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方法文章

由病原体相关分子模式诱导的附睾炎小鼠模型

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DOI：

10.3791/69534

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2025年12月12日

 ,  ,  , 
1Department of Biophysics and Pharmacology, Institute of Biosciences of Botucatu, São Paulo State University, 2Department of Structural and Functional Biology, Institute of Biosciences of Botucatu, São Paulo State University, 3Department of Pharmacology, Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina

本文内容

摘要

本文描述了两种不同的手术注射模型，用于在小鼠附睾的起始段（间质注射）和附睾尾部（管内注射）诱导炎症刺激。这些方法可用于研究附睾不同区域的部位特异性反应。

摘要

附睾炎是门诊泌尿科临床中高度常见的疾病，也是男性不育的重要影响因素。细菌感染，包括性传播细菌和常见尿路致病菌，是附睾炎最常见的病因因素。然而，细菌性附睾炎的发病机制、自然病程及结局背后的病理生理机制仍不甚清楚。在此方面，啮齿类动物模型是研究附睾在受到各种炎症或感染刺激时所产生机制反应的有力工具。大鼠和小鼠的研究表明，来源于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的细菌源性病原相关分子模式（PAMPs），如脂多糖（LPS）和脂磷壁酸（LTA），可引发附睾的急性炎症反应。这些炎症反应的严重程度因受累附睾区域不同而异，并与精子参数不良相关。本文详细描述了两种不同的手术方法，通过将PAMPs注射至附睾头段的间质区或输精管朝向尾段附睾的管腔区，在小鼠体内诱导附睾炎，从而可分别研究附睾近端和远端区域的炎症反应。预期这些附睾炎实验模型将有助于未来深入理解附睾对入侵病原体反应的调控机制，为减轻附睾炎对男性生育力的不良影响提供新的治疗干预途径。

引言

附睾是一个黏膜性雄性生殖器官，由一条高度盘绕的单管构成，连接输出小管与输精管。附睾对于精子的成熟（获得精子运动能力和受精能力）、浓缩、运输、储存和保护至关重要，直至射精发生1,2。传统上，啮齿类动物的附睾分为四个解剖区域：起始段、头区、体区和尾区1（图1）。此外，附睾的每个区域还可进一步细分为多个区段，这些区段由间质结缔组织隔膜分隔，在小鼠附睾中可识别出共10个区段3（图1）。

由于免疫失调与男性不育之间存在关联，附睾免疫生物学已成为一个不断拓展的研究领域4。过去二十年的研究揭示，附睾中存在免疫系统的多种组分，例如常驻免疫细胞类型（如单核吞噬细胞和淋巴细胞），以及在多种非免疫和免疫细胞类型上表达的病原体识别受体［PRRs，例如Toll样受体（TLRs）和NOD样受体］，这些组分共同形成了具有区域特异性的动态附睾微环境5,6,7,8,9。这些附睾免疫组分在附睾的双重功能中发挥关键作用：一方面协调对具有免疫原性的精子产生免疫耐受，另一方面快速启动针对上行性尿道感染及其他有害刺激的免疫应答4,10。影响附睾内这种复杂免疫平衡的因素仍需进一步研究，因为这些因素可能损害附睾功能，从而对男性生育力产生负面影响。

在此背景下，附睾的炎症性疾病（统称为附睾炎）在各年龄段男性中均十分常见，是男性亚生育力和不育的重要病因学因素4,11,12。附睾炎是18至50岁男性中第五常见的男性泌尿系统诊断，仅在美国每年就有约60万例病例4,13。经输尿管上行感染泌尿生殖道病原体（如Escherichia coli）或性传播疾病（如Chlamydia trachomatis）是附睾炎最常见的病因4,14。大多数附睾炎患者出现尾部附睾疼痛，而头部区域受累较少，这突显了附睾对炎症刺激产生区域特异性反应能力的临床意义10。附睾炎可导致精液参数显著恶化（如精子浓度和活动力下降），并在疾病急性期伴有明显的白细胞精子症4,12,15。值得注意的是，尽管药物治疗成功且症状缓解，仍有相当一部分附睾炎患者持续存在少精子症或无精子症16,17。附睾炎对精子质量产生长期影响的机制目前仍不清楚。

