方法文章

CRISPR/Cas9 介导的 Ent2*/CyO Drosophila melanogaster 果蝇品系的构建与鉴定

DOI：

10.3791/69546

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2026年8月7日

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1College of Traditional Chinese Medicine, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 2Innovative Team for Medicinal Plant Resources and Breeding, Institute of Special Agricultural Products, Chinese Academy of Agricultural Sciences

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

平衡型核苷转运蛋白2（ENT2）是一种保守的跨膜蛋白，参与核苷转运和细胞代谢过程。本研究建立了一种基于CRISPR/Cas9的基因组编辑流程，用于在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中生成靶向Ent2基因的等位基因。利用平衡染色体策略构建并维持了一个稳定的Ent2*/ CyO杂合品系。本文详细描述了该突变品系的设计、构建及分子验证过程，并在不同温度条件下对其表型进行了表征分析。所建立的实验流程和突变品系为研究具有纯合致死表型的基因以及探究果蝇中与温度相关的表型变异提供了实用的研究框架。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在本研究中，采用基于CRISPR/Cas9的基因组编辑方法，在平衡核苷转运蛋白2（equilibrative nucleoside transporter 2,Ent2基因 黑腹果蝇 黑腹果蝇靶向编码区的引导RNA Ent2 设计后与 Cas9 mRNA 共同注射到 w1118 胚胎。通过Sanger测序鉴定突变等位基因，并将其维持为稳定的 Ent2*/CyO 使用平衡染色体构建杂合品系。随后，分别在22 °C和25 °C条件下评估果蝇的体重、攀爬能力、存活率以及超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性。结果表明，在22 °C和25 °C下，果蝇的体长和体重均 Ent2*/CyO 果蝇数量显著减少，相较于 w1118，其发育进程延迟。在22°C条件下，其整体寿命 Ent2*/CyO 果蝇的寿命略长于 w1118，而在25°C时未观察到显著差异。关于运动能力，杂合子果蝇的攀爬表现显著低于 w1118 在两个温度下，雄性均受到更严重的影响。此外，雄性和雌性中的抗氧化酶CAT和SOD的活性 Ent2*/CyO 果蝇的抗氧化能力显著下降，表明其抗氧化能力明显受损。这些结果描述了一种由CRISPR技术构建的果蝇的表型特征 Ent2 突变品系，并证明了将基因组编辑与平衡染色体策略相结合的可行性 黑腹果蝇本研究为未来探索与代谢及环境响应相关基因提供了方法学框架和遗传资源。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila melanogaster 仍然是遗传学和发育生物学研究中最广泛使用的模式生物之一1。其特点包括生命周期短、繁殖速度快、遗传操作工具成熟以及基因组已全面注释2,3。该物种被广泛应用于基因功能、代谢调控以及环境适应性研究4,5。核苷及其衍生物（如ATP）在Drosophila中对细胞能量生成、核酸合成和信号转导至关重要，反映了后生动物中保守的代谢调控机制6。依赖于胞外腺苷和核苷转运机制的Drosophila嘌呤能信号通路，凸显了核苷跨膜运输在协调能量代谢与信号转导反应中的功能作用7。在这些过程中，核苷跨细胞质膜的转运主要由平衡型核苷转运蛋白（ENT）家族介导，其中DmENT2在Drosophila中表现出功能性转运活性8。

ENT 家族包含多种亚型，其中 ENT2 是一种被广泛研究的跨膜核苷转运蛋白9。它介导多种嘌呤和嘧啶核苷的非能量依赖性跨膜运输10,11。在哺乳动物中，ENT2 是一种普遍表达的双向转运蛋白，可促进细胞对嘌呤和嘧啶核苷及碱基的摄取。该转运活性参与核苷酸补救合成途径，并有助于维持细胞代谢稳态12。ENT2 还介导多种核苷类药物的转运，使其功能意义超越内源性核苷的转运，凸显其更广泛的生理与临床重要性13。此外，ENT2 已被发现与神经系统疾病14、肿瘤代谢15、血管功能障碍16 以及人类细胞能量代谢相关17。然而，关于 Drosophila 中 Ent2 在个体水平上的功能研究仍较为有限。

在不同温度条件下，ENT2 在生长发育、能量代谢、运动能力及抗氧化能力中的作用尚未得到充分研究18。温度对果蝇（Drosophila）的基础代谢率和寿命具有显著影响，通常较高的培养温度会提高代谢活性，但缩短寿命19。这些依赖于温度的基因表达变化可能影响生理通路，从而改变特定基因突变的表型效应20。

