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方法文章

CRISPR/Cas9 介导的 Ent2*/CyO Drosophila melanogaster 果蝇品系的构建与鉴定

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DOI：

10.3791/69546

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2026年8月7日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Traditional Chinese Medicine, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 2Innovative Team for Medicinal Plant Resources and Breeding, Institute of Special Agricultural Products, Chinese Academy of Agricultural Sciences

本文内容

摘要

平衡型核苷转运蛋白2（ENT2）是一种保守的跨膜蛋白，参与核苷转运和细胞代谢过程。本研究建立了一种基于CRISPR/Cas9的基因组编辑流程，用于在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中生成靶向Ent2基因的等位基因。利用平衡染色体策略构建并维持了一个稳定的Ent2*/ CyO杂合品系。本文详细描述了该突变品系的设计、构建及分子验证过程，并在不同温度条件下对其表型进行了表征分析。所建立的实验流程和突变品系为研究具有纯合致死表型的基因以及探究果蝇中与温度相关的表型变异提供了实用的研究框架。

摘要

在本研究中，采用基于CRISPR/Cas9的基因组编辑方法，在平衡核苷转运蛋白2（equilibrative nucleoside transporter 2,Ent2基因 黑腹果蝇 黑腹果蝇靶向编码区的引导RNA Ent2 设计后与 Cas9 mRNA 共同注射到 w1118 胚胎。通过Sanger测序鉴定突变等位基因，并将其维持为稳定的 Ent2*/CyO 使用平衡染色体构建杂合品系。随后，分别在22 °C和25 °C条件下评估果蝇的体重、攀爬能力、存活率以及超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性。结果表明，在22 °C和25 °C下，果蝇的体长和体重均 Ent2*/CyO 果蝇数量显著减少，相较于 w1118，其发育进程延迟。在22°C条件下，其整体寿命 Ent2*/CyO 果蝇的寿命略长于 w1118，而在25°C时未观察到显著差异。关于运动能力，杂合子果蝇的攀爬表现显著低于 w1118 在两个温度下，雄性均受到更严重的影响。此外，雄性和雌性中的抗氧化酶CAT和SOD的活性 Ent2*/CyO 果蝇的抗氧化能力显著下降，表明其抗氧化能力明显受损。这些结果描述了一种由CRISPR技术构建的果蝇的表型特征 Ent2 突变品系，并证明了将基因组编辑与平衡染色体策略相结合的可行性 黑腹果蝇本研究为未来探索与代谢及环境响应相关基因提供了方法学框架和遗传资源。

引言

Drosophila melanogaster 仍然是遗传学和发育生物学研究中最广泛使用的模式生物之一1。其特点包括生命周期短、繁殖速度快、遗传操作工具成熟以及基因组已全面注释2,3。该物种被广泛应用于基因功能、代谢调控以及环境适应性研究4,5。核苷及其衍生物（如ATP）在Drosophila中对细胞能量生成、核酸合成和信号转导至关重要，反映了后生动物中保守的代谢调控机制6。依赖于胞外腺苷和核苷转运机制的Drosophila嘌呤能信号通路，凸显了核苷跨膜运输在协调能量代谢与信号转导反应中的功能作用7。在这些过程中，核苷跨细胞质膜的转运主要由平衡型核苷转运蛋白（ENT）家族介导，其中DmENT2在Drosophila中表现出功能性转运活性8。

ENT 家族包含多种亚型，其中 ENT2 是一种被广泛研究的跨膜核苷转运蛋白9。它介导多种嘌呤和嘧啶核苷的非能量依赖性跨膜运输10,11。在哺乳动物中，ENT2 是一种普遍表达的双向转运蛋白，可促进细胞对嘌呤和嘧啶核苷及碱基的摄取。该转运活性参与核苷酸补救合成途径，并有助于维持细胞代谢稳态12。ENT2 还介导多种核苷类药物的转运，使其功能意义超越内源性核苷的转运，凸显其更广泛的生理与临床重要性13。此外，ENT2 已被发现与神经系统疾病14、肿瘤代谢15、血管功能障碍16 以及人类细胞能量代谢相关17。然而，关于 Drosophila 中 Ent2 在个体水平上的功能研究仍较为有限。

