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方法文章

一种方法的开发与标准化 离体 采用液相色谱-串联质谱法对急性淋巴细胞白血病原代细胞内长春新碱进行微量定量分析的方法

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DOI：

10.3791/69535

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2026年1月23日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Leukemia Biology Laboratory, Boldrini Children's Center, 2Mass Spectrometry Laboratory, Boldrini Children's Center, 3Boldrini Children's Center

本文内容

摘要

本方案旨在建立并优化一种液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS），用于相对定量分析长春新碱在原代儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞中的累积量。

摘要

在原代儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞中定量细胞内长春新碱（VCR）对于理解样本特异性的药物摄取差异，以及支持利用稀缺患者材料开展的实验研究至关重要。本文介绍了一种经过专门优化的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）微量分析方法，适用于通过患者来源异种移植模型（PDX）获得的原代ALL细胞，解决了细胞数量有限、细胞体积小以及多次洗涤步骤后需实现可重复回收等关键挑战。时间进程实验（1至5小时）表明，3小时孵育期可获得最高且最稳定的细胞内VCR水平，且在重复实验中变异性较低。方法优化还确定，每组使用2.5 × 106 个细胞相较于1 × 106 个细胞具有更优的分析稳健性，后者在重复实验中表现出更大的数据离散性。其他关键优化措施包括使用冷甲醇以提高蛋白质沉淀效率，以及引入内标以监测并最小化操作过程中的变异。该方法可在相关浓度范围内实现对细胞内VCR的高灵敏度和精确量化，但在3小时孵育后，最低测试剂量（0.01 µM）无法被定量。总体而言，该微量分析方法为在原代ALL样本中测定细胞内VCR提供了一种实用、可重复且可扩展的技术路径。其设计支持开展比较分析、体外（ex vivo）模型的验证，以及未来将细胞内药物定量整合到更广泛药理学评估中的方法学应用。

引言

急性淋巴细胞白血病（ALL）约占所有儿童癌症的25%，仍是儿童中最常见的恶性肿瘤1,2。尽管治疗手段的进步已显著提高了生存率，目前超过90%，但ALL的生物学复杂性仍在推动人们开发更精确的工具，以在细胞水平上更好地表征该疾病3。

长春碱类药物，尤其是长春新碱（VCR），是急性淋巴细胞白血病（ALL）治疗方案中的关键组分4。由于VCR在细胞内发挥其细胞毒作用，了解其在白血病细胞中的摄取和蓄积情况，对于涉及药物反应、药效动力学以及离体（ex vivo）系统中细胞行为的研究至关重要。然而，目前大多数用于评估细胞内药物浓度的方法依赖于间接测量或半定量技术，限制了实验的可重复性和灵敏度5,6,7。

与此同时，许多研究仍然在很大程度上依赖白血病细胞系，而这些细胞系缺乏患者来源的原代细胞所具有的生物学异质性和临床相关性。原代样本常常带来诸多挑战，例如细胞数量有限、样本质量参差不齐，以及需要采用高灵敏度的分析技术来检测低丰度的细胞内化合物8。

液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）具有准确定量化疗药物所需的特异性和灵敏度，但目前仍缺乏在原代白血病细胞中直接测定细胞内VCR的标准化方案。建立适用于有限患者样本的可靠微量检测方法，可能有助于多种应用，包括药理学谱型分析、药物-细胞相互作用评估，以及不同疾病亚型或治疗条件间的比较研究。

在此方案中，我们描述了一种微量化方法的建立与优化过程 离体 使用LC-MS/MS定量原代白血病细胞内VCR含量。为获得足量样本用于方法开发，将患者样本移植至免疫缺陷型NSG小鼠以建立PDX模型 模型9。之后 体内 扩增后，分离并冻存人白血病细胞10随后，细胞被解冻，与VCR共同孵育，洗涤、裂解，并通过LC-MS/MS分析以测定细胞内药物浓度。

该方法具有多项优势：所需细胞数量少（250万个），灵敏度高、速度快，且适用于临床相关的原代样本。由于该方法可直接测量细胞内药物含量，因此为研究血液系统恶性肿瘤中药物摄取、细胞对化疗药物的反应或其他药理学问题的研究人员提供了一种可靠的定量工具。

总体而言，本方案拓展了可用于研究儿童急性淋巴细胞白血病的分析工具，且可轻松适用于其他药物或样本类型，有助于未来对白血病生物学、药物行为及精准药理学的深入研究。

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方案

本研究中使用的白血病样本来自巴西博尔德里尼儿童中心（Centro Infantil Boldrini）接受治疗的患者所留存的生物样本库冻存管，患者通过签署知情同意书同意其细胞用于本研究。该项目已获得机构伦理委员会批准（CAAE 34601120.7.0000.5376）。在动物体内建立患者来源异种移植模型（PDX）的实验方案均遵循博尔德里尼儿童中心动物伦理使用委员会（Comissão de Ética no Uso de Animais，CEUA/Boldrini 0011-2020）的规定和伦理准则进行。