成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR 相关蛋白 9（CRISPR/Cas9）已在果蝇（Drosophila）中广泛应用于多种基因组修饰操作，如位点特异性敲除、缺失、替换和标签引入，显示出其高效性和可靠性21,22,23。最新研究进展表明，基于 CRISPR 的碱基编辑器也可用于果蝇（Drosophila）中更精细的位点特异性碱基修饰，为点突变和精确的表型调控提供了新工具24。传统的诱变方法，包括化学诱变、辐射诱变以及转座子介导的筛选，均可产生遗传突变25。然而，这些方法通常受限于较低的效率和较高的突变随机性，因此研究人员必须筛选大量个体才能获得特定的目标等位基因26。CRISPR/Cas9 可通过程序化设计的向导 RNA（gRNA）引导，在特定 DNA 序列处实现靶向切割。所产生的双链断裂可通过非同源末端连接或同源定向修复机制进行修复，从而生成明确且可遗传的突变，并显著减少可能干扰表型分析的背景突变27,28。通过与平衡染色体（如卷翅突变染色体 CyO）连锁，CRISPR/Cas9 产生的突变等位基因可在杂合状态下长期维持29。该策略已被证明可有效防止致死性等位基因在纯合状态下的丢失，在果蝇（Drosophila）遗传学研究中具有重要意义。因此，该方法支持长期且系统的表型评估，包括在不同温度或环境条件下进行的功能研究29,30。CRISPR/Cas9 简便的设计和高效率显著缩短了品系构建周期，并提高了遗传背景的稳定性，这对于研究温度响应和发育稳态等长期环境因素尤为重要。

基于这一基础，利用 CRISPR/Cas9 系统对黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中的 Ent2 基因进行敲除，成功建立了一个稳定遗传的 Ent2*/CyO 杂合突变品系。系统评估了该品系的发育周期、体质量、运动能力以及抗氧化酶 SOD 和 CAT 的活性。通过在不同温度条件下比较 w1118 与突变果蝇的多维表型，本研究旨在提供一种可重复的 CRISPR 来源突变品系构建与维持策略，并对所获得的表型进行描述性表征。本工作为后续研究代谢及环境响应相关基因提供了方法学框架和有价值的遗传资源。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ent2 基因的 CRISPR/Cas9 靶点设计

  1. 使用 CHOPCHOP (v3)31 和 CCTop (v1.0)32 在 Ent2 基因（FlyBase 编号：FBgn0263916）的第 2 和第 5 外显子中选择候选 CRISPR 位点。
  2. 参考基因组定义为黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）Release 6 (dm6)（RefSeq 组装编号：GCF_000001215.4）。随后，识别候选 gRNA 位点。最后，对识别出的位点进行筛选以获得最优 gRNA。
  3. 根据 MIT 特异性评分 ≥ 80（CHOPCHOP）、CFD 评分 ≤ 0.1（CCTop）、GC 含量 40%–60%，以及最小 PAM 距离对靶点进行筛选。
  4. 使用加权评分（效率占 50%，特异性占 30%，GC 优化占 20%）对靶点排序，并选择两个 gRNA。
  5. 在每个 gRNA 的 5′ 端添加一个“G”，以满足 T7 启动子的要求。使用以下 gRNA 特异性正向寡核苷酸，通过 PCR 生成全长 sgRNA 转录模板：
    Ent2-sg1-F: TAATACGACTCACTAT
    AGGTGACGTTAAATCCATCGTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
    Ent2-sg2-F: TAATACGACTCAC
    TATATTGCCGTTGGAATCATGGGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
  6. 剩余的 sgRNA 支架序列由 PCR 中使用的通用反向寡核苷酸提供。

2. sgRNA转录模板的制备

  1. sgRNA转录模板的制备
    1. 根据制造商说明书，使用双寡核苷酸退火-PCR方法33配制60 µL PCR反应体系。将gRNA特异性的正向寡核苷酸（Ent2-sg1-F或Ent2-sg2-F）与编码sgRNA骨架的通用反向寡核苷酸混合，以获得用于体外转录的全长dsDNA模板。
    2. 设置PCR仪程序：95 °C 3 min；35个循环（95 °C 30 s，55 °C 30 s，72 °C 20 s）；然后72 °C 10 min；保持在12 °C。
  2. 纯化转录模板
    1. 向60 µL PCR产物中加入100 µL乙酸铵（见材料表）；混匀。加入400 µL无水乙醇；颠倒混匀，并在-20 °C孵育20 min。
    2. 在4 °C、20,000 xg离心15 min；弃去上清液。
    3. 将沉淀在开盖条件下风干10 min。用10 µL无核酸酶的ddH₂O重悬沉淀。
  3. gRNA的体外转录
    1. 按照试剂盒说明书（见材料表）配制10 µL T7体外转录反应体系。
    2. 在37 °C孵育35 min。加入0.5 µL DNase I（转录试剂盒中提供），在37 °C继续孵育15 min。
  4. 纯化gRNA
    1. 用无核酸酶的ddH₂O将转录产物稀释至60 µL。加入60 µL水饱和酚/氯仿（见材料表）；短暂涡旋混匀，在4 °C、16,000 xg离心5 min。
    2. 将45 µL水相转移至新的1.5 mL无RNase的离心管中。加入5 µL乙酸钠；混匀。
    3. 加入125 µL预冷的无水乙醇；混匀后在-20 °C孵育20–30 min。在4 °C、20,000 xg离心15 min；弃去上清液。
    4. 用200 µL 70%乙醇（无RNase）洗涤沉淀；在4 °C、20,000 xg离心5 min；弃去上清液。
    5. 在37 °C干燥沉淀，直至乙醇完全蒸发。用20 µL ddH₂O重悬，分装后于-80 °C保存。
    6. 使用NanoDrop分光光度计测定gRNA浓度，并将其调整至250 ng/µL用于注射。确保gRNA纯度，A260/A280比值应约为2.0。
      ​注意：我们强调，为防止RNase污染，整个操作过程中必须佩戴手套。所有耗材，包括预冷的无RNase离心管和移液器吸头，均需全程一致使用。实验过程中产生的有机试剂废液必须按种类分类收集于指定的废液容器中，并定期运送至有资质的危险废物处理机构进行妥善处置。