在不同温度条件下，ENT2 在生长发育、能量代谢、运动能力及抗氧化能力中的作用尚未得到充分研究18。温度对果蝇（Drosophila）的基础代谢率和寿命具有显著影响，通常较高的培养温度会提高代谢活性，但缩短寿命19。这些依赖于温度的基因表达变化可能影响生理通路，从而改变特定基因突变的表型效应20。

成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR 相关蛋白 9（CRISPR/Cas9）已在果蝇（Drosophila）中广泛应用于多种基因组修饰操作，如位点特异性敲除、缺失、替换和标签引入，显示出其高效性和可靠性21,22,23。最新研究进展表明，基于 CRISPR 的碱基编辑器也可用于果蝇（Drosophila）中更精细的位点特异性碱基修饰，为点突变和精确的表型调控提供了新工具24。传统的诱变方法，包括化学诱变、辐射诱变以及转座子介导的筛选，均可产生遗传突变25。然而，这些方法通常受限于较低的效率和较高的突变随机性，因此研究人员必须筛选大量个体才能获得特定的目标等位基因26。CRISPR/Cas9 可通过程序化设计的向导 RNA（gRNA）引导，在特定 DNA 序列处实现靶向切割。所产生的双链断裂可通过非同源末端连接或同源定向修复机制进行修复，从而生成明确且可遗传的突变，并显著减少可能干扰表型分析的背景突变27,28。通过与平衡染色体（如卷翅突变染色体 CyO）连锁，CRISPR/Cas9 产生的突变等位基因可在杂合状态下长期维持29。该策略已被证明可有效防止致死性等位基因在纯合状态下的丢失，在果蝇（Drosophila）遗传学研究中具有重要意义。因此，该方法支持长期且系统的表型评估，包括在不同温度或环境条件下进行的功能研究29,30。CRISPR/Cas9 简便的设计和高效率显著缩短了品系构建周期，并提高了遗传背景的稳定性，这对于研究温度响应和发育稳态等长期环境因素尤为重要。

基于这一基础，利用 CRISPR/Cas9 系统对黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中的 Ent2 基因进行敲除，成功建立了一个稳定遗传的 Ent2*/CyO 杂合突变品系。系统评估了该品系的发育周期、体质量、运动能力以及抗氧化酶 SOD 和 CAT 的活性。通过在不同温度条件下比较 w1118 与突变果蝇的多维表型，本研究旨在提供一种可重复的 CRISPR 来源突变品系构建与维持策略，并对所获得的表型进行描述性表征。本工作为后续研究代谢及环境响应相关基因提供了方法学框架和有价值的遗传资源。

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方案

1. Ent2 基因的 CRISPR/Cas9 靶点设计

  1. 选择外显子2和5中的候选CRISPR位点 Ent2 （FlyBase ID：FBgn0263916）使用CHOPCHOP（v3）31 以及 CCTop (v1.0)32.
  2. 参考基因组定义为 果蝇 黑腹果蝇 第6版（dm6）（RefSeq基因组组装编号：GCF_000001215.4）。随后，鉴定候选gRNA位点。最后，对鉴定出的位点进行筛选，以获得最优gRNA。
  3. 根据 MIT 特异性评分 ≥ 80（CHOPCHOP）、CFD 评分 ≤ 0.1（CCTop）、GC 含量 40%–60% 以及最小 PAM 距离筛选靶点。
  4. 根据加权评分（效率50%，特异性30%，GC优化20%）对靶点进行排序，并选择两个gRNA。
  5. 在每条 gRNA 的 5′ 端添加一个“G”，以满足 T7 启动子的要求。使用以下 gRNA 特异性正向引物，通过 PCR 扩增生成全长 sgRNA 转录模板：
    Ent2-sg1-F：TAATACGACTCACTAT
    AGGTGACGTTAAATCCATCGTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
    Ent2-sg2-F：TAATACGACTCAC
    TATATTGCCGTTGGAATCATGGGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
  6. 剩余的sgRNA骨架序列由PCR过程中的通用反向寡核苷酸提供。

