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方法文章

从同一食管癌患者建立肿瘤类器官、癌相关成纤维细胞及配对正常成纤维细胞

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DOI：

10.3791/69548

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2026年4月3日

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1Department of Esophageal and Gastroenterological Surgery, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 2Department of Molecular Pathogenesis, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 3Department of Pathology and Oncology, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 4Faculty of Health Sciences, Graduate School of Medicine, Juntendo University

本文内容

摘要

本方案描述了一种从同一食管鳞状细胞癌（ESCC）患者中同时分离癌类器官、癌相关成纤维细胞（CAFs）和非肿瘤相关成纤维细胞（CFs）的方法。使用这些来自同一患者的匹配样本可避免个体间差异带来的问题，为ESCC研究提供合适的实验平台。

摘要

在食管鳞状细胞癌（ESCC）中，治疗耐药性的获得和肿瘤复发仍是主要的临床挑战。癌相关成纤维细胞（CAFs）是肿瘤微环境的关键组分，已知可影响 ESCC 的进展及治疗反应。然而，CAFs 在肿瘤恶性行为中的诸多作用仍不明确，这可能归因于 ESCC 患者之间的个体差异。目前可用于研究的多种人 ESCC 细胞系被认为在一定程度上模拟了人类癌组织的特性。这些细胞系也可被传代培养 体外 多年来，细胞在培养皿中长期培养，导致其适应了体外培养条件。此外，人食管鳞状细胞癌（ESCC）细胞系在不同原发患者中存在多种不同的遗传和表观遗传改变，从而导致患者间的异质性。然而，以往大多数研究在实验中使用的是与患者不匹配的癌相关成纤维细胞（CAFs），并依赖于长期培养的癌细胞系。每种癌细胞系内部以及癌细胞与CAFs之间的患者间异质性，可能导致实验结果的可重复性和可靠性降低。为消除患者间异质性，本研究从同一患者体内分离出三种不同的细胞类型：从手术切除的ESCC组织中获取的癌类器官和CAFs，以及从相邻非肿瘤组织区域分离的对应成纤维细胞（CFs），作为患者特异性的CAFs对照。本文提供了一项详细的操作方案，可实现癌类器官、CAFs和CFs的同步分离。癌类器官在三维培养条件下生长良好。CAFs和CFs均对波形蛋白（vimentin）呈阳性染色，该蛋白是成纤维细胞的标志物之一，表明这些细胞在成纤维细胞谱系中得到了有效富集。本方案使我们能够建立ESCC类器官及与之匹配的患者源性成纤维细胞，为研究肿瘤与间质间的相互作用提供了一个排除患者间异质性的宝贵实验平台。

引言

食管癌在全球范围内具有较高的发病率和死亡率1。该病主要分为两种组织学亚型：食管鳞状细胞癌（ESCC）和食管腺癌（EAC）2。其中，ESCC 比 EAC 更为常见，尤其在东亚和非洲地区发病率更高3。目前针对 ESCC 的治疗策略相对明确4,5。对于局限于黏膜层的早期病变，内镜下切除是一种根治性且微创的治疗选择。对于局部进展但可切除的病例，新辅助放化疗联合食管切除术已被证实具有临床疗效。而对于不可切除或转移性病例，全身化疗仍是主要治疗手段。然而，治疗耐药和疾病复发仍是当前面临的主要临床挑战。

肿瘤不仅由癌细胞组成，还包含复杂的肿瘤微环境，后者由多种间质细胞类型构成。其中，癌相关成纤维细胞（CAFs）是肿瘤微环境的主要细胞成分，已被证明在肿瘤进展及治疗反应中发挥关键作用6,7,8,9。在食管鳞状细胞癌（ESCC）中，CAFs参与肿瘤恶性行为及治疗耐药性的报道也日益增多10,11,12。然而，CAFs在ESCC恶性进展中的确切分子机制仍 largely 不清楚。