3. Cas9 mRNA 的制备

  1. 转录模板的制备
    注意： 在所有与RNA相关的步骤中，均须使用无RNase的枪头和离心管。
    1. 解冻 Cas9 表达质粒 MLM3613（参见 材料表) 冰上孵育。在无RNase的离心管中，混合 20 µg 质粒DNA， 7.5 µL 10x 限制性酶缓冲液 1 µL PmeI（10,000 U/mL）和无核酸酶的ddH₂O₂O 至 75 µL.
    2. 孵育于 37 °C 30分钟。通过上样验证是否完全线性化 5 µL 在120 V电压下将样品加入1%琼脂糖凝胶中电泳30分钟。
  2. 转录模板的纯化
    1. 添加 23 µL 2% 十二烷基硫酸钠（SDS，参见 材料表 详情请参见）以及 0.5 µL 蛋白酶K（参见 材料表 详情请参见 70 µL 消化产物；在指定温度下孵育 50 °C 30 分钟
    2. 添加 45 µL 氯仿和 45 µL Tris 饱和酚；短暂涡旋；13,800 x g 离心 g，5 分钟
    3. 转移 90 µL 将水相转移至新管。加入 10 µL 乙酸钠（试剂盒提供）和 200 µL 预冷无水乙醇；混合；孵育 −20 °C，30 分钟
    4. 离心 20,000 x g, 4 °C，15 分钟；弃去上清液。用缓冲液将沉淀洗涤两次 100 µL 70% 乙醇；20,000 × g 离心 g，每次2分钟；空气干燥。
    5. 将DNA溶解于 20 µL 无核酸酶的ddH₂O₂O；确认 >500 ng/µL.
  3. 体外转录结合共加帽
    1. 使用带有加帽功能的T7体外转录试剂盒进行反应（参见 材料表按照制造商的说明进行操作。
    2. 孵育于 37 °C 孵育2小时以生成带帽的Cas9 mRNA。
    3. 转录反应完成后，加入 1 µL DNase（试剂盒提供，浓度为 2 U/µL），充分混匀，于 37°C 孵育15分钟以降解DNA模板。
  4. 添加poly(A)尾
    1. 将RNA加至 14 µL ddH₂O₂O.
    2. 添加 2 µL 10x E. coli Poly(A)聚合酶缓冲液， 2 µL ATP（10 mM） 1 µL RNase 抑制剂，以及 1 µL 多聚(A)聚合酶
    3. 孵育于 37 °C 45 分钟。
  5. 纯化 mRNA
    1. 将反应液加入到离心柱总RNA提取试剂盒中（见材料表）。将样品上样至2 mL硅胶膜离心柱中；8,000 x g，15 秒；弃去流穿液。
    2. 添加 500 µL 向RNeasy柱中加入RPE缓冲液，8000 x g离心 g 15秒，弃去残留液体。重复此步骤一次，然后离心2分钟，弃去残留液体。
    3. 将RNeasy柱置于新的1.5 mL离心管中。加入 30 µL 无RNase的ddH₂O₂O，以8000 x g 1分钟以洗脱RNA。将mRNA浓度调整至500 ng/μL。µL 用于注射。将洗脱的RNA储存在-80 ℃.

4. 显微注射 果蝇 胚胎

  1. 注射样品的制备
    1. 将 15 µg Cas9 mRNA 与 7.5 µg 双链 gRNA 按体积比 2:1 混合。
    2. 用经 DEPC 处理的无 RNase 水调整至 30 µL；置于冰上保存。
  2. Drosophila 的饲养
    1. 将注射后的 Drosophila 品系 w1118 转移至大食物管中进行扩增。w1118 果蝇作为参考对照，用于代表无平衡染色体相关效应的基础生理状态。
    2. 将果蝇饲养于人工气候箱中，温度设定为 25 °C，湿度为 60%–70%，光照周期为 12 小时光照/12 小时黑暗，持续 14 天。
    3. 在饲养 14 天后的次日（第 15 天）17:00 收集成虫，以同步定时胚胎产出。该特定收集时间可确保用于注射的胚胎处于一致的发育阶段。控制每日收集时间对于减少昼夜节律对胚胎发育和生殖行为的影响至关重要，从而保证实验的可重复性，并降低不同批次间的生理变异。
  3. Drosophila 的显微注射
    1. 将成虫收集至果蝇饲养笼中，每笼约 400 只成虫。在涂有酵母的琼脂平板上收集胚胎；在产卵后 60 分钟内收集胚胎，并将其冲洗至盖玻片上。注射前未进行去壳处理。
    2. 将盖玻片上的胚胎按后极朝外的方向整齐排列，自上而下有序排布。确保注射针以适当深度（约为胚胎长度的五分之一）刺入后极，以实现稳定的细胞质递送。本研究共使用了 300 个胚胎。
    3. 在体视显微镜下，将注射针尖端与胚胎调整至同一焦平面。
    4. 使用注射装置刺入胚胎后极，并向每个胚胎注射 0.001 µL 的混合液。
    5. 将注射后的胚胎转移至食物小瓶中，在 25 °C、约 70% 相对湿度（RH）条件下培养，以获得 P₀ 代（即注射后存活并产生后代的成虫）。