2. sgRNA 转录模板的制备

  1. sgRNA 转录模板的制备
    1. 根据制造商说明书，采用双寡核苷酸退火–PCR 方法配制 60 µL 的 PCR 反应体系33。将 gRNA 特异性正向寡核苷酸（Ent2-sg1-F 或 Ent2-sg2-F）与编码 sgRNA 骨架的通用反向寡核苷酸混合，以获得用于体外转录的全长双链 DNA 模板。
    2. 设置 PCR 仪程序：95 °C 预变性 3 min；35 个循环（95 °C 变性 30 s，55 °C 退火 30 s，72 °C 延伸 20 s）；72 °C 最终延伸 10 min；4 °C 保存。
  2. 纯化转录模板
    1. 向 60 µL PCR 产物中加入 100 µL 乙酸铵（见 材料表）并混匀；再加入 400 µL 无水乙醇，颠倒混匀后于 -20 °C 孵育 20 min。
    2. 在 4 °C 下以 20,000 ×g 离心 15 min，弃上清。
    3. 将沉淀在管盖打开状态下室温风干 10 min，随后用 10 µL 无核酸酶的 ddH₂O 重悬沉淀。
  3. gRNA 的体外转录
    1. 按照试剂盒说明书（见 材料表）配制 10 µL 的 T7 体外转录反应体系。
    2. 在 37 °C 孵育 35 min；加入 0.5 µL 转录试剂盒中提供的 DNase I，在 37 °C 继续孵育 15 min。
  4. 纯化 gRNA
    1. 用无核酸酶的 ddH₂O 将转录反应产物稀释至 60 µL；加入 60 µL 水饱和酚/氯仿（见材料表），短暂涡旋混匀后在 4 °C、16,000 ×g 离心 5 min。
    2. 将 45 µL 水相转移至新的 1.5 mL 无 RNase 的离心管中；加入 5 µL 醋酸钠，混匀。
    3. 加入 125 µL 预冷的无水乙醇，混匀后于 -20 °C 沉淀 20–30 min；在 4 °C、20,000 ×g 离心 15 min，弃上清。
    4. 用 200 µL 70% 乙醇（无 RNase）洗涤沉淀；在 4 °C、20,000 ×g 离心 5 min，移除上清。
    5. 将沉淀在 37 °C 干燥至乙醇完全挥发；用 20 µL ddH₂O 重悬，分装后于 -80 °C 保存。
    6. 使用 NanoDrop 分光光度计测定 gRNA 浓度，并将浓度调整至 250 ng/µL 用于显微注射。通过 A260/A280 比值约为 2.0 确保 gRNA 的纯度。
      ​注意：我们强调，为防止 RNase 污染，整个操作过程中必须佩戴手套。所有耗材，包括预冷的无 RNase 离心管和移液枪头，均需全程一致使用。实验过程中产生的有机试剂废液必须按种类分类收集至指定的废液容器中，并定期运送至有资质的危险废物处理机构进行妥善处置。