在以往大多数研究中，癌症相关成纤维细胞（CAFs）对癌细胞的作用通常是利用在培养皿中传代多年甚至数十年的多种食管鳞状细胞癌（ESCC）细胞系进行评估的。这类细胞系会逐渐适应体外培养条件，与原始肿瘤的特征相差甚远13。此外，ESCC细胞系来源于不同患者，携带多种遗传和表观遗传改变，导致各ESCC细胞之间存在明显的个体间差异。因此，使用不同ESCC细胞系所得的实验结果常常彼此不一致。基于此，若实验中采用不同的ESCC细胞系与患者来源不匹配的CAFs，可能难以以可重复且可靠的方式精确解析这些细胞间的相互作用。

为解决这些局限性，已建立一种实验方案，可从同一食管鳞状细胞癌（ESCC）手术标本中同时分离获得患者匹配的肿瘤类器官、癌症相关成纤维细胞（CAFs）以及非肿瘤对应的成纤维细胞（CFs）。患者来源的类器官通常能够重现原发肿瘤的关键结构和表型特征，同时保留其分子异质性。所建立的类器官在三维（3D）培养条件下形成球状结构，并表现出稳定的增殖能力。通过波形蛋白（vimentin，一种成纤维细胞标志物）阳性确认，CAFs 和 CFs 均富集了成纤维细胞群体。

本方案提供了组织处理、酶解离、类器官接种、CAFs/CFs分离、传代及冻存的详细且可重复的操作步骤。为帮助研究人员在实施前评估其适用性，本方案包含了实用信息：类器官通常在3–5天内形成，7–10天内达到传代条件，并可稳定扩增超过十代；CAFs和CFs可传代至少八代；类器官和成纤维细胞可在约20天内完成冻存。类器官的建立成功率约为70%，CAFs和CFs的建立成功率约为80%。此外，本方案还包括经验证的条件培养基实验，使用CAFs或CFs的条件培养基，为评估基质细胞对肿瘤类器官行为的旁分泌效应提供了可靠方法。综上，该匹配的肿瘤类器官–基质共培养平台为研究食管鳞状细胞癌（ESCC）肿瘤–基质相互作用提供了一个实验上易于操作且具有生物学相关性的模型，并有助于推动精准治疗策略的开发。

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方案

所有涉及人体组织的操作必须在适当的机构生物安全批准下，并于经认证的生物安全柜中进行。患者已签署书面知情同意书，本项目已获得顺天堂大学医学院研究伦理委员会的批准。图2至图6所示操作流程的概览见图1。食管鳞状细胞癌类器官培养基（Eso_v1）中各组分的组成与浓度依据Kijima等14及其他研究15,16,17确定，仅做了少量修改。所用试剂与设备列于材料表中。

