 溶液）Fisher Scientific Ltd11530546PBS
Pierce 16% 甲醛（w/v），无甲醇Fisher Scientific Ltd11586711PFA
氯化钾 Merck  P9541-500G
原儿茶酸 3,4-双加氧酶  Merck P8279-25UN PCD
氢氧化钠 Fisher Scientific Ltd12963614
TOM20 抗体AbcamAb186735
Tris 缓冲液VWR InternationalA4577.1000
Triton X-100  VWR International1086031000
Tween-20Merck P9416-50ML
超滤离心滤膜装置，100 kDa 截留分子量Merck UFC510024制造商：Amicon Ultra
μ-Slide 8 孔高玻璃底培养皿IbidiIB-80807
μ-Slide VI 0.5 玻璃底培养皿IbidiIB-80607

参考文献

  1. Lelek, M., et al. Single-molecule localization microscopy. Nat Rev Methods Primers. 1 (1), 39(2021).
  2. Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).
  3. Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nat Methods. 5 (2), 159-161 (2008).
  4. Vignolini, T., Capitanio, M., Caldini, C., Gardini, L., Pavone, F. S., et al. Highly inclined light sheet allows volumetric super-resolution imaging of efflux pumps distribution in bacterial biofilms. Sci Rep. 14 (1), 12902(2024).
  5. Kim, J., et al. Oblique-plane single-molecule localization microscopy for tissues and small intact animals. Nat Methods. 16 (9), 853-857 (2019).
  6. Ghosh, A., et al. Decoding the molecular interplay of CD20 and therapeutic antibodies with fast volumetric nanoscopy. Science. 387 (6730), eadq4510(2025).
  7. Wäldchen, F., et al. Whole-Cell imaging of plasma membrane receptors by 3D lattice light-sheet d STORM. Nat Commun. 11 (1), 887(2020).
  8. Zagato, E., et al. Microfabricated devices for single objective single plane illumination microscopy (SoSPIM). Opt express. 25 (3), 1732-1745 (2017).
  9. Galland, R., et al. 3D high-and super-resolution imaging using single-objective SPIM. Nat Methods. 12 (7), 641-644 (2015).
  10. Pawley, J. Handbook of biological confocal microscopy. 236, Springer Science & Business Media. (2006).
  11. Schueder, F., et al. Multiplexed 3D super-resolution imaging of whole cells using spinning disk confocal microscopy and DNA-PAINT. Nat Commun. 8 (1), 2090(2017).
  12. Azuma, T., Kei, T. Super-resolution spinning-disk confocal microscopy using optical photon reassignment. Opt Express. 23 (11), 15003-15011 (2015).
  13. York, A. G., et al. Instant super-resolution imaging in live cells and embryos via analog image processing. Nat Methods. 10 (11), 1122-1126 (2013).
  14. Zaza, C., et al. Super-resolution imaging in whole cells and tissues via DNA-PAINT on a spinning disk confocal with optical photon reassignment. Nat Commun. 16 (1), 4991(2025).
  15. Jungmann, R., et al. Single-molecule kinetics and super-resolution microscopy by fluorescence imaging of transient binding on DNA origami. Nano Lett. 10 (11), 4756-4761 (2010).
  16. Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).
  17. Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super-resolution microscopy. Nat Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
  18. Jungmann, R., et al. Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT. Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).
  19. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  20. Ober, R. J., Ram, S., Ward, E. S. Localization accuracy in single-molecule microscopy. Biophys J. 86 (2), 1185-1200 (2004).
  21. Tetley, R., Vaughan, A., Zaza, C. NIS-Elements JOB for DNA-Paint Acquisition at Serial Z-Planes. , (2025).
  22. Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment. Histochem Cell Biol. 141, 629-638 (2014).
  23. Schlichthaerle, T., et al. Direct visualization of single nuclear pore complex proteins using genetically-encoded probes for DNA-PAINT. Angew Chem. 131 (37), 13138-13142 (2019).
  24. Stehr, F., Stein, J., Schueder, F., Schwille, P., Jungmann, R. Flat-top TIRF illumination boosts DNA-PAINT imaging and quantification. Nat Commun. 10 (1), 1268(2019).
  25. Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nat Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
  26. Whelan, D. R., Bell, T. D. M. Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters. Sci Rep. 5 (1), 7924(2015).
  27. Xie, Z., et al. Quantitative characterization of microtubule ultrastructure based on single-molecule localization microscopy. Cytoskeleton. , (2025).
  28. Steen, P. R., et al. The DNA-PAINT palette: A comprehensive performance analysis of fluorescent dyes. Nat Methods. 21 (9), 1755-1762 (2024).
  29. Kessler, L. F., et al. Self-quenched fluorophore-DNA labels for super-resolution fluorescence microscopy. J Phys Chem B. 128 (28), 6751-6759 (2024).
  30. Kessler, L. F., et al. Self-quenched fluorophore dimers for DNA-PAINT and STED Microscopy. Angew Chem Int Ed. 62 (39), e202307538(2023).
  31. Chung, K. K. H., et al. Fluorogenic DNA-PAINT for faster, low-background super-resolution imaging. Nat Methods. 19 (5), 554-559 (2022).

重印与许可

标签

DNA PAINT
全细胞超分辨率成像 通过 使用光学光子重分配的旋转盘共聚焦显微镜进行DNA-PAINT成像
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。