人类急性附睾炎样本十分罕见，因为附睾活检存在禁忌，其风险在于穿刺可能导致病原体不受控制地扩散，从而引发败血症和器官损伤，以及因导管破裂导致精子泄漏至间质腔室4。因此，附睾炎的动物模型成为研究该疾病机制的相关工具，可用于评估炎症反应及其后果4,12。在这一领域，啮齿类动物（大鼠和小鼠）是研究附睾炎最常用的模式生物，适用于受控的实验环境4,12。目前已建立多种细菌性附睾炎的啮齿类动物模型，其差异主要体现在病原体类型（如尿路致病性 E. coli 和 C. trachomatis）、感染途径（如逆行性管腔注射和间质注射）、感染部位（如起始段和附睾尾）以及注射后的时程（如数小时至数天）4,12。

病原体相关分子模式（PAMPs）的应用是研究附睾炎的一种有价值工具，因为它能够通过激活特定的模式识别受体（如TLRs）和信号通路，探究由不同病原体（如细菌、病毒和真菌）相关的多种分子所触发的疾病病理生理机制。5,18,19,20,21例如，分别来源于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌细胞壁的病原相关分子模式（PAMP），如脂多糖（LPS；TLR4 激动剂）和脂磷壁酸（LTA；TLR2/TLR6 激动剂），已通过多种给药途径（包括静脉注射、腹腔注射或）用于诱导附睾炎 通过 直接注射至附睾区域10在这些条件下，LPS和LTA均已被证明可在大鼠和小鼠的附睾中诱导炎症反应，伴随特定区域和时间依赖性地调控一组独特的炎症介质并募集免疫细胞。19,20特别是，将PAMPs特异性地施用于小鼠附睾头部初始段的间质区，或输精管管腔内靠近尾部附睾的区域，最近已成为研究附睾对不同炎症刺激产生近端与远端反应的相关模型，从而为理解该器官不同区域的免疫微环境及其对疾病结局的贡献提供了研究框架4,18,19.

本文介绍了两种不同的实验方案，分别通过间质注射和逆行血管内注射途径，在小鼠附睾的不同区域（即起始段和附睾尾）诱导直接的炎性刺激。这两种方法相结合，可实现病原体相关分子模式（PAMPs）的区域性递送，并可在炎症过程中对附睾的相对区域进行评估。

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方案

所有动物实验均遵循美国国立卫生研究院（National Institute of Health, USA）《实验动物护理与使用指南》以及巴西国家实验动物使用控制委员会（CONCEA, Brazil）的相关规定。实验程序已获得巴西圣保罗州立大学生物科学研究所实验动物使用伦理委员会（CEUA-IBB/UNESP, Brazil）的批准（批准编号：6272050320；2269040625）。本研究使用成年雄性C57BL/6小鼠（90–120日龄）。本研究所用试剂与设备详见材料表。

1. 附睾起始段的间质注射

  1. 小鼠术前准备
    1. 使用氯胺酮/赛拉嗪（60/20 mg/kg，腹腔注射）诱导全身麻醉（遵循机构批准的方案）。麻醉后，将小鼠仰卧位放置于手术区域。
      注意：切口前，用力捏压脚趾以确认足底反射消失。可使用吸入性麻醉剂（如异氟烷）替代氯胺酮/赛拉嗪。
    2. 使用电动剃毛笔对小鼠腹部进行剃毛（图2A）。
    3. 用含0.25%（v/v）氯己定和酒精的无菌棉球对腹部进行消毒。
  2. 向附睾起始段间质腔注射
    1. 使用15号手术刀，在腹壁右侧轻轻做一条约4 mm的纵向切口（图2A）。
      注意：注意保护包皮腺。
    2. 用弯头钝端手术镊轻轻分离皮肤。在腹壁第一切口位置，使用15号手术刀在腹膜上轻轻做一条约4 mm的纵向切口。
    3. 小心提起附睾和睾丸，使其进入腹腔空间，同时推动右侧阴囊。
      注意：为便于后续操作，可使用头戴式放大镜或体视显微镜。
    4. 用弯头手术镊小心牵拉附睾白色脂肪组织（eWAT），以定位附睾起始段。利用eWAT在切口区域轻轻暴露起始段（图2A）。
    5. 将预先装好注射液的Hamilton注射器置于与起始段第1段大致呈90°角的位置。将针尖斜面朝下，小心插入间质腔（图2A 和 补充图1）。
      注意：避免刺破附睾管；切勿倾斜针头。
    6. 将弯头手术镊置于针头插入部位，轻轻夹住附睾囊膜和针头。缓慢下压注射器推杆，直至全部刺激溶液被推出（图2A）。
      注意：最大注射体积为10 µL。
    7. 保持弯头手术镊位置不变，小心拔出针头。约30秒后，移除手术弯镊。
    8. 利用eWAT将组织轻柔复位至腹腔内。
      注意：仅夹持eWAT，切勿夹压起始段。
    9. 定位腹膜，使用持针器和5/0手术缝线进行两针缝合（补充图1）。
      注意：检查腹膜切口是否完全闭合；必要时增加一针。
    10. 使用持针器和5/0手术缝线对皮肤切口进行两针缝合（图2A）。
    11. 重复步骤1.2.1–1.2.10，对左侧进行间质注射。
  3. 术后护理
    1. 术后观察小鼠，确保其恢复良好（检查动物行为、寒战、活动能力及其他毒性迹象）。在动物恢复期间保持其体温。术后小鼠在笼内活动可能减慢，通常在约12–24小时后恢复正常行为。