1. 试剂与组织制备

  1. 准备试剂和设备。
    1. 在开始操作前，对所有器械（包括剪刀、镊子和移液器）进行灭菌处理。
    2. 在15 mL离心管中准备10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）。
    3. 准备低吸附性的15 mL离心管，并根据样本来源进行标记（例如，肿瘤冲洗管（A）、肿瘤消化管（B）、非肿瘤冲洗管（C）、非肿瘤消化管（D））。
    4. 通过吸取并排出胎牛血清（FBS）2–3次，对工作用移液器进行包被，以减少处理过程中细胞的黏附。
      注：FBS包被可防止组织碎片在机械解离过程中黏附于塑料表面。
  2. 制备酶溶液
    1. 通过将2.7 mL含10% FBS和1×青霉素-链霉素（PS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）（以下简称DMEM/10% FBS）、0.3 mL 10 mg/mL胶原酶、0.15 mL 10000 PU/mL分散酶以及0.03 mL 2.5 µg/mL两性霉素B混合，制备用于肿瘤消化的酶溶液I，并在37 °C预热。
    2. 通过将2.7 mL DMEM/10% FBS、0.3 mL 10 mg/mL胶原酶和0.03 mL 2.5 µg/mL两性霉素B混合，制备用于非肿瘤组织消化的酶溶液II，并在37 °C预热。
      注：胶原酶和分散酶有助于肿瘤组织的解离。
  3. 制备类器官培养基
    1. 制备含60%类器官基础培养基、40% L-WRN条件培养基18（见步骤1.4）、50 ng/mL EGF（生长因子）、1 mM N-乙酰-L-半胱氨酸（抗氧化剂）、5 mM烟酰胺（水溶性维生素）、500 nM A83-01（TGF-βR抑制剂，用于抑制成纤维细胞生长）、1× B-27（无血清培养补充剂）、1× N-2（无血清培养补充剂）以及10 µM Y-27632（ROCK抑制剂）的食管鳞状细胞癌（ESCC）类器官培养基（Eso_v1培养基）。
    2. 使用前将培养基平衡至37 °C。
      注：L-WRN条件培养基（L-WRN细胞的上清液）提供类器官启动所必需的WNT、R-脊椎蛋白和Noggin信号。Y27632在整个培养期间均保留在培养基中。
  4. 制备L-WRN条件培养基
    1. 解冻一管L-WRN细胞，将其接种至100 mm培养皿中，加入10 mL DMEM/10% FBS，培养1–2天。
    2. 更换为含G418（终浓度500 µg/mL）和潮霉素B（终浓度500 µg/mL）的10 mL DMEM/10% FBS，培养至细胞融合度达80%。
    3. 将细胞传代至两个100 mm培养皿中，每皿加入10 mL含G418和潮霉素B的DMEM/10% FBS，培养至细胞融合度达100%。
    4. 将细胞传代至五个150 mm培养皿中，每皿加入20 mL不含抗生素的DMEM/10% FBS，培养至细胞融合度达100%。
    5. 吸除并弃去每个150 mm培养皿中的培养基。
    6. 每皿加入25 mL收集培养基（类器官基础培养基中添加5% FBS）。
    7. 孵育24小时。
    8. 将五个培养皿中的培养基（25 mL × 5 = 125 mL）收集至一个无菌玻璃瓶中。
    9. 重复步骤1.4.6–1.4.8，共收集8次（目标总收集体积：约1,000 mL）。
    10. 使用瓶顶滤器对混合的条件培养基进行无菌过滤。
    11. 将滤液分装为每管40 mL，共25管，装入无菌的50 mL离心管中。
    12. 将分装样品储存于−80 °C。
  5. 制备成纤维细胞培养基
    1. 制备成纤维细胞培养基-1。
    2. 使用前将培养基平衡至37 °C。
  6. 准备组织处理培养皿
    1. 使用P1000移液器吸头将数滴（三至五滴）FBS滴加至两个100 mm培养皿中，形成包被层（肿瘤组织用培养皿T，非肿瘤组织用培养皿N）。
      注：FBS包被有助于更顺畅的机械剪切，并防止小组织碎片黏附于培养皿表面。
  7. 组织处理与样本识别
    1. 确认肿瘤和非肿瘤样本在运输过程中置于冰上。
    2. 将组织置于含有少量DMEM/10% FBS的60 mm培养皿中，并在冰上保存直至使用。应在手术切除后16小时内开始处理，以维持组织活性。
    3. 通过其较硬的质地和不规则的表面形态识别肿瘤组织，这些特征与非肿瘤组织不同。