1. 样品制备与药物孵育（第1天）

  1. 储备液和工作液的配制
    1. 称取2.5 mg硫酸长春新碱（分子量：923 g/mol），加入2.0 mL二甲基亚砜（DMSO）于2.0 mL微量离心管中，配制成1.354 mM的储备液。涡旋振荡至完全溶解。
      ​注意：DMSO具有刺激性；操作时应佩戴手套，并在化学通风橱中进行。
    2. 取147.71 µL VCR储备液与1,852.28 µL DMSO混合于2.0 mL微量离心管中，配制成100 µM的工作液。充分涡旋混匀。
    3. 将工作液分装至四个0.6 mL微量离心管中，每管500 µL，于-20 °C保存，可保存数月。避免反复冻融超过三次。
    4. 在2.0 mL微量离心管中，将181.81 µL浓度为1.1 mM的长春碱储备液（硫酸长春碱，1 mg/mL，分子量：909.07 g/mol）与1,818.19 µL无菌超纯水混合，配制成100 µM的长春碱（VINB）工作液。涡旋至均匀。
    5. 将VINB工作液按照与VCR相同的方法进行分装。
    6. 在50 mL离心管中，将49.95 mL甲醇与50 µL VINB工作液混合，配制成含0.1 µM VINB的甲醇溶液。涡旋至均匀，于-20 °C保存，最多可保存3个月。
      注意：甲醇具有毒性和易燃性；应在通风橱中佩戴适当的个人防护装备进行操作。
    7. 在50 mL离心管中，将49.95 mL超纯水与50 µL甲酸混合，配制成含0.1%甲酸的水溶液。充分涡旋混匀，室温（RT）保存。
      注意：甲酸具有腐蚀性；操作时应佩戴手套和眼部防护装备。
  2. 原代细胞的解冻与洗涤
    1. 将冻存的细胞样品置于盛有15 mL 37 °C蒸馏水的烧杯中，轻轻摇动直至完全解冻。
      ​注：有关细胞采集与冻存方案的详细信息可参见先前发表的文献9,10。
    2. 使用无菌一次性巴斯德吸管将冻存管中的内容物转移至含有10–15 mL无菌1×PBS的50 mL锥形离心管中。在室温下以300 × g离心5分钟。
    3. 倒置离心管，弃去上清液。
    4. 用一次性巴斯德吸管将沉淀重悬于10 mL AIM V培养基中。使用自动细胞计数仪计数活细胞并测定平均细胞大小。
      注：建议使用活率相对于总细胞数不低于80%的细胞进行实验。
    5. 根据测得的细胞浓度，通过简单比例计算获得2.5 × 106 个活细胞所需的体积。例如，若细胞浓度为5 × 106 个/mL，则所需体积为0.5 mL。
      ​注：为确保数据可重复性，每种处理应设置三个重复。保存自动细胞计数仪提供的细胞平均尺寸数据，用于后续细胞体积的计算。
  3. 药物处理实验设置
    1. 计算为达到2.0 mL总体积中终浓度为1 µM所需的VCR工作液体积。加样前应先涡旋混匀储备液。
    2. 在2.0 mL微量离心管中依次加入AIM V培养基、2.5 × 106 个细胞，最后加入VCR溶液。短暂涡旋混匀后轻甩（5秒），使管盖内壁的液体沉至管底。
    3. 将开口的离心管置于37 °C、5% CO2 条件下孵育3小时。
    4. 孵育结束后盖紧管盖，在室温下以300 × g离心5分钟。
    5. 小心使用移液器吸弃上清液，然后向管中加入1 mL室温PBS。
    6. 重复上述离心（300 × g，5分钟，室温）、弃上清及PBS洗涤步骤两次，共完成三次洗涤。
    7. 使用移液器小心吸除全部上清液，将沉淀重悬于100 µL PBS中，并涡旋至沉淀完全重悬。
    8. 直接向样品中加入400 µL预冷的含0.1 µM长春碱的甲醇溶液（-20 °C），避免液体接触管壁。
    9. 将样品于-80 °C过夜保存。
      ​注：样品可在-80 °C保存数周（安全暂停点）。

2. LC-MS/MS 样品处理（第2天）

  1. 样品提取
    1. 在从 -80 °C 冰箱中取出样品前，将离心机预冷至 4 °C。
    2. 从冰箱中取出样品后，立即在 4 °C 条件下以 13,000 × g 离心 20 分钟。
    3. 将 300 µL 上清液转移至 1.5 mL 微量离心管中。
    4. 使用真空浓缩仪在 40–45 °C 下完全干燥样品，持续 1 小时 40 分钟。
      注意：干燥后的沉淀物可在 -20 °C 下保存数周（安全暂停点）。
    5. 将每个沉淀物重悬于 400 µL 水 + 0.1% 甲酸（预先配制）中。轻轻涡旋振荡，直至沉淀完全溶解。
    6. 再次在 4 °C 条件下以 13,000 × g 离心 20 分钟。
    7. 将 300 µL 上清液转移至 2.0 mL 螺口小瓶中，用于 LC-MS/MS 分析。