2. 尾侧附睾内血管注射

  1. 小鼠术前准备
    1. 通过腹腔注射给予氯胺酮/赛拉嗪（60/20 mg/kg）诱导全身麻醉。麻醉成功后，将小鼠仰卧位固定于手术区域。
      注意：切口前应牢固捏压足趾，确认无足底反射。可使用吸入麻醉剂（如异氟烷）替代氯胺酮/赛拉嗪。
    2. 用食指和拇指置于阴囊下方，检查睾丸和附睾的位置。必要时，轻轻按摩腹部两侧并向阴囊方向推移，使睾丸和附睾位于阴囊内。
    3. 使用电动修毛笔形剃刀对小鼠阴囊进行脱毛（图3A）。
    4. 用含0.25%（v/v）氯己定与酒精的无菌棉球对阴囊进行消毒。
  2. 向附睾尾方向逆行注射至输精管管腔
    注意：为便于后续操作，建议使用头戴式放大镜或体视显微镜。
    1. 用食指和拇指置于阴囊下方，轻柔牵拉阴囊皮肤使其固定，使用15号手术刀片在阴囊中线部位做约2 mm的垂直切口，切开皮肤、肉膜层及精索外筋膜（图3A）。
    2. 用食指将左侧睾丸和附睾轻柔推回腹腔，保留右侧睾丸和附睾于阴囊内。
    3. 用食指和拇指固定右侧睾丸和附睾，保持阴囊皮肤轻度张力，使用弯头钝端手术镊小心反复开合，作用于精索内筋膜，直至穿透精索内筋膜和鞘膜。
    4. 松开食指与拇指的压力，通过鞘膜上的开口，将弯头手术镊朝向阴囊基底部插入，轻柔牵拉远端附睾脂肪组织，以定位附睾尾。
    5. 定位输精管，并将直头手术镊置于输精管下方。在输精管上放置血管夹（鳄嘴夹），预留足够空间以便将直头手术镊置于附睾尾与血管夹之间（必要时限制直头手术镊的张开程度，避免损伤输精管）（图3A）。
    6. 将预装注射液的Hamilton注射器以约10–15°角平行于输精管方向定位，针尖斜面朝上插入（图3A 及 补充图1）。
    7. 轻捏直头手术镊以松解输精管，然后缓慢下压注射器推杆，直至完全注入刺激溶液（图3A）。
      注意：最大注射体积为10 µL。
    8. 移除直头手术镊。在针头插入部位用弯头手术镊夹持固定，轻柔夹闭并小心拔出针头。
    9. 约30秒后，移除弯头手术镊和血管夹。轻柔将输精管复位至阴囊内。
    10. 定位鞘膜开口处，使用持针器和5/0外科缝线进行单针缝合（补充 图1）。
      注意：检查鞘膜切口是否闭合；必要时追加一针缝合。
    11. 用食指将右侧睾丸和附睾轻柔推回腹腔，将左侧睾丸和附睾移至阴囊内。
    12. 重复步骤2.2.3–2.2.10，在左侧进行管腔内注射。
    13. 使用持针器和5/0外科缝线进行两针缝合，关闭皮肤切口（图3A）。
  3. 术后护理
    1. 术后观察小鼠恢复情况，确保其行为正常（检查活动能力、寒战、运动能力及其他毒性反应迹象）。术后保持动物体温，直至完全恢复。预计小鼠术后在笼内活动减慢，约12–24小时后恢复正常行为。