2. 组织处理、洗涤与酶消化

注意：此步骤旨在使用不同的酶溶液消化切碎的肿瘤和非肿瘤组织切片。

  1. 切碎肿瘤和非肿瘤组织
    1. 将每份组织样本（约 5 mm × 5 mm）转移至相应的FBS包被培养皿中（Dish T 用于肿瘤组织，Dish N 用于非肿瘤组织）。
    2. 使用无菌手术刀将每份组织切碎成约 0.5 mm 的组织碎片。
      注意：更小的组织碎片可提高酶的可及性，从而改善消化效率。
  2. 洗涤切碎的组织。
    1. 用FBS包被一支10 mL移液管，以防止组织黏附。
    2. 使用FBS包被的移液管向每只培养皿中加入5 mL PBS，并轻轻重悬切碎的组织。
    3. 将悬液转移至相应的肿瘤洗涤管（Tube A）或非肿瘤洗涤管（Tube C）中。
    4. 重复步骤 2.2.2 和 2.2.3（总体积：10 mL）。
    5. 室温静置2分钟，吸除上清液，底部保留约 0.5–1 mL PBS及组织。
    6. 使用新的移液管加入10 mL新鲜PBS；移液管经FBS包被后，用力吹打悬液以促进组织分散，同时避免产生气泡。
      注意：用力吹打有助于机械解离，并去除血液和黏液。避免气泡可防止剪切力导致的细胞裂解。所有洗涤步骤均旨在去除碎片。
    7. 室温静置2分钟，吸除上清液，底部保留约 0.5–1 mL PBS及组织。
    8. 重复洗涤步骤（步骤 2.2.6 和 2.2.7）两次，共完成三次洗涤。
  3. 将组织转移至消化管。
    1. 使用新的移液管加入10 mL新鲜PBS；移液管经FBS包被后，将肿瘤组织转移至肿瘤消化管（Tube B），非肿瘤组织转移至非肿瘤消化管（Tube D）。
    2. 室温静置2分钟，吸除上清液，底部保留约 0.5 mL PBS及组织。
  4. 进行酶消化。
    1. 肿瘤组织消化
      1. 将酶溶液 I（胶原酶 + 分散酶）全部加入肿瘤消化管（Tube B）中。
      2. 37 °C 条件下孵育 2 小时，并轻柔旋转。
    2. 非肿瘤组织消化
    3. 将酶溶液 II（仅含胶原酶）全部加入非肿瘤消化管（Tube D）中。
      1. 37 °C 条件下孵育 4 小时，并轻柔旋转。
    4. 根据样本来源，继续进行步骤 3（肿瘤样本处理）或步骤 6（对应成纤维细胞接种）。
      注意：用于消化肿瘤和非肿瘤组织的酶种类及处理时间均基于前期实验优化确定。肿瘤组织通常含有致密的细胞外基质；胶原酶联合分散酶可增强消化能力。

3. 类器官和CAFs分离的肿瘤样本处理

注意：此步骤旨在从相同的消化后肿瘤样本中分离上皮肿瘤细胞以进行类器官培养，以及分离间质成纤维细胞（CAFs）。

  1. 过滤并收集肿瘤来源的细胞。
    1. 将一个100 µm细胞筛置于50 mL锥形管上。
    2. 通过向筛中加入3 mL DMEM/10% FBS预润湿。
      注意：预润湿可防止细胞黏附于干燥的筛网纤维，从而减少细胞损失。
    3. 使用经FBS包被的P1000吸头将肿瘤消化管（B管）中的全部内容物转移至筛网上，以去除未消化的组织碎片。
    4. 再加入6 mL DMEM/10% FBS冲洗，使残留的细胞团通过筛网。
    5. 移除细胞筛，并将滤液重新收集至B管（也可使用新的低吸附性15 mL离心管）。
  2. 洗涤并浓缩滤液。
    1. 在4 °C条件下，以300 × g离心5分钟。
    2. 使用一次性移液管弃去上清液。
    3. 加入10 mL DMEM/10% FBS，轻轻颠倒混匀后，再次在300 × g离心5分钟。
    4. 小心吸除上清液，保留沉淀。
    5. 使用P200移液器将剩余体积调整至40 µL。
  3. 分配细胞用于类器官和CAFs培养。
    1. 取30 µL用于类器官接种。
    2. 取10 µL用于CAFs接种。
      ​注意：该比例经经验验证，可为上皮细胞和成纤维细胞群体的平行扩增提供足够数量的细胞。