3. Cas9 mRNA 的制备

  1. 转录模板的制备
    注意： 在整个RNA相关操作步骤中均应使用无RNase的枪头和离心管。
    1. 解冻 Cas9 表达质粒 MLM3613（见 材料列表) 冰上孵育。在无RNase的离心管中，混合 20 µg 质粒DNA， 7.5 µL 10x 限制性酶缓冲液， 1 µL PmeI（10,000 U/mL）和无核酸酶的ddH₂O至 75 µL.
    2. 孵育于 37 °C 30分钟。通过上样验证线性化是否完全 5 µL 在120 V电压下将样品加入1%琼脂糖凝胶中电泳30分钟。
  2. 转录模板的纯化
    1. 添加 23 µL 2% 十二烷基硫酸钠（SDS，参见 材料表 详情请参见）以及 0.5 µL 蛋白酶K（参见 材料表 以获取详细信息）到 70 µL 消化产物；在指定温度下孵育 50 °C 30 分钟
    2. 添加 45 µL 氯仿和 45 µL Tris 饱和酚；短暂涡旋；13,800 x g 离心 g，5 分钟
    3. 转移 90 µL 将水相转移至新离心管中。加入 10 µL 乙酸钠（试剂盒提供）和 200 µL 预冷无水乙醇；混合；孵育 −20 °C，30 分钟。
    4. 离心 20,000 x g, 4 °C，15 分钟；弃去上清液。用缓冲液将沉淀物洗涤两次 100 µL 70% 乙醇；20,000 × g 离心 g，每次2分钟；风干。
    5. 将DNA溶解于 20 µL 无核酸酶的 ddH₂O；确认 >500 ng/µL.
  3. 体外转录联合共加帽
    1. 使用带有加帽功能的T7体外转录试剂盒进行反应（参见 材料清单按照制造商说明书操作。
    2. 孵育于 37 °C 孵育2小时以生成带帽的Cas9 mRNA。
    3. 转录反应完成后，加入 1 µL DNase（试剂盒提供，浓度为 2 U/µL），充分混匀，于 37°C 孵育15分钟以降解DNA模板。
  4. 添加poly(A)尾
    1. 将RNA补至 14 µL ddH₂O
    2. 添加 2 µL 10x E. coli Poly(A)聚合酶缓冲液， 2 µL ATP（10 mM） 1 µL RNase 抑制剂，以及 1 µL Poly(A)聚合酶
    3. 孵育于 37 °C 45分钟。
  5. 纯化 mRNA
    1. 将反应液加入到离心柱总RNA提取试剂盒中（见材料表）。将样品上样至2 mL硅胶膜离心柱中；以8,000 x g，15 秒；弃去流穿液。
    2. 添加 500 µL 向RNeasy柱中加入RPE缓冲液，8000 x g离心 g 15 秒，弃去残余液体。重复此步骤一次，然后离心 2 分钟，弃去残余液体。
    3. 将 RNeasy 柱放入一个新的 1.5 mL 离心管中。加入 30 µL 加入无RNase的ddH₂O，于8000 x g 1 分钟以洗脱 RNA。将 mRNA 浓度调整至 500 ng/µL 用于注射。将洗脱的RNA储存在-80 ℃。

4. 显微注射 果蝇 胚胎

  1. 注射样品的制备
    1. 按体积比 2:1 将 15 µg Cas9 mRNA 与 7.5 µg 双链 gRNA 混合。
    2. 用 DEPC 处理的无 RNase 水调整至 30 µL；置于冰上保存。
  2. Drosophila 的培养
    1. 将注射后的 Drosophila 品系 w1118 转移至大培养管中进行扩增。w1118 果蝇用作参考对照，以代表无平衡染色体相关效应的基础生理状态。
    2. 将果蝇饲养于人工气候箱中，温度设为 25 °C，湿度为 60%–70%，光照周期为 12:12 光照-黑暗，持续 14 天。
    3. 在饲养期第 14 天的次日（第 15 天）17:00，收集成虫以同步定时产卵。此特定收集时间可确保用于注射的胚胎处于一致的发育阶段。控制每日时间对于最小化昼夜节律对胚胎发育和生殖行为的影响至关重要，从而保证实验的可重复性，并减少批次间的生理变异。
  3. Drosophila 的显微注射
    1. 将用于注射的成虫收集至果蝇饲养笼中，每笼约 400 只成虫。在涂有酵母的琼脂平板上收集胚胎；在产卵后 60 分钟内收集胚胎，并冲洗至盖玻片上。注射前未进行去壳处理。
    2. 将胚胎整齐排列于盖玻片上，使其后极朝外，并自上而下有序排列。确保注射针以适当深度（约胚胎长度的五分之一）穿入后极，以实现稳定的细胞质递送。本研究共使用 300 枚胚胎。
    3. 在体视显微镜下，将针尖与胚胎调至同一焦平面。
    4. 使用注射装置刺入后极，并向每个胚胎注射 0.001 µL 混合液。
    5. 将注射后的胚胎转移至培养瓶中，在 25 °C、约 70% 相对湿度（RH）条件下培养，以获得 P₀ 代（注射后存活并产生后代的成虫）。