5. 稳定表达菌株的构建 果蝇

  1. 将羽化的 P₀ 与 Bc/CyO 果蝇杂交。
    1. 将靶向目的基因的 gRNA 与 Cas9 蛋白的混合物显微注射到 300 个 w1118 Drosophila 品系的胚胎中。注射后，获得总共 30 只存活且具有生育能力的 P0 成虫。将每只 P0 成虫（嵌合体）分别与 w1118 品系的果蝇进行单对杂交，共获得 16 组单对杂交（8 管为 P0 雄蝇与处女雌蝇杂交，8 管为 P0 雌蝇与雄蝇杂交）。所有杂交均在 25 °C 恒定培养条件下维持。
    2. 当 F1 代幼虫出现后，移除 P0 亲代果蝇。从 F1 后代中提取基因组 DNA，并进行 PCR 分析以确定 F1 成虫的基因型（Ent2/+）。
    3. 通过 Bc/CyO 果蝇之间的单对杂交产生 F2 后代。挑选单只 F2 成虫并进行基因分型，以鉴定出具有 Ent2/CyO 基因型的个体。
    4. 将 F3 代果蝇（Ent2/CyO）进行互交，以检测纯合突变体是否存在。若未获得纯合子果蝇，则将 Ent2/CyO 果蝇再互交一代，进一步判断该纯合基因型是否致死。
  2. Drosophila 基因组 DNA 提取
    1. 将一至两只成虫收集至 1.5 mL EP 管中，并加入 110 µL 植物 DNA 提取缓冲液 PA。
    2. 使用组织研磨器充分匀浆样品，时间不少于 3 分钟。
    3. 将匀浆液置于 65 °C 金属浴中孵育，时间不少于 30 分钟。
    4. 加入 100 µL 氯仿，轻轻颠倒混匀，涡旋振荡 10 秒。室温下以 14,000 rpm 离心 10 分钟。
    5. 小心转移约 65 µL（或更多）上清液至新管中，加入两倍体积预冷的无水乙醇（预先在 4 °C 预冷至少 10 分钟），轻轻颠倒混匀，并在 -20 °C 孵育至少 15 分钟。
    6. 在 4 °C 以 14,000 rpm 离心 10 分钟，小心弃去上清液。
    7. 将 DNA 沉淀在室温或培养箱中空气干燥至完全干燥，然后用适量 PB 缓冲液重悬。对于雌性（f）样品，加入 50 µL PB 缓冲液；对于雄性（m）样品，加入 15 µL。
  3. PCR 扩增与 Sanger 测序
    1. 使用特异性引物进行 PCR 扩增，引物设计应覆盖 gRNA 靶位点的上下游区域。
    2. 纯化 PCR 产物并进行 Sanger 测序。使用 SnapGene 软件34 分析测序色谱图，并与野生型参考序列比对进行比较分析。
    3. 检查 gRNA 靶位点附近的峰图是否存在重叠峰，以判断是否存在插入缺失（indel）突变。通过峰拆分解析混合信号，确认突变类型，包括靶位点处的插入或缺失。
    4. 与 Bc/CyO 雄蝇回交 4 代，建立 Ent2/CyO 品系。
      注意：已观察到 Ent2*/Ent2* 和 CyO/CyO 在早期发育阶段致死，因此维持 Ent2*/CyO 杂合子。
  4. 建立 Ent2*/CyO 杂合子后，在体视显微镜下收集同一批次的 Ent2*/CyO 杂合子样品。
  5. 随机选取 20 只成虫，使用分辨率为 0.001 g 的精密天平称重。拍摄样品照片以记录表型特征。

6. 描述性表型特征分析

  1. 在 22 °C 和 25 °C 条件下，分别饲养 Ent2*/CyO 和 w1118 品系的雄性 120 只和雌性 120 只（每组设三个小瓶，每瓶含 20 只果蝇）。
  2. 每周记录死亡数量，并绘制生存曲线。
  3. 每组设置 30 对随机交配的果蝇，允许交配 24 小时；
  4. 将成虫转移至新鲜培养管中，继续培养后代。
  5. 在羽化后第 7 天，检测攀爬能力（30 秒内攀爬 ≥8 cm），每组进行六次重复实验。
  6. 所有观察结果均记录为突变品系的描述性特征，不用于推断基因功能。