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结果

本文描述了两种不同的小鼠炎症刺激手术注射模型，分别针对附睾近端（间质注射）和附睾尾部（管内注射）。前者在附睾近端诱发炎症反应，而后者在附睾远端诱发炎症反应。

通过腹部切口进行间质注射，利用小鼠睾丸和附睾经由腹股沟管从阴囊移至腹腔的可能性。在仔细暴露切口区域的起始段后，将注射液注入附睾第一段（第1段）的间质间隙（图2A 和 补充图1）。使用伊文思蓝染料显示，注射液在注射后30分钟内主要局限于小鼠附睾第1段，证实了间质隔膜在限制注射物质扩散中的屏障作用22,23。然而，在注射后30分钟，染料已扩散至起始段和附睾头邻近的其他节段（图2B 和 补充图1）。

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讨论

本文介绍了两种不同的小鼠局部附睾炎诱导手术注射方法。这些方法用于建立特异性靶向附睾初段的附睾炎实验模型。 通过 间质注射或附睾尾 通过 逆行血管内注射。该详细且可视化的操作指南提高了这些实验方案的清晰度与可及性，旨在增强这些方法的可重复性。

附睾管的直径从近端到远端显著增加，附睾管及其结缔组织隔共同构成一道物理屏障，可抵御细菌的上行感染22,23。多项研究一致表明，逆行性管腔内细菌感染或其他炎性刺激物（如PAMPs）在附睾不同区域引发的反应存在差异：尾部附睾表现出强烈的免疫细胞募集（例如单核吞噬细胞亚群和白细胞）以及炎症介质（如细胞因子和趋化因子）的调节，而近端区域（包括起始段和头部附睾）的反应则较轻微7,20,24,

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

作者感谢马里利亚医学院及圣保罗州立大学生物科学研究所（IBB/UNESP）细胞结构与功能系形态学部门的 Maria Angélica Spadella 和 Rosa Maria dos Santos Sabatini 在组织病理学评估方面的技术支持；感谢圣保罗州立大学生物科学研究所（IBB/UNESP）生物物理学与药理学部门的 Helio Kushima 和 Paulo Mioni 提供的技术协助；感谢圣保罗州立大学生物科学研究所（IBB/UNESP）生物物理学与药理学部门的 Natália Calixto Miranda Santos 和 Beatriz Rezende Santos 在拍摄中的帮助。本研究由圣保罗研究基金会（FAPESP，#2021/04746-3 和 #2021/06718-7）资助；部分由高等教育人员改进协调办公室（CAPES，#88887.657630/2021-00）资助；以及由国家科学技术发展委员会（CNPQ，#303616/2022-9；311179/2016-9）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
带角度的钝头手术镊 Bontherxtycga1012
带角度手术镊Bontherpwghvv1012
蓝色伊文思溶液Sigma-AldrichE2129
bulldog 镊子夹 Bontherjtkpqs1012
氯己定RioquímicaRiohex 0.25%
弯头手术镊Bonther506e6e1012
电动修边笔（笔形）--
Hamilton 注射器Hamilton80400
头戴式放大镜 OptiVISOR-
氯胺酮Venco Animal HealthKetalex
LPS （来自大肠杆菌 E. coli 055:B55）InvivogenTlrl-pb5lps
脂磷壁酸（LTA，来自金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus）InvivogenTlrl-pslta
持针器Bonther8pihbf1012
5/0 规格手术缝线Shalon Medicaln550cti20
无菌生理盐水--
直头手术镊Bontherejaiuz1012
赛拉嗪SyntecXilazin