5. 稳定表达菌株的构建 果蝇

  1. 将羽化的 P₀ 与 Bc/CyO 果蝇杂交。
    1. 将靶向目的基因的 gRNA 与 Cas9 蛋白的混合物显微注射到 300 个 w1118 Drosophila 品系的胚胎中。注射后，共获得 30 只存活且可育的 P0 成虫。将每只 P0 成虫（嵌合体）分别与 w1118 品系的果蝇进行单对杂交（8 个瓶子为 P0 雄蝇与处女雌蝇杂交，8 个瓶子为 P0 雌蝇与雄蝇杂交），共建立 16 组单对杂交。所有杂交均在 25 °C 下恒定培养条件下维持。
    2. 待 F1 代出现幼虫后，移除 P0 亲本果蝇。提取 F1 后代的基因组 DNA，并进行 PCR 分析以确定 F1 成虫的基因型（Ent2/+）。
    3. 通过 Bc/CyO 果蝇之间的单对杂交产生 F2 后代。选取单个 F2 成虫并进行基因分型，筛选出具有 Ent2/CyO 基因型的果蝇。
    4. 将 F3 代果蝇（Ent2/CyO）进行互交，以检测纯合突变体是否存在。若未获得纯合子，则将 Ent2/CyO 果蝇继续互交至额外一代，进一步判断该纯合基因型是否致死。
  2. Drosophila 基因组 DNA 提取
    1. 将一至两只成虫收集至 1.5 mL EP 管中，加入 110 µL 植物 DNA 提取缓冲液 PA。
    2. 使用组织研磨器充分匀浆样品，持续至少 3 分钟。
    3. 将匀浆液置于 65 °C 金属浴中孵育不少于 30 分钟。
    4. 加入 100 µL 氯仿，轻轻颠倒混匀，涡旋振荡 10 秒。室温下以 14,000 rpm 离心 10 分钟。
    5. 小心转移约 65 µL（或更多）上清至新管中，加入两倍体积预冷的无水乙醇（预先在 4 °C 预冷至少 10 分钟），轻轻颠倒混匀，于 -20 °C 孵育至少 15 分钟。
    6. 在 4 °C 下以 14,000 rpm 离心 10 分钟，小心弃去上清。
    7. 将 DNA 沉淀在室温或培养箱中风干至完全干燥，然后用适量 PB 缓冲液重悬。对于雌性（f）样品，加入 50 µL PB 缓冲液；对于雄性（m）样品，加入 15 µL PB 缓冲液。
  3. PCR 扩增与 Sanger 测序
    1. 使用特异性引物进行 PCR 扩增，引物设计用于扩增 gRNA 靶位点上下游区域。
    2. 纯化 PCR 产物并进行 Sanger 测序。使用 SnapGene 软件34 分析测序色谱图，并与野生型参考序列比对进行比较分析。
    3. 检查 gRNA 靶位点附近的峰图是否存在重叠峰，以判断是否存在插入缺失（indel）突变。进行峰图拆分以解析混合信号，确认突变类型，包括靶位点处的插入或缺失。
    4. 与 Bc/CyO 雄蝇回交 4 代，建立 Ent2/CyO 品系。
      注意： 观察发现 Ent2*/Ent2* 和 CyO/CyO 在早期发育阶段致死，因此仅维持 Ent2*/CyO 杂合子。
  4. 在建立 Ent2*/CyO 杂合子品系后，在体视显微镜下收集同一批次的 Ent2*/CyO 杂合子样品。
  5. 随机选取 20 只成虫，使用分辨率为 0.001 g 的精密天平称重，并对样品进行拍照以记录其表型特征。

6. 描述性表型特征分析

  1. 在 22 °C 和 25 °C 条件下，分别饲养 Ent2*/CyO 和 w1118 品系的雄性 120 只和雌性 120 只（每组测试三个小瓶，每瓶含 20 只果蝇）。
  2. 每周记录死亡数量，并绘制生存曲线。
  3. 每组设置 30 对随机交配的果蝇，允许交配 24 小时；
  4. 将成虫转移至新鲜培养管中，饲养后代。
  5. 羽化后第 7 天，检测攀爬能力（30 秒内攀爬 ≥8 cm），每组进行六次重复实验。
  6. 所有观察结果均记录为突变品系的描述性特征，不用于推断基因功能。