7. 测定抗氧化酶活性

  1. 收集300只雄性和300只雌性成虫（每组测试三个样品管，每管含100只果蝇）Ent2*/CyO 及 w1118 对照果蝇，在羽化后5天进行，以确保生理成熟且年龄一致。
  2. 将果蝇转移至无食物的空管中，饥饿处理2小时，以在生化检测前标准化其代谢状态。
  3. 每管加入一个钢珠；在60 Hz条件下匀浆2分钟。
  4. 在4 °C、161 ×g 条件下离心10分钟，收集上清液。
  5. 根据试剂盒说明书测定总超氧化物歧化酶（SOD，详见材料表）和过氧化氢酶（CAT，详见材料表）的活性。

8. 数据统计与分析

  1. 所有数据均以均值 ± 均值标准误（figure-protocol-1​ ± SEM）表示。
  2. 采用单因素方差分析比较酶活性数据；对体重、攀爬能力及体长数据采用三因素方差分析（因素：基因型、温度、性别）。在必要时进行 Tukey’s HSD 事后检验35。
  3. 所有统计检验的显著性水平定义为 P < 0.05。
  4. 使用生存曲线分析寿命数据，并进行 log-rank（Mantel-Cox）检验，以评估不同实验组间生存轨迹是否存在显著差异36。
  5. 所有统计分析与作图均在 GraphPad Prism 9.5.0 软件中按照软件指南进行37。
  6. 所有统计分析仅用于描述性比较，不用于确立因果关系。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

设计与有效性验证分析 Ent2 基因靶向位点
使用 CHOPCHOP 和 CCTop 平台设计了 Ent2 基因的候选靶向位点（图 1）。根据特异性和效率标准，选择了靶向第 2 外显子和第 5 外显子区域的两条 gRNA。为验证基因组编辑是否成功，提取已建立品系中随机选取个体的基因组 DNA 进行分析 Ent2*/CyO 该条带被扩增后进行Sanger测序。测序色谱图显示在靶位点附近开始出现重叠峰，符合插入/缺失（indel）突变特征。进一步序列分析揭示存在移码突变，导致提前出现终止密码子（图2）。这些结果证实CRISPR/Cas9系统已成功在靶向的Ent2位点引入突变，并证明了该基因组编辑工作流程的可行性。

figure-results-1
图1． Ent2基因敲除位点及检测引物在基因组中的位置示意图。 该示意图展示了Ent2基因座的基因组结构，其中标注了CDS区（绿色）、起始和终止密码子（红色）、gRNA的PAM序列（灰色）、gRNA靶向序列（蓝色）以及gRNA扩增引物序列（黄色）。请点击此处查看该图的放大版本。

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图2．稳定品系自交 Drosophila 后代 Ent2*/CyO 的测序峰图。测序色谱图证实了从稳定杂合品系 Ent2*/CyO 自交所获得后代的基因型。请点击此处查看该图的放大版本。

Ent2/CyO 品系的描述性形态学观察
我们使用体视显微镜在 22 °C 和 25 °C 条件下观察了两种基因型果蝇在不同性别间的体型差异（图3）。在两种温度条件下，雄性和雌性果蝇均表现出典型的“长纺锤形”体型。雌性腹部宽大，呈纺锤状，翅尖略微超出腹部末端。雄性胸部与腹部交界处界限清晰，且腹部末端的深色色素沉着——雄性的鉴别特征——清晰可见。w1118 果蝇的翅在两性中均透明，翅脉清晰，未观察到翅缘弯曲或翅脉断裂现象。相比之下，Ent2*/CyO 杂合子表现出明显的翅基弯曲和翅缘弯曲。在 22 °C 时，无论性别如何，果蝇的体长均显著大于同基因型在 25 °C 时的体长。此外，在相同温度下，雌性体长显著大于雄性。此外，在 22 °C 和 25 °C 下，Ent2*/CyO 杂合子的体型均小于相应的 w1118 果蝇。为探究其形态学基础，我们同时测量了果蝇的体长（图3E，表1）。三因素方差分析显示基因型（F(1,16)=230.1，P<0.0001）、温度（F(1,16)=19.50，P=0.0004）和性别（F(1,16)=166.9，P<0.0001）均存在显著的主效应。同时还观察到显著的基因型与性别交互作用（F(1,16)=14.96，P=0.0014）以及显著的基因型×温度×性别三重交互作用（F(1,16)=6.231，P=0.0239）。

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图3对照形态学 w1118 和 Ent2*/CyO 成虫 显示雌性（A，C）和雄性（B，D）姿势特征的代表性图像 果蝇 在 22 °C 和 25 °C，以及体长的定量比较（E）。 P < 0.01. 比例尺：1 mm。 请点击此处以查看此图的放大版本。

不同温度条件下的生存分析
我们在 22 °C 和 25 °C 条件下对 Ent2*/CyO 杂合子与 w1118 果蝇的生存曲线进行了统计分析（图 4）。结果显示，Ent2*/CyO 杂合雌性果蝇的生存曲线最高，在第 14 周时仍有两只个体存活；而所有 w1118 雌性果蝇在第 14 周前均已死亡。Ent2*/CyO 杂合雄性果蝇均在第 12 周前死亡，而所有 w1118 雄性果蝇在第 11 周前死亡。这些结果表明，在 22 °C 条件下，雌性果蝇的整体寿命长于雄性；在同一性别中，Ent2*/CyO 杂合子的生存能力略强于 w1118 类型。