4. 类器官接种（三维培养）

注意：此步骤旨在利用肿瘤来源的细胞悬液建立食管鳞状细胞癌类器官。

  1. 制备基底膜基质小滴。
    1. 将标准的24孔板预热至37 °C。
      注意：预热培养板可加速基底膜基质小滴的凝固。
    2. 将30 µL肿瘤来源的悬液与90 µL冰上预冷的基底膜基质（1:3比例）混合。
    3. 每孔加入30 µL，共加四个孔。
    4. 将小滴在CO₂培养箱中孵育15分钟，使其凝固。
  2. 添加类器官培养基
    1. 使用预混的补充剂（如FGF10、SB202190以及抗生素，例如1×两性霉素B和100 µg/mL Primocin，如使用）配制类器官培养基。
      注意：第1孔：Eso_v1；第2孔：Eso_v1 + 10 µM SB202190；第3孔：Eso_v1 + 100 ng/mL FGF10；第4孔：Eso_v1 + 10 µM SB202190 + 100 ng/mL FGF10（终浓度）。
    2. 沿孔壁轻轻加入1 mL培养基至每个孔中。
    3. 在标准CO₂培养条件下孵育。
    4. 每3–5天更换一次培养基。
      ​注意：预混补充剂可避免将微量液体直接吹打到脆弱的基底膜基质小滴上。抗生素仅在类器官建立后的前6天内添加。培养条件（是否添加FGF10、是否添加SB202190）应根据生长速率和形态（优选球形）确定。
  3. 监测类器官形成。
    1. 每天使用倒置显微镜观察小滴。
      注意：预期形态：第3–5天 → 可见球状体；第7–10天 → 致密球状体，可进行传代。
    2. 当类器官大小达到约100–200 µm，或小滴内密度达到90%及以上时，进行传代。

5. CAF 接种

注意：此步骤用于从肿瘤来源的细胞悬液中建立癌相关成纤维细胞（CAFs）。

  1. 将CAF接种到胶原包被的培养皿中。
    1. 准备一个含有1.5 mL成纤维细胞培养基-1的胶原包被60 mm培养皿。
    2. 加入分配用于CAF接种的10 µL肿瘤滤液。
    3. 添加抗生素，如1×两性霉素B和100 µg/mL Primocin。
    4. 在标准CO₂培养条件下孵育。
    5. 每3–5天更换一次培养基。
      注：根据经验，成纤维细胞培养基-1通常比其他培养基更适用于CAF和CF的初始建立和生长。抗生素仅在前6天添加。
  2. 监测CAF生长
    1. 从第3–5天开始，监测是否出现成纤维细胞样的纺锤形形态。
    2. 当细胞融合度达到90%–100%时进行传代。
      注：如果发生上皮细胞污染，可通过调整胰酶消化时间选择性分离成纤维细胞，因为在传代过程中成纤维细胞比上皮细胞更快速脱落。

6. CF 接种

注意：此步骤旨在从邻近的非肿瘤组织中获取与患者匹配的成纤维细胞（CFs）。

  1. 清洗并制备非肿瘤组织消化液。
    1. 将非肿瘤消化管（D管）在300 × g 条件下离心5分钟。
    2. 使用一次性移液管移除上清液。
    3. 加入10 mL DMEM/10% FBS，轻轻颠倒混匀，然后再次在300 × g 条件下离心5分钟。
    4. 小心吸除上清液，保留沉淀。
    5. 重复步骤6.1.3和6.1.4一次。
  2. 将成纤维细胞（CFs）接种至胶原包被的培养皿中
    1. 将全部悬液转移至含有1.5 mL成纤维细胞培养基-1的胶原包被60 mm培养皿中。
    2. 加入抗生素，如1×两性霉素B和100 µg/mL Primocin。
    3. 在标准CO₂培养条件下孵育。
    4. 每3–5天更换一次培养基。
      注意：抗生素仅在前6天添加。
  3. 监测成纤维细胞（CFs）的生长情况。
    1. 从第3–5天开始观察成纤维细胞样的纺锤形形态。
    2. 当细胞融合度达到90%–100%时进行传代。