3. 液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）设置与数据采集

  1. 流动相制备与色谱柱平衡
    1. 通过将超纯水与 0.1% 甲酸混合，制备溶剂 A。
    2. 通过将乙腈与 0.1% 甲酸混合，制备溶剂 B。
      注意：乙腈具有毒性和易燃性；应在化学通风橱中操作。
    3. 将每种溶剂在超声波水浴中超声处理 5 分钟。将溶剂瓶连接至泵模块，并以高流速冲洗系统以去除污染物。
    4. 安装反相 BEH C18 色谱柱（1.7 µm，2.1 mm × 50 mm）。
      注：本研究采用 Acquity H-Class 色谱系统，耦合 Xevo TQS-Micro 三重四极杆质谱仪进行分析。
    5. 使用先前配制的溶剂 A 和溶剂 B 组成二元梯度。
    6. 在前 2 分钟内，将色谱梯度从 5% 溶剂 B 升至 95% 溶剂 B，随后用 2 分钟 100% 溶剂 A 进行色谱柱清洗和重新平衡。
    7. 在整个 4 分钟运行过程中，设置流速为 0.2 mL/min。保持色谱柱温度为 40 °C，并进样每个样品 10 µL。
  2. LC-MS/MS 方法设置
    1. 打开 LC-MS/MS 软件。点击 文件 > 新建 > 质谱方法，以创建新方法。
    2. 进入 功能 选项卡，将 功能类型 设置为多反应监测（MRM）。在 表 1 中输入 VCR 和 VINB（内标）的离子跃迁及参数。
    3. 将 采集时间 设置为 4 分钟。点击 应用 保存。
      注：采集时间不得超过 4 分钟，以确保进样之间色谱柱的重新平衡。
    4. 在 进样方法 > 编辑液相方法 下配置 UHPLC 参数，并保存为 .mth 文件（表 2）。
    5. 根据 表 3 在 调谐 选项卡下设置离子源参数。保存为 .tun 文件。
    6. 保存完整方法：文件 > 另存为，并 导出为 .mth 文件。
  3. 创建样品列表并开始运行
    1. 在软件主界面中，打开 样品列表，创建包含样品名称、进样体积、进样瓶位置及所用方法的列表。
    2. 在自动进样器托盘中放置一个装有超纯水的进样瓶，并将其标记为空白样。在每组三重平行进样之间运行空白样，以避免交叉污染。
      注：开始运行前，确保色谱柱压力（ΔP）稳定且低于 10 psi。
    3. 在 样品列表 中选择所需行，点击 运行 > 确定，开始数据采集。

4. 数据分析

  1. 数据可视化与导出
    1. 运行完成后，通过选择一个样品并点击顶部菜单栏中的色谱图来查看色谱图。
    2. 在主屏幕上，点击TargetLynx，选择刚刚运行的文件，然后点击处理 > 选择长春新碱方法 > 确定，以生成输出表格。
    3. 点击报告 > 导出表格，并将处理后的数据保存为 .csv 或 .xlsx 文件。
      注意：需导出分析物和内标物的原始峰面积。
  2. 数据整理与比值计算
    1. 打开导出的文件，并创建以下列：
      1. 样品：添加样品或小瓶名称。
      2. 运行：标明该数值对应的重复实验编号。
      3. 长春新碱峰面积：输入长春新碱峰的峰面积。
      4. 长春碱峰面积：输入长春碱峰的峰面积。
      5. 长春新碱/长春碱比值：将每个长春新碱的峰面积除以其对应的长春碱峰面积进行归一化。
    2. 为每组三个重复实验的长春新碱峰面积、长春碱峰面积以及长春新碱/长春碱比值添加标准差列。
      ​注意：使用内标物进行归一化可校正提取或进样体积的差异。
  3. 结果绘图
    1. 打开首选的绘图软件，并选择分组表格格式。
    2. 选择输入或导入数据到新表格中，在选项下选择输入3个并列子列中的重复值。
    3. 仅绘制每个样品的归一化长春新碱/长春碱比值，不包含原始峰面积值。

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结果

使用VCR和VINB孵育的急性淋巴细胞白血病原代PDX细胞进行胞内蓄积实验后获得的代表性色谱结果如图1所示。每种条件下使用2.5 × 106个细胞制备样品。在所述色谱条件下，VCR的保留时间稳定为2.85分钟，基质效应极小，峰形对称且分离良好。这些图谱展示了当本方案正确执行时，VCR和VINB预期的色谱行为。