参考文献

  1. Hinton, B., Robaire, B. The Epididymis. Knobil and Neill's Physiology of Reproduction Volume 1. 1, 691-771 (2015).
  2. Avellar, M. C. W., Hinton, B. T. Epididymis. Encyclopedia of Endocrine Diseases. , 807-813 (2019).
  3. Johnston, D. S., et al. The mouse epididymal transcriptome: Transcriptional profiling of segmental gene expression in the epididymis. Biol Reprod. 73 (3), 404-413 (2005).
  4. Fijak, M., et al. Infectious, inflammatory and 'Autoimmune' male factor infertility: How do rodent models inform clinical practice. Hum Reprod Update. 24 (4), 416-441 (2018).
  5. Rodrigues, A., et al. Activation of toll-like receptor 4 (TLR4) by in vivo and in vitro exposure of rat epididymis to lipopolysaccharide from Escherichia coli. Biol Reprod. 79 (6), 1135-1147 (2008).
  6. Palladino, M. A., Johnson, T. A., Gupta, R., Chapman, J. L., Ojha, P. Members of the toll-like receptor family of innate immunity pattern-recognition receptors are abundant in the male rat reproductive tract. Biol Reprod. 76 (6), 958-964 (2007).
  7. Pleuger, C., et al. The regional distribution of resident immune cells shapes distinct immunological environments along the murine epididymis. eLife. 11, e82193(2022).
  8. Battistone, M. A., et al. Region-specific transcriptomic and functional signatures of mononuclear phagocytes in the epididymis. Mol Hum Reprod. 26 (1), 14-29 (2020).
  9. Mendelsohn, A. C., et al. From initial segment to cauda: A regional characterization of mouse epididymal CD11c+ mononuclear phagocytes based on immune phenotype and function. Am J Physiol Cell Physiol. 319 (6), C997-C1010 (2020).
  10. Pleuger, C., Silva, E. J. R., Pilatz, A., Bhushan, S., Meinhardt, A. Differential immune response to infection and acute inflammation along the epididymis. Front Immunol. 11, 3125(2020).
  11. Avellar, M. C. W., Ribeiro, C. M., Dias-da-Silva, M. R., Silva, E. J. R. In search of new paradigms for epididymal health and disease: Innate immunity, inflammatory mediators, and steroid hormones. Andrology. 7 (5), 690-702 (2019).
  12. Michel, V., Pilatz, A., Hedger, M. P., Meinhardt, A. Epididymitis: Revelations at the convergence of clinical and basic sciences. Asian J Androl. 17 (5), 756-763 (2015).
  13. Nicholson, A., et al. Management of epididymo-orchitis in primary care: Results from a large UK primary care database. Br J Gen Pract. 60 (579), e407-e422 (2010).
  14. Pilatz, A., et al. Acute epididymitis revisited: Impact of molecular diagnostics on etiology and contemporary guideline recommendations. Eur Urol. 68 (3), 428-435 (2015).
  15. Lang, T., et al. Structural and functional integrity of spermatozoa is compromised as a consequence of acute uropathogenic E. coli-associated epididymitis. Biol Reprod. 89 (59), 1-10 (2013).
  16. Rusz, A., et al. Influence of urogenital infections and inflammation on semen quality and male fertility. World J Urol. 30 (1), 23-30 (2012).
  17. Schuppe, H. -C., et al. Urogenital infection as a risk factor for male infertility. Dtsch Arztebl Int. 114 (19), 339-346 (2017).
  18. Andrade, A. D., et al. Lipopolysaccharide-induced epididymitis modifies the transcriptional profile of Wfdc genes in mice. Biol Reprod. 104 (1), 144-158 (2021).
  19. Andrade, A. D., et al. Regional modulation of toll-like receptor signaling pathway genes in acute epididymitis in mice. Andrology. 12 (5), 1024-1037 (2024).
  20. Silva, E. J. R., et al. Lipopolysaccharide and lipotheicoic acid differentially modulate epididymal cytokine and chemokine profiles and sperm parameters in experimental acute epididymitis. Sci Rep. 8 (1), 103(2018).
  21. Cheng, L., et al. Toll-Like receptors 4 and 5 cooperatively initiate the innate immune responses to uropathogenic Escherichia coli infection in mouse epididymal epithelial cells. Biol Reprod. 94 (3), 58(2016).
  22. Stammler, A., et al. Epididymitis: Ascending infection restricted by segmental boundaries. Hum Reprod. 30 (7), 1557-1565 (2015).
  23. Turner, T. T., Bomgardner, D., Jacobs, J. P., Nguyen, Q. A. Association of segmentation of the epididymal interstitium with segmented tubule function in rats and mice. Reproduction. 125 (6), 871-878 (2003).
  24. Barrachina, F., et al. CX3CR1 deficiency leads to impairment of immune surveillance in the epididymis. Cell Mol Life Sci. 80 (1), 15(2022).
  25. Klein, B., et al. Differential tissue-specific damage caused by bacterial epididymo-orchitis in the mouse. Mol Hum Reprod. 26 (4), 215-227 (2020).

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