7. 类器官传代与冷冻保存

  1. 类器官传代。
    注意：此步骤的目的是在类器官达到适当密度后进行扩增。
    1. 吸除旧培养基，并用 1 mL PBS 洗涤每孔。
    2. 向每孔加入 0.5 mL 预热的类器官用胰蛋白酶。
    3. 使用 P1000 吸头剧烈吹打，利用吸头边缘破坏基底膜基质凝胶圆顶结构。
      注意：机械剪切有助于分解致密的基底膜基质，提高酶的接触效率。
    4. 在 CO₂ 培养箱中孵育 10–15 分钟，直至所有凝胶团块溶解，将类器官解离为含 20–50 个细胞的细胞团。
      注意：避免完全解离为单细胞，因其会降低细胞活力。
    5. 将悬液收集至低吸附性 15 mL 离心管中。
    6. 用 0.5 mL DMEM/10% FBS 洗涤每孔 4 次，并将所有洗涤液转移至同一低吸附性离心管中。
    7. 以 300 × g 离心 5 分钟。
    8. 弃上清，将沉淀重悬于少量 DMEM/10% FBS 中，并调整悬液体积至 80 µL。
    9. 将 80 µL 类器官悬液与 240 µL 冰冷的基底膜基质（1:3 比例）混合。
    10. 将混合物接种至预热的 6 孔板（37 °C），每孔形成 4–6 个凝胶圆顶。
    11. 让凝胶圆顶静置固化 15 分钟，然后每孔加入 3 mL Eso_v1 培养基（即步骤 4.2 初始培养中最优的培养基成分）。
    12. 每 3–5 天更换一次培养基。
      注意：当类器官直径达到约 100–200 µm 或凝胶圆顶拥挤程度超过 90% 时进行传代。不进行细胞计数。常规传代时，类器官按 1:4 至 1:10 的比例分瓶。预期在 48–72 小时内快速重新形成球状结构。
  2. 类器官冷冻保存
    1. 用 3 mL PBS 洗涤每孔。
    2. 向每孔加入 1.5 mL 类器官用胰蛋白酶，剧烈吹打后孵育 10 分钟。
    3. 将全部悬液转移至低吸附性 15 mL 离心管中，并用培养基冲洗每孔 4 次。
    4. 以 300 × g 离心 5 分钟，弃去上清。
    5. 将沉淀重悬于 2 mL 90% FBS/10% DMSO 中。
    6. 将 0.5 mL 分装至每个冻存管中。
    7. 将冻存管放入程序降温盒中，于 −80 °C 过夜保存。
    8. 将冻存管转移至液氮中进行长期保存。
      ​注意：当类器官直径达到约 100–200 µm 或凝胶圆顶拥挤程度超过 90% 时进行冻存。
  3. 冻存类器官的复苏
    1. 在 37 °C 水浴中快速解冻冻存管。
    2. 将内容物转移至含 5 mL DMEM/10% FBS 的 15 mL 离心管中。
    3. 以 300 × g 离心 5 分钟。
    4. 弃上清，将沉淀重悬于 40–60 µL DMEM/10% FBS 中。
    5. 将细胞悬液与冰冷的基底膜基质按 1:3 比例混合。
    6. 将混合物接种至预热的 6 孔板（37 °C），每孔形成 4–6 个凝胶圆顶。
    7. 让凝胶圆顶静置固化 15 分钟，然后每孔加入 3 mL Eso_v1 培养基（即步骤 4.2 初始培养中最优的培养基成分）。