在25 °C条件下，总体生存期显著缩短。w1118雌性与Ent2*/CyO杂合雄性在第10周时生存曲线降至零。Ent2*/CyO杂合雌性与w1118雄性在第8周时生存数量下降至1–2只，并于第9周时降至零。突变体与w1118之间的差异无统计学意义（P > 0.05）。这些结果描述了该突变品系在不同环境条件下的生存特征。

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图4生存曲线 果蝇 在不同温度条件下 生存分析比较寿命 Ent2*/CyO 和 w1118 果蝇在 22 °C 和 25 °Cn=3。 请点击此处以查看此图的放大版本。

运动活性评估
在两种温度条件下（22 °C 和 25 °C）比较了w1118与Ent2*/CyO果蝇的攀爬能力（图5，表2）。结果显示，在22 °C时（图5A），98.15%的w1118雌性果蝇在30秒内成功攀爬超过8 cm，而Ent2*/CyO杂合雌性果蝇中该比例下降至89.74%（P < 0.05）。所有w1118雄性果蝇均能攀爬超过8 cm，而Ent2*/CyO杂合雄性果蝇的攀爬成功率则为98.14%（P < 0.05）。在25 °C时（图5B），所有w1118雌性果蝇（100%）在30秒内攀爬超过8 cm，而Ent2*/CyO杂合雌性果蝇中该比例降至91.31%（P < 0.05）。在w1118雄性果蝇中，77.28%成功攀爬超过8 cm（P < 0.01），而仅有63.57%的Ent2*/CyO杂合雄性果蝇达到该水平（P < 0.01）。为进一步评估运动表现，分析了果蝇攀爬超过15 cm的比例（图5C）。三因素方差分析（ANOVA）显示，性别（F(1,16) = 201.7，P < 0.0001）和培养温度（F(1,16) = 72.60，P < 0.0001）对攀爬表现具有极显著的主效应。然而，基因型的主效应不显著（F(1,16) = 0.59，P = 0.4545）。这些结果表明，运动表现随实验条件变化，且可能在不同背景下表现出组间差异。

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图5. 攀爬能力的比较 果蝇 在不同温度下。 攀爬性能的量化评估 22 °C （A）和 25 °C （B） 以及具有攀爬距离的个体的统计结果 > 15 cm（C）。 ** P < 0.01。n=3。 请点击此处以查看此图的放大版本。

体重测量
在 22 °C 和 25 °C 条件下测量了w1118及Ent2*/CyO杂合果蝇的体重（图6）。结果显示，与w1118果蝇相比，Ent2*/CyO杂合子在 22 °C 和 25 °C 下的体重均显著降低（P < 0.05 或 P < 0.01）。我们观察到，雄性w1118果蝇的体重显著低于雌性w1118果蝇（P < 0.01）。同样，雄性Ent2*/CyO杂合子的体重也显著低于雌性Ent2*/CyO杂合子（P < 0.01）。我们进行了三因素方差分析（three-way ANOVA），以评估基因型、培养温度和性别对黑腹果蝇（Drosophila）体重的独立效应及交互效应。分析结果显示，基因型（F(1,16) = 32.38，P < 0.0001）、温度（F(1,16) = 23.31，P = 0.0002）和性别（F(1,16) = 25.52，P = 0.0001）均具有显著的主效应（图6；表3）。此外，温度与性别之间存在显著的双向交互作用（F(1,16) = 24.76，P = 0.0001），表明温度对体重的影响因性别而异。然而，基因型与温度之间（F(1,16) = 0.40，P = 0.538）、基因型与性别之间（F(1,16) = 1.31，P = 0.269）以及三者之间的三向交互作用（基因型 × 温度 × 性别：F(1,16) = 0.48，P = 0.497）均无显著差异，说明Ent2*/CyO突变体对温度和性别的响应与野生型相似。

鉴于显著的温度差异 × 性别交互作用，我们进行了简单效应分析以明确其具体模式。结果表明，在雌性果蝇中，于 22 °C 体重显著高于在 25 °C (P = 0.0012）；然而，在雄性中，两种温度下的体重差异无统计学意义（P > 0.9999）。这表明将温度从 25–22 °C 显著增加了雌性果蝇的体重，而对雄性果蝇无显著影响。

尽管基因型与其他因素之间无显著交互作用，但基因型的显著主效应表明，在所有条件下，Ent2*/CyO 突变体的总体体重均低于野生型。事后比较进一步显示，在 22 °C 时，野生型雌性（w1118：22 °C 雌性）的体重显著高于所有突变组（P < 0.0001）；在同一温度下，两种基因型均表现出显著的性别二态性（雌性 > 雄性，P < 0.01）。在 25 °C 时，野生型与突变体之间的体重差异呈现相似趋势，但未达到统计学显著性。这些结果描述了该突变品系在不同环境和生物学条件下的体重特征。