7. 测定抗氧化酶活性

  1. 收集300只雄性和300只雌性成虫（每组测试三个瓶，每瓶含100只果蝇）Ent2*/CyO 及 w1118 对照果蝇，在羽化后5天进行，以确保生理成熟且年龄一致。
  2. 将果蝇转移至无食物的空管中，饥饿处理2小时，以在生化检测前标准化其代谢状态。
  3. 每管加入一个钢珠；在60 Hz条件下匀浆2分钟。
  4. 在4 °C、161 ×g 条件下离心10分钟，收集上清液。
  5. 根据试剂盒说明书测定总超氧化物歧化酶（SOD，详见材料表）和过氧化氢酶（CAT，详见材料表）活性。

8. 数据统计与分析

  1. 所有数据均以均值 ± 均值标准误（运动学方程：x̄=vt，图像，直线运动研究，速度-时间关系分析。 ± SEM）表示。
  2. 采用单因素方差分析（one-way ANOVA）比较酶活性数据；对体重、攀爬能力及体长数据采用三因素方差分析（three-way ANOVA，因素：基因型、温度、性别）。在必要时进行 Tukey’s HSD 事后检验35。
  3. 所有统计检验的显著性水平定义为 P < 0.05。
  4. 使用生存曲线分析寿命数据，并进行 log-rank（Mantel-Cox）检验，以评估不同实验组之间生存轨迹是否存在显著差异36。
  5. 所有统计分析和作图均在 GraphPad Prism 9.5.0 软件中按照软件指南进行37。
  6. 所有统计分析仅用于描述性比较，不用于确立因果关系。

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结果

设计与有效性验证分析 Ent2 基因靶向位点
使用 CHOPCHOP 和 CCTop 平台设计了 Ent2 基因的候选靶位点（图 1）。根据特异性和效率标准，选择了靶向第 2 外显子和第 5 外显子区域的两个 gRNA。为验证基因组编辑成功，从已建立品系中随机选取个体提取基因组 DNA Ent2*/CyO 该条带被扩增后进行Sanger测序。测序色谱图显示在靶位点附近开始出现重叠峰，符合插入/缺失（indel）突变特征。进一步序列分析揭示存在移码突变，导致提前出现终止密码子（图2）。这些结果证实CRISPR/Cas9系统已成功在靶向的Ent2位点引入突变，并验证了该基因组编辑工作流程的可行性。

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讨论

Ent 是一种在进化上保守的蛋白质，可影响多种生物学过程38在非洲爪蟾卵母细胞中表达时， Ent2 具有核苷转运活性8研究表明，纯合突变体 Ent2 在幼虫晚期或蛹期早期具有致死性10在本研究中，建立了一种基于CRISPR/Cas9的基因组编辑工作流程，用于生成 Ent2靶向等位基因在 果蝇 黑腹果蝇纯合突变体在品系建立过程中表现出的致死性与先前报道一致，支持了基因组编辑策略的有效性。在此框架下， Ent2*/CyO 本研究构建的杂合子品系为部分基因功能缺失相关表型特征的记录提供了模型 Ent2在所测试的实验条件下，观察到个体之间在体型、体重、运动活性以及抗氧化酶水平方面存在差异 Ent2*/CyO 和 w1118 果蝇。这些观察结果描述了已建立的突变品系的表型...

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披露

所有作者均无利益冲突需要声明。

致谢

本研究由吉林省科技发展计划项目（项目编号：20230505044ZP）提供支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙酸铵Sigma A1542
过氧化氢酶（CAT）检测试剂盒（可见光法）（钼酸铵法）南京建成生物工程研究所A007-1-1
十二烷基硫酸盐SigmaL3771
注射装置Eppendorf FemtoJet 4i
线性化质粒：MLM3613Addgene42251
显微镜OLYMPUS CKX3-SLP
mMESSAGE mMACHINE T7 试剂盒Thermo FisherAM1344
mMESSAGE mMACHINE T7 转录试剂盒Thermo FisherAM1344
PmeI 限制性内切酶NEB R0560S
多聚（A）聚合酶NEBM0276S
蛋白酶 KThermo FisherEO0491
RNeasy Mini 试剂盒QIAGEN74104
T7 RiboMAX Express 大规模 RNA 生产系统Promega P1320
T7 RiboMAX 试剂盒Promega P1320
总超氧化物歧化酶（T-SOD）检测试剂盒（羟胺法）南京建成生物工程研究所A001-1
w1118 Drosophila 方静生物
水饱和酚/氯仿SigmaP2069

参考文献

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