8. 成纤维细胞传代与冷冻保存

  1. CAF 和 CF 的传代
    注意：此步骤的目的是在成纤维细胞达到适当密度后进行扩增。
    1. 用 2 mL PBS 清洗培养皿。
    2. 加入 0.4 mL 0.25% 胰蛋白酶。
    3. 在 CO₂ 培养箱中孵育 5 分钟，并在显微镜下观察细胞脱落情况。
    4. 用 DMEM/10% FBS 中和胰蛋白酶，将整个细胞悬液转移至含有 10 mL 培养基的 100-mm 培养皿中。
      注意：当成纤维细胞融合度达到 90%–100% 时进行传代。常规传代时按 1:3 的比例分瓶。经验表明，当细胞密度较低时，成纤维细胞的增殖速度会减慢或停止。
  2. 成纤维细胞的冷冻保存
    1. 用 5 mL PBS 清洗细胞。
    2. 加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶，然后在 CO₂ 培养箱中孵育 5 分钟。
    3. 用 DMEM/10% FBS 中和胰蛋白酶，将整个细胞悬液转移至 15 mL 离心管中。
    4. 以 300 × g 离心 5 分钟。
    5. 将细胞沉淀重悬于 2 mL 90% FBS/10% DMSO 中。
    6. 每支冻存管分装 0.5 mL。
    7. 将冻存管放入冻存盒中，于 −80 °C 过夜保存。
    8. 将冻存管转移至液氮中进行长期保存。

9. 条件培养基实验

注意：此步骤的目的是利用条件培养基（CM）评估成纤维细胞对食管鳞状细胞癌（ESCC）肿瘤类器官的旁分泌作用。当直接共培养体系尚未优化时，该实验可提供一种可重复的间质-肿瘤相互作用模型。

  1. 制备CAF/CF条件培养基
    1. 将相同数量的CAF或CF接种于60 mm培养皿中，加入3 mL DMEM/10% FBS培养基，培养至细胞融合度达80%–90%。
    2. 用2 mL PBS洗涤细胞一次。
    3. 加入3 mL DMEM/2% FBS培养基。
    4. 在CO₂培养箱中孵育48小时。
    5. 将上清液收集至15 mL离心管中。
    6. 以2000 × g 离心5分钟，去除细胞碎片。
    7. 取2.5 mL上清液转移至新的15 mL离心管中。
    8. 将条件培养基分装为100–500 µL每份，于-80 °C保存。
  2. 制备类器官检测培养基
    1. 按照步骤1.3所述方法配制ESCC类器官培养基。
    2. 将类器官培养基与条件培养基按1:1比例（50% v/v）混合。
  3. 使用类器官检测培养基培养肿瘤类器官
    1. 按照步骤7所述进行类器官传代后，将类器官接种至预热（37 °C）的48孔板中，每孔接种于20 µL基底膜基质形成的液滴内。
    2. 待液滴凝固后，向每孔加入0.3 mL类器官检测培养基。
    3. 每3–7天更换一次类器官检测培养基。
    4. 观察并评估肿瘤类器官的形态和大小。
      ​注意：所有来源于人体的材料均视为具有潜在感染性。操作时必须穿戴适当个人防护装备，包括手套、口罩和护目镜。胶原酶、分散酶和二甲基亚砜（DMSO）可能引起皮肤、眼睛和呼吸道刺激，因此应避免直接接触和吸入。所有涉及人体组织的酶处理操作均须遵循机构生物安全指南。含有人体组织的液体废弃物应收集于密封的生物危害容器中，并经高压灭菌后处理。化学废弃物（包括DMSO和酶溶液）应按照机构危险废弃物处理规定进行处置。所有可重复使用的器械在重复使用前须用70%乙醇冲洗并高压灭菌。

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结果

组织样本取自食管鳞状细胞癌（ESCC）患者手术切除的肿瘤区域以及距肿瘤3 cm的相邻非肿瘤区域，该患者未接受新辅助化疗。肿瘤区域用于分离癌类器官和癌相关成纤维细胞（CAFs），而非肿瘤区域用于分离正常成纤维细胞（CFs）。手术组织被切成约0.5 mm大小的组织块（图2A），随后进行酶消化处理，进而分别分离出癌类器官和成纤维细胞。类器官和成纤维细胞需要大约18–21天的培养时间，以生长至可用于冷冻保存的细胞储备状态。

肿瘤类器官在3–5天内形成可见的球状体，并在7–10天达到传代准备状态。来源于肿瘤组织的类器官表现出稳定的形态，成功传代≥10次，在相差显微成像下形成一致的球状结构。比较培养第2天与第3天的情况，第3天时球状体的数量和尺寸均显著增加（图2B）。此外，球状体数量持续稳定增加，直至第6天（图2C）。这些结果表明所建立的肿瘤类器官具有活跃的增殖能力。大多数肿瘤类器官在维持良好定义的球形形态的同时持续...

