本文描述了两种不同的手术注射模型，用于在小鼠附睾的起始段（间质注射）和附睾尾部（管内注射）诱导炎症刺激。这些方法可用于研究附睾不同区域的部位特异性反应。
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本文内容
摘要
摘要
附睾炎是门诊泌尿科临床中高度常见的疾病，也是男性不育的重要影响因素。细菌感染，包括性传播细菌和常见尿路致病菌，是附睾炎最常见的病因因素。然而，细菌性附睾炎的发病机制、自然病程及结局背后的病理生理机制仍不甚清楚。在此方面，啮齿类动物模型是研究附睾在受到各种炎症或感染刺激时所产生机制反应的有力工具。大鼠和小鼠的研究表明，来源于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的细菌源性病原相关分子模式（PAMPs），如脂多糖（LPS）和脂磷壁酸（LTA），可引发附睾的急性炎症反应。这些炎症反应的严重程度因受累附睾区域不同而异，并与精子参数不良相关。本文详细描述了两种不同的手术方法，通过将PAMPs注射至附睾头段的间质区或输精管朝向尾段附睾的管腔区，在小鼠体内诱导附睾炎，从而可分别研究附睾近端和远端区域的炎症反应。预期这些附睾炎实验模型将有助于未来深入理解附睾对入侵病原体反应的调控机制，为减轻附睾炎对男性生育力的不良影响提供新的治疗干预途径。
引言
附睾是一个黏膜性雄性生殖器官，由一条高度盘绕的单管构成，连接输出小管与输精管。附睾对于精子的成熟（获得精子运动能力和受精能力）、浓缩、运输、储存和保护至关重要，直至射精发生1,2。传统上，啮齿类动物的附睾分为四个解剖区域：起始段、头区、体区和尾区1（图1）。此外，附睾的每个区域还可进一步细分为多个区段，这些区段由间质结缔组织隔膜分隔，在小鼠附睾中可识别出共10个区段3（图1）。
由于免疫失调与男性不育之间存在关联，附睾免疫生物学已成为一个不断拓展的研究领域4。过去二十年的研究揭示，附睾中存在免疫系统的多种组分，例如常驻免疫细胞类型（如单核吞噬细胞和淋巴细胞），以及在多种非免疫和免疫细胞类型上表达的病原体识别受体［PRRs，例如Toll样受体（TLRs）和NOD样受体］，这些组分共同形成了具有区域特异性的动态附睾微环境5,6,7<....
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方案
所有动物实验均遵循美国国立卫生研究院（National Institute of Health, USA）《实验动物护理与使用指南》以及巴西国家实验动物使用控制委员会（CONCEA, Brazil）的相关规定。实验程序已获得巴西圣保罗州立大学生物科学研究所实验动物使用伦理委员会（CEUA-IBB/UNESP, Brazil）的批准（批准编号：6272050320；2269040625）。本研究使用成年雄性C57BL/6小鼠（90–120日龄）。本研究所用试剂与设备详见材料表。
1. 附睾起始段的间质注射
- 小鼠术前准备
- 使用氯胺酮/赛拉嗪（60/20 mg/kg，腹腔注射）诱导全身麻醉（遵循机构批准的方案）。麻醉后，将小鼠仰卧位放置于手术区域。
注意：切口前，用力捏压脚趾以确认足底反射消失。可使用吸入性麻醉剂（如异氟烷）替代氯胺酮/赛拉嗪。 - 使用电动剃毛笔对小鼠腹部进行剃毛（图2A）。
- 用含0.25%（v/v）氯己定和酒精的无菌棉球对腹部进行消毒。
- 使用氯胺酮/赛拉嗪（60/20 mg/kg，腹腔注射）诱导全身麻醉（遵循机构批准的方案）。麻醉后，将小鼠仰卧位放置于手术区域。
- 向附睾起始段间质腔注射
- 使用15号手术刀，在腹壁右侧轻轻做一条约4 mm的纵向切口（图2A）。
注意：注意保护包皮腺。<....