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图6. 体重的比较 果蝇 在不同温度下体重测量于 22 °C 和 25 °C. 无意义 P > 0.05, * P < 0.05, ** P < 0.01。n=3。 请点击此处以查看此图的放大版本。

抗氧化酶活性
在 25 °C 条件下比较了w1118和Ent2*/CyO杂合型Drosophila的抗氧化酶活性（图7）。我们的结果表明，与w1118果蝇相比，Ent2*/CyO杂合子雄性和雌性果蝇的过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）活性均显著降低（P < 0.01）。我们还发现，w1118雄性果蝇的CAT和SOD活性显著高于w1118雌性果蝇（P < 0.05 或 P < 0.01）。类似地，Ent2*/CyO杂合雄性果蝇的抗氧化酶活性也显著高于Ent2*/CyO杂合雌性果蝇（P < 0.01）。

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图7. 抗氧化能力的比较 果蝇 在最佳摄食温度下。 过氧化氢酶（CAT）（A）和超氧化物歧化酶（SOD）（B）活性检测显示 Ent2/CyO 果蝇与 w 果蝇的酶活性比较1118 果蝇。* P < 0.05, ** P < 0.01。n=3。 请点击此处以查看此图的放大版本。

SSDFMSF (DFn, DFd)P 值
基因型0.802610.8026F (1, 16) = 230.1P<0.0001
温度0.0680310.06803F (1, 16) = 19.50P=0.0004
性别0.582210.5822F (1, 16) = 166.9P<0.0001
基因型 × 温度0.00579810.005798F (1, 16) = 1.662P=0.2156
基因型 × 性别0.0521810.05218F (1, 16) = 14.96P=0.0014
温度 × 性别0.0132310.01323F (1, 16) = 3.793P=0.0692
基因型 × 温度 × 性别0.0217310.02173F (1, 16) = 6.231P=0.0239
残差0.05581160.003488

表1：Drosophila体长测量值的方差分析。

方差分析表SSDFMSF (DFn, DFd)P 值
性别0.148310.1483F (1, 16) = 201.7P<0.0001
基因型0.000431910.0004319F (1, 16) = 0.5877P=0.4545
温度0.0533610.05336F (1, 16) = 72.60P<0.0001
性别 × 基因型0.0141810.01418F (1, 16) = 19.30P=0.0005
性别 × 温度0.00713410.007134F (1, 16) = 9.708P=0.0067
基因型 × 温度0.013510.0135F (1, 16) = 18.37P=0.0006
性别 × 基因型 × 温度0.00590310.005903F (1, 16) = 8.032P=0.0120
残差0.01176160.0007349

表2：攀爬能力的方差分析（> 15 cm）在 果蝇.

SSDFMSF (DFn, DFd)P 值
基因型4.363E-0714.363E-07F (1, 16) = 32.38P<0.0001
温度3.141E-0713.141E-07F (1, 16) = 23.31P=0.0002
性别3.439E-0713.439E-07F (1, 16) = 25.52P=0.0001
基因型 × 温度5.333E-0915.333E-09F (1, 16) = 0.3958P=0.5381
基因型 × 性别1.765E-0811.765E-08F (1, 16) = 1.310P=0.2692
温度 × 性别3.336E-0713.336E-07F (1, 16) = 24.76P=0.0001
基因型 × 温度 × 性别6.513E-0916.513E-09F (1, 16) = 0.4834P=0.4968
残差2.156E-07161.347E-08

表3：Drosophila体重测量值的方差分析。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ent 是一种在进化上保守的蛋白质，可影响多种生物学过程38在非洲爪蟾卵母细胞中表达时， Ent2 具有核苷转运活性8研究表明，纯合突变体 Ent2 在幼虫晚期或蛹期早期具有致死性10在本研究中，建立了一种基于CRISPR/Cas9的基因组编辑工作流程，用于生成 Ent2靶向等位基因在 果蝇 黑腹果蝇纯合突变体在品系建立过程中表现出的致死性与先前报道一致，支持了基因组编辑策略的有效性。在此框架下， Ent2*/CyO 本研究构建的杂合子品系为部分基因功能缺失相关表型特征的记录提供了模型 Ent2在所测试的实验条件下，观察到个体之间在体型、体重、运动活性以及抗氧化酶水平方面存在差异 Ent2*/CyO 和 w1118 果蝇。这些观察结果描述了已建立的突变品系的表型特征。

在发育和体型方面，Ent2*/CyO 杂合个体在 22 °C 和 25 °C 下均显著小于 w1118 果蝇。这种差异可能是由于 Ent2 基因缺失导致核苷转运效率降低，进而影响能量代谢稳定性和蜕皮素调控所致。此外，该不利效应在 25 °C 时更为显著。研究表明，动物寿命受代谢率影响，这一概念被称为代谢率理论19。本研究结果提示，果蝇在较高温度下升高的代谢率可能与核苷代谢障碍所导致的营养缺乏和发育延迟密切相关。然而，由于仅使用了单个 CRISPR 源等位基因，这些发现应被视为描述性观察结果，而非基因功能的直接证据。