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讨论

既往研究采用癌症类器官及患者匹配的癌相关成纤维细胞（CAFs），探究CAFs在人结肠癌、乳腺癌、胰腺癌以及头颈部癌症中对增殖和耐药性的作用20,21,22,23,24。这些研究表明，CAFs可影响肿瘤细胞的增殖和药物抵抗能力。然而，据目前所知，尚无已发表的研究报道将癌症类器官与患者匹配的CAFs用于食管鳞状细胞癌（ESCC）的实验研究。

本研究建立了一种从同一食管鳞状细胞癌（ESCC）患者样本中同时分离癌类器官、癌相关成纤维细胞（CAFs）和癌旁成纤维细胞（CFs）的实验方案，其中CFs可作为患者特异性的CAFs对照。在多个样本中，癌类器官的建立成功率约为70%，而CAFs和CFs的建立成功率均约为80%。这三种细胞群体在体外培养中均能稳定良好地增殖。该模型系...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究得到了顺天堂大学青年研究者奖（2024年和2025年）以及日本文部科学省科学研究费补助金（23K07362、21K08693）对P. Z.的资助。我们谨向病理科与肿瘤科以及食管与胃肠外科全体成员致以诚挚的感谢。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100 mm 培养皿TPP93100
100 倍青霉素-链霉素溶液（PS）Nacalai26253-84
15 ml 离心管FastGeneFG2001
24 孔细胞培养板TPP92024
48 孔细胞培养板TPP92448
50 ml 离心管FastGeneFG2004
60 mm 培养皿TPP93060
6 孔细胞培养板TPP92006
A83-01Cayman9001799
Advanced DMEM/F12 Gibco12634010类器官基础培养基 = Advanced DMEM/F12 + GlutaMAX + 1× PS
Alexa488 标记抗小鼠 IgG 抗体InvitrogenA11029
两性霉素 BThermoFisher15290018
抗波形蛋白抗体（V9）Santa Cruzsc-6260使用时稀释比例为 1/500
B-27ThermoFisher17504044
瓶口滤器Sartorius180F15
细胞筛，孔径 100 µmBD Falcon352360
胶原酶 I 型SIGMAC0130
胶原蛋白包被 60 mm 培养皿IWAKI4010-010
二甲基亚砜（DMSO）Wako043-07216
Dispase IGODO SHUSEI386-02271
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）Nacalai08459-64
ECLIPSE Ti2Nicon
胎牛血清（FBS）SERANAS-FBS-CO-015
成纤维细胞生长培养基 2PromoCellC-23020成纤维细胞培养基-1 = 成纤维细胞生长培养基 2
G418Invivogenant-gn-1
GlutaMAX Gibco35050061
HFDM-1KSK87-160成纤维细胞培养基-2 = HFDM-1 + 1% FBS + 1 × PS
Hoechst33342 Nacalai04929-82
潮霉素Invivogenant-hg-1
IncuCyte 系统Essen BioScience
L-WRN 细胞ATCCCRL-3276
MatrigelCorning354234基底膜基质 = Matrigel
N2ThermoFisher17502048
N-乙酰-L-半胱氨酸Wako017-05131
烟酰胺TCIN0078
磷酸盐缓冲液（PBS）Nacalai14249-24
PrimocinInvivogenant-pm-05
重组人 EGFPEPROTECHAF-100-15
重组人 FGF-10PEPROTECHPEP-100-26
SB202190SelleckS1077
手术刀片，11 号Feather8-3086-02
STEMFULL住友电木MS-90150低吸附 15 mL 管 = STEMFULL
TrypLE ExpressGibco12605028类器官用胰蛋白酶 = TrypLE Express
胰蛋白酶Nacalai35556-44
Y-27632SelleckS1049

参考文献

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