- 使用15号手术刀，在腹壁右侧轻轻做一条约4 mm的纵向切口（图2A）。
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结果
本文描述了两种不同的小鼠炎症刺激手术注射模型，分别针对附睾近端（间质注射）和附睾尾部（管内注射）。前者在附睾近端诱发炎症反应，而后者在附睾远端诱发炎症反应。
通过腹部切口进行间质注射，利用小鼠睾丸和附睾经由腹股沟管从阴囊移至腹腔的可能性。在仔细暴露切口区域的起始段后，将注射液注入附睾第一段（第1段）的间质间隙（图2A 和 补充图1）。使用伊文思蓝染料显示，注射液在注射后30分钟内主要局限于小鼠附睾第1段，证实了间质隔膜在限制注射物质扩散中的屏障作用22,23。然而，在注射后30分钟，染料已扩散至起始段和附睾头邻近的其他节段（图2B 和 补充图1）。
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讨论
本文介绍了两种不同的小鼠局部附睾炎诱导手术注射方法。这些方法用于建立特异性靶向附睾初段的附睾炎实验模型。 通过 间质注射或附睾尾 通过 逆行血管内注射。该详细且可视化的操作指南提高了这些实验方案的清晰度与可及性，旨在增强这些方法的可重复性。
附睾管的直径从近端到远端显著增加，附睾管及其结缔组织隔共同构成一道物理屏障，可抵御细菌的上行感染22,23。多项研究一致表明，逆行性管腔内细菌感染或其他炎性刺激物（如PAMPs）在附睾不同区域引发的反应存在差异：尾部附睾表现出强烈的免疫细胞募集（例如单核吞噬细胞亚群和白细胞）以及炎症介质（如细胞因子和趋化因子）的调节，而近端区域（包括起始段和头部附睾）的反应则较轻微7,20,24,
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
作者感谢马里利亚医学院及圣保罗州立大学生物科学研究所（IBB/UNESP）细胞结构与功能系形态学部门的 Maria Angélica Spadella 和 Rosa Maria dos Santos Sabatini 在组织病理学评估方面的技术支持；感谢圣保罗州立大学生物科学研究所（IBB/UNESP）生物物理学与药理学部门的 Helio Kushima 和 Paulo Mioni 提供的技术协助；感谢圣保罗州立大学生物科学研究所（IBB/UNESP）生物物理学与药理学部门的 Natália Calixto Miranda Santos 和 Beatriz Rezende Santos 在拍摄中的帮助。本研究由圣保罗研究基金会（FAPESP，#2021/04746-3 和 #2021/06718-7）资助；部分由高等教育人员改进协调办公室（CAPES，#88887.657630/2021-00）资助；以及由国家科学技术发展委员会（CNPQ，#303616/2022-9；311179/2016-9）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 带角度的钝头手术镊 | Bonther | xtycga1012 | |
| 带角度手术镊 | Bonther | pwghvv1012 | |
| 蓝色伊文思溶液 | Sigma-Aldrich | E2129 | |
| bulldog 镊子夹 | Bonther | jtkpqs1012 | |
| 氯己定 | Rioquímica | Riohex 0.25% | |
| 弯头手术镊 | Bonther | 506e6e1012 | |
| 电动修边笔（笔形） | - | - | |
| Hamilton 注射器 | Hamilton | 80400 | |
| 头戴式放大镜 | OptiVISOR | - | |
| 氯胺酮 | Venco Animal Health | Ketalex | |
| LPS （来自大肠杆菌 E. coli 055:B55） | Invivogen | Tlrl-pb5lps | |
| 脂磷壁酸（LTA，来自金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus） | Invivogen | Tlrl-pslta | |
| 持针器 | Bonther | 8pihbf1012 | |
| 5/0 规格手术缝线 | Shalon Medical | n550cti20 | |
| 无菌生理盐水 | - | - | |
| 直头手术镊 | Bonther | ejaiuz1012 | |
| 赛拉嗪 | Syntec | Xilazin |
参考文献
- Hinton, B., Robaire, B. The Epididymis. Knobil and Neill's Physiology of Reproduction Volume 1. 1, 691-771 (2015).
- Avellar, M. C. W., Hinton, B. T. Epididymis. Encyclopedia of Endocrine Diseases. , 807-813 (2019).
- Johnston, D. S., et al.
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重印与许可