在多个表型读数中也观察到明显的温度依赖性变异。该突变体在22 °C时表现出轻微的寿命延长，尤其是在雌性中，这一发现与先前的研究结果一致39,40。相比之下，在25 °C时，寿命差异减小甚至消失。作为变温生物，果蝇在较高温度下具有更高的代谢速率，因而寿命更短41,42，这与本研究的结果相符。在此背景下，所观察到的模式可能反映了对温度的一般生理响应。

运动能力及抗氧化酶活性在不同基因型、性别和温度条件下也存在差异。在特定条件下，Ent2/CyO 果蝇表现出爬行能力下降以及 SOD 和 CAT 活性降低。既往研究已将核苷转运蛋白与 NAD⁺ 代谢、线粒体功能及氧化应激调控相关联17,43,44,45,46,47。尽管这些研究提供了可能的生物学背景，但当前数据仅限于表型特征描述，尚未建立 Ent2 与这些通路之间的机制性联系。

我们的结果还表明，在相同条件下，雄性果蝇通常比雌性果蝇表现出更高的抗氧化酶活性39,48。这意味着性别相关因素可能通过不同的信号通路调节抗氧化反应。与抗氧化反应相关的转录因子（如 Nrf2/CncC）及其下游靶基因在不同性别之间表现出表达差异，从而影响整体的抗氧化能力49。该观察结果与关于黑腹果蝇（Drosophila）中氧化应激抵抗和抗氧化防御存在性别差异的报道一致：雌性通常维持较低的活性氧（ROS）水平和较高的基础抗氧化酶活性，相较于雄性，这可能有助于两性在应激抵抗能力和寿命上的差异50。这些发现进一步强调了在表征突变体表型时考虑性别等生物学变量的重要性。

从方法学角度来看，本研究概述了一种可重复的工作流程，用于生成和验证CRISPR/Cas9介导的突变 果蝇gRNA的精确设计与筛选至关重要，因为高效的gRNA能够决定Cas9靶向切割的效率，并最大限度地减少非预期的修饰。21,51将Cas9和gRNA组分高精度显微注射到胚胎中也至关重要，因为注射效率低下可能导致编辑效率降低或产生嵌合体52通过测序进行充分的基因型验证，可确保目标编辑的存在，并排除脱靶效应或不完全编辑，从而增强模型的完整性53值得注意的是，由于纯合突变体具有致死性，使用 CyO 平衡染色体对于维持 Ent2 突变等位基因至关重要。该方法在果蝇遗传学研究中被广泛应用 黑腹果蝇 通过遗传学方法保留有害突变并实现下游分析。本研究展示了该策略在CRISPR/Cas9基因编辑框架中的实际应用。

应当承认存在若干局限性。首先，表型分析仅使用了单个CRISPR衍生的突变品系。众所周知，CRISPR/Cas9编辑可能产生异质性等位基因，通常建议分析多个独立的品系以增强遗传结论的可靠性。因此，本文报道的结果应被视为对一个突变等位基因的初步表征。未来需要纳入更多独立生成的Ent2等位基因进行研究，以提高结论的稳健性。其次，突变品系使用CyO平衡染色体进行维持，而对照组（w1118）不携带平衡染色体。由于平衡染色体本身可能影响发育和生理特征，缺乏染色体平衡匹配的对照构成了潜在的混杂因素。在解释不同基因型之间的表型差异时，应考虑这一局限性。第三，湿度、光周期和饮食等环境条件虽维持在标准实验室条件下，但未进行系统性变化。由于这些因素可能影响代谢和应激反应，未来若引入受控的环境梯度研究，将有助于更全面地评估表型与环境之间的相互作用。

综上所述，本研究建立了一种基于CRISPR/Cas9的技术流程，用于在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中产生并维持Ent2突变等位基因，并在不同环境条件下对所获得的杂合品系进行了描述性表征。研究结果突显了该方法在研究具有致死表型基因中的适用性，同时强调了实验设计中需考虑的因素，包括遗传背景、平衡染色体以及环境变量。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有作者均无利益冲突需要声明。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究由吉林省科技发展计划项目（项目编号：20230505044ZP）提供支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙酸铵Sigma A1542
过氧化氢酶（CAT）检测试剂盒（可见光法）（钼酸铵法）南京建成生物工程研究所A007-1-1
十二烷基硫酸盐SigmaL3771
注射装置Eppendorf FemtoJet 4i
线性化质粒：MLM3613Addgene42251
显微镜OLYMPUS CKX3-SLP
mMESSAGE mMACHINE T7 试剂盒Thermo FisherAM1344
mMESSAGE mMACHINE T7 转录试剂盒Thermo FisherAM1344
PmeI 限制性内切酶NEB R0560S
多聚（A）聚合酶NEBM0276S
蛋白酶 KThermo FisherEO0491
RNeasy Mini 试剂盒QIAGEN74104
T7 RiboMAX Express 大规模 RNA 生产系统Promega P1320
T7 RiboMAX 试剂盒Promega P1320
总超氧化物歧化酶（T-SOD）检测试剂盒（羟胺法）南京建成生物工程研究所A001-1
w1118 Drosophila 方静生物
水饱和酚/氯仿SigmaP2069

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