多聚谷氨酰胺脊髓小脑性共济失调由CAG重复扩增引起，导致易于聚集的蛋白质产生。本方案描述了载体构建、立体定位注射以及包涵体和神经元标志物丢失的分析方法，为研究神经退行性疾病的发病机制及评估靶向治疗策略提供了一个可控的实验平台。
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摘要
摘要
多聚谷氨酰胺脊髓小脑性共济失调是一组由致病基因编码区内的CAG三核苷酸重复序列突变引起的六种神经退行性疾病。该突变导致蛋白质中出现异常扩增的多聚谷氨酰胺片段，使其易于聚集，进而形成神经元内包涵体，这是此类疾病的典型特征。这些疾病发病机制所涉及的分子通路复杂，目前尚未完全阐明。迄今为止，这些疾病仍无法治愈。明确易损脑区中的分子机制对于开发治疗策略至关重要。尽管此类模型无法完全模拟选择性易损性，但仍需建立灵活且具有区域特异性的实验平台，以快速检验相关机制和干预手段，避免构建多种转基因品系所需的时间和成本。近年来，我们及其他研究团队已开发出多种基于慢病毒的模型，用于研究扩增蛋白在脑内特定区域表达所造成的影响。这些模型表现出与疾病部分特征相似的神经病理学和行为学表型，凸显了其在揭示发病机制及开发新型治疗策略中的重要价值。本文中，我们以脊髓小脑性共济失调2型（SCA2）为例，描述了一种纹状体模型的建立过程。我们重点介绍了慢病毒载体的构建与生产，以及立体定位注射表达扩增型ataxin-2（致病蛋白）的病毒载体的操作方法。最后，我们对两种主要的神经病理学标志进行了表征：包涵体的形成和神经元标志物的丢失。该模型通过提供一个可调控的平台，重现了这些关键的病理特征，为解析神经退行性病变的区域特异性机制以及评估靶向治疗干预措施提供了有力工具。
引言
脊髓小脑性共济失调中的多聚谷氨酰胺病（polyQ SCAs）是一组由多个致病基因中CAG三核苷酸重复序列异常扩增引起的六种常染色体显性遗传神经退行性疾病，这种扩增导致编码蛋白中产生具有毒性的多聚谷氨酰胺（polyQ）片段1。其中最常见的类型是SCA3/马查多-约瑟夫病和SCA22。这些疾病主要影响特定脑区的神经元细胞，包括小脑、脑干以及纹状体等其他区域，从而导致进行性运动失调、步态障碍、严重的神经退行性病变以及早亡3。
为了研究多聚谷氨酰胺（polyQ）性脊髓小脑共济失调（SCAs）并测试治疗策略，已开发出多种动物模型。转基因小鼠、基因敲入品系以及条件性表达小鼠模型已被用于阐明疾病进展的分子基础及相关的细胞通路4,5。然而，构建新的疾病动物模型耗时且成本高昂，通常不适合用于研究脑区在疾病发病机制中的作用6。
基于慢病毒（LV）的小鼠模型为传统模型提供了一种互补的替代方案，具有成本较低以及能够研究大脑特定区域的优势7,8。慢病毒载体可递送较大的转基因片段（最大可达8 kb），能够在特定脑区快速诱导病理变化，而无需进行生殖系修饰，并且适用于不同年龄的动物。将慢病毒载体直接注射到目标脑区，可实现致病基因或治疗基因的区域特异性表达，且相较于其他病毒载体具有较低的免疫原性4。此外，出生后递送可避免发育代偿效应，从而在更接近人类疾病发病条件的情况下研究疾病机制9。通过调整病毒剂量可滴定表达水平，产生严重程度可控的表型，有助于模拟疾病进展的梯度过程。此外，该方法还可根据所选启动子实现细胞类型特异性的基因表达4,7。
多项研究已证明基于慢病毒（LV）的小鼠模型在模拟多聚谷氨酰胺（polyQ）脊髓小脑共济失调（SCAs）方面具有实用性和有效性10,11,12,13。我们及其他研究团队已开发出针对SCA111、SCA212、SCA311,12和SCA714的基于慢病毒的模型，这些模型可用于快速、区域特异性地表达或沉默致病基因，同时再现神经病理学的关键特征。