在将本方案应用于原代白血病细胞之前，已进行了初步实验以确定该方法的线性范围、检测限（LOD）、最佳细胞数量和孵育时间。这些步骤未在本方案中详细描述，但作为方法学验证的一部分，以下展示了标准曲线的代表性结果。

为评估该方法的灵敏度和线性关系，分别在两种实验条件下构建了VCR的校准曲线。在AIM V培养基中，浓度范围为0.001 µM至10 µM时，经log10转换后表现出优异的线性关系（r² = 0.9986）。当向培养基中加入2 × 106个RS4;11细胞后，线性范围为0.01至1 µM，同样显...

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讨论

准确评估原代白血病细胞内的药物浓度对于理解细胞水平的药物代谢过程，以及开发可补充分子谱分析的功能性检测方法至关重要。现有的分析方法通常需要大量细胞，涉及耗时的处理步骤，或依赖于无法真实反映化疗药物细胞内可利用性的间接读数5,6。这些局限性凸显了建立快速、灵敏且可扩展的方法的必要性，以直接在患者来源的样本中定量检测细胞内药物的累积情况。

本方案描述了一种利用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）对儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）原代细胞内长春新碱（VCR）进行相对定量的微量分析方法。该方法的建立旨在直接、灵敏地评估细胞内药物含量，克服了传统分析方法的局限性——后者通常依赖大量细胞样本、半定量检测策略或间接替代标志物。通过实现对少量原代细胞内VCR含量的测定，该微量方法为研究药物摄取、细胞内药物代谢及药理学行为提供了实用且可重复的实验框架，适用于离体（ex vivo）白血病模型。

本方案的一个关...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

感谢巴西博尔德里尼儿童中心及所有为本研究捐献样本的患者。Adrielli C. Soares 获得了巴西高等教育人员进修协调委员会（CAPES）以及圣保罗研究基金会（FAPESP，2023/18389-3）的资助。José A. Yunes 获得了国家科学技术发展委员会（CNPq，308399/2021-8）的生产力研究基金。本研究得到了巴西卫生部 PRONON 项目（国家肿瘤诊疗支持计划，项目编号：25000.211174/2019-45）的研究经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2.0 mL 螺口小瓶Flowsupply8-2400与同公司生产的带弹簧玻璃插件（5 x 29 mm）配合使用（货号 5-29015）
2.0 mL 螺口小瓶Flowsupply8-2400与同公司生产的带弹簧玻璃插件（5 x 29 mm）配合使用（货号 5-29015）
乙腈Merck (Sigma-Aldrich)100030
乙腈Merck (Sigma-Aldrich)24010152
AIM VThermo Fisher Scientific12055091
色谱系统 Acquity UPLC H-ClassWaters Co.https://www.waters.com/nextgen/br/pt/products/chromatography/chromatography-systems/acquity-uplc-h-class-plus-system.html?srsltid=AfmBOoo0mjNgaucBI-Exv97cEmWE96_lVkqKi2IR0IPtA-h1feG-WvtW
Countess 3 FLThermo Fisher ScientificA49892
DMSOMerck (Sigma-Aldrich)D 8418
Falcon 50 mLSarstedt62.547.254
甲酸Merck (Sigma-Aldrich)F0507
玻璃瓶Merck (Sigma-Aldrich)41121800
培养箱PHCBIMCO-50M-PE
甲醇Merck (Sigma-Aldrich)34860
微量离心管 1.5 mLEppendorf41121702
微量离心管 2.0 mLEppendorf30120094
PBSMerck (Sigma-Aldrich)PPB006
Speevac miVacFisher Scientific56340
数据采集软件Waters Co.MassLynx
三重四极杆质谱仪 Xevo TQ-S microWaters Co.https://www.waters.com/nextgen/us/en/products/mass-spectrometry/mass-spectrometry-systems/xevo-tq-s-micro.html?srsltid=AfmBOoqqmLRNfHGqvtnwaL7xYOOEXPV3NJ9qYNH9HAwqXKXrMvLRQXSW
超声波破碎仪QuimisQ335D
长春碱 1 mg/mLLibbshttps://www.libbs.com.br/nossos-produtos/antineoplasico-faulblastina/硫酸长春碱
长春新碱Cayman Chemicals11764

参考文献

  1. Inaba, H., Pui, C. H. Advances in the diagnosis and treatment of pediatric acute lymphoblastic leukemia. J Clin Med. 10 (9), 1926(2021).
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  13. Zhang, J., Dasgupta, A., Ayala, R., Bonapace, C., Kassim, S., Faustino, P. J. Internal standard variability: root cause investigation, parallelism for evaluating trackability and practical considerations. Bioanalysis. 16 (15), 771-776 (2024).

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