综上所述，本文所述的慢病毒方法为多聚谷氨酰胺（polyQ）脊髓小脑性共济失调（SCA）的发病机制研究提供了一种多功能且高效的工具。该方法克服了现有动物模型的一些主要缺陷，可加速概念验证研究，并对疾病的发生、定位和严重程度实现更精确的控制——这些特点使其非常适用于治疗药物的筛选以及分子机制的研究。本文介绍了一种可重复的实验方法，用于构建和表征纹状体慢病毒性多聚谷氨酰胺型脊髓小脑性共济失调模型，从而实现对早期致病事件的详细分析以及对候选治疗药物的评估。
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方案
所有动物实验均按照《动物研究：体内实验报告指南》（ARRIVE）以及美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》进行。本研究经葡萄牙食品与兽医局（Direção-Geral da Alimentação e Veterinária，DGAV）批准。实验中使用C57BL/6J小鼠，饲养于标准笼具中，光照周期为12小时光照/12小时黑暗，自由供应食物和水 随意供应.
注意：本方案中使用的材料在材料表中有进一步说明。
1. 慢病毒载体的包装
注意：所有涉及慢病毒载体的操作均须在符合机构安全指南的BSL-2级实验室中进行。我们采用四质粒转染系统，因其相较于其他慢病毒生产系统具有更高的生物安全性（转移质粒的详细信息见图1）。
- 在水浴中解冻 HEK 293T 细胞，并使用添加了 2 mM L-谷氨酰胺、10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）将细胞接种至 T75 培养瓶中。本方案所有步骤均使用该完全 DMEM 培养基。为确保高病毒滴度和实验结果的一致性，请使用传代次数 ≤10 的细胞。
注意：操作前务必检测支原体污染情况。 - 当细胞融合度达到 80%–90% 时，将初始培养物按 1:2 比例传代至 2 个 T175 培养瓶中。将 20 个 100 mm 培养皿每皿接种 3.8 × 106 个细胞（终体积 10 mL），在 37 °C、含 5% CO₂ 的湿润培养箱中孵育 24 小时。使用 Neubauer 血细胞计数板结合台盼蓝排斥法进行细胞计数。
注意：可考虑在培养基中省略青霉素-链霉素，以减少细胞应激，从而最大限度提高细胞转染效率。 - 次日，按照 表 1 所述配制转染混合物。涡旋振荡并短暂离心以混匀。室温孵育 10–20 分钟，使 DNA:PEI 复合物形成。
- DNA:PEI 复合物在室温下形成 15 分钟后，用完全 DMEM 将混合物体积调整至 5 mL。
从每个培养皿中移除 5 mL 培养基（总体积的一半），并替换为 5 mL 转染混合物。此操作可使转染期间的终体积保持为 10 mL。 - 按照 表 1 所述，使用三种包装质粒和一种转移质粒对细胞进行转染。
注意：用于慢病毒生产的所有质粒均应使用无内毒素纯化试剂盒制备。此外，转染前应通过限制性内切酶分析验证质粒完整性，以确认 LTR 区域和转基因表达盒的正确性。 - 将 5 mL 转染混合物逐滴加入每块培养板中，孵育 6 小时。吸除全部培养基，更换为 10 mL 新鲜培养基，继续孵育 48 小时。
注意：为提高病毒滴度，可在 48 小时收集培养基，每块培养板补充 10 mL 新鲜培养基，24 小时后再次收集。先前收集的培养基可在 4 °C 下保存最多 24 小时。该方法可使收集体积加倍，从而提高病毒滴度。 - 使用 0.22 µm 滤器对含有慢病毒载体的所有条件培养基进行过滤。
2. 慢病毒载体的纯化与滴定
- 将过滤后的上清液转移至适当的锥形超速离心管中，在65,000 x g条件下离心 g 4 °C下使用摆桶转子离心1小时30分钟。
- 小心弃去上清液，将每份沉淀重悬于400 µL含1% BSA的1x PBS溶液中，避免产生气泡。冰上孵育至少1小时。
- 孵育1小时后，轻轻混匀每支试管，确保沉淀完全重悬且均匀，然后将所有重悬的沉淀合并至同一支试管中。
- 用1% BSA/PBS填充试管，直至至少三分之二满，以防止离心过程中试管塌陷。
- 再次以 65,000 x g 4 °C 条件下离心 1 小时 30 分钟，使慢病毒载体沉淀。小心弃去上清液，并用无菌纸巾擦干管口边缘。
- 将含有慢病毒载体的沉淀重悬于45 µL的1% BSA/PBS中，避免产生气泡。用透明封口膜密封管子，在4 °C孵育24小时。
- 次日，准备10 µL的慢病毒载体等分试样。 保留10 µL等分试样用于滴定：5 µL用于p24 ELISA试剂盒，2 µL用于qPCR试剂盒。根据制造商说明书，使用ELISA和qPCR对慢病毒载体进行滴定。
注意：滴定方法的选择取决于实验需求，例如快速评估或对感染单位进行精确定量。基于p24的ELISA检测可定量衣壳蛋白，从而测量总的物理颗粒数；该方法快速、成本较低且具有高度可重复性。然而，该方法无法区分具有感染性与非感染性的病毒颗粒，可能导致对功能性滴度的高估。基于qPCR的滴定法用于测定包装进病毒颗粒中的病毒基因组（vg）数量，可更准确地估算含基因组的病毒颗粒，并允许不同病毒载体制备物之间的直接比较。但该方法仍无法评估病毒颗粒的有效感染能力。最后，基于感染活性的检测方法，如针对荧光标记载体的流式细胞术或针对抗生素抗性载体的菌落形成实验，可直接测定具有功能的转导单位（TU/ml），生物学相关性最强，但这类方法更耗时耗力，依赖于特定细胞类型，且成本较高。15,16.
3. 小鼠纹状体双侧慢病毒递送的立体定位手术
- 动物准备
- 称量动物体重并计算所需的麻醉剂量。使用现配的混合溶液，按每克体重10 µL的剂量进行腹腔注射给药。该混合溶液的配制方法为：将7.5 mL的0.9% NaCl、500 µL的美托咪定（1.0 mg/mL）、1.0 mL的咪达唑仑（5.0 mg/mL）和1.0 mL的芬太尼（0.05 mg/mL）混合，终体积为10 mL。给予约10分钟时间以完成麻醉诱导。
- 确认麻醉深度（例如，脚趾夹捏反射）。双眼涂抹眼用软膏，并剃除头皮毛发。
- 将动物放置于立体定位仪框架内的加热垫上，使用耳杆和门齿杆固定头部位置。
注意：注射动物的数量及实验时间线取决于具体实验设计，应由研究人员根据实验需求确定。 先验的 基于特定假设和预期效应量的统计功效分析。例如，在我们之前的研究中12注射后4、8和12周对注射脑组织进行分析，以评估神经病理学改变的进展。
- 注射器准备与病毒加载
- 使用标准的Hamilton进样针和26G钝头注射针进行操作。将2 µL慢病毒载体溶液装入注射器中。确保每个注射位点的病毒剂量为400 ng p24抗原/mL，或5 x 109 IU/mL10,12,17.
- 将注射器安装到自动显微注射泵（例如 Stoelting）上。在输注模式下对注射器进行预充液，直至针尖出现液滴。确保针尖斜面朝前。
- 设定泵的参数——速度：0.25 µL/min，每侧半球体积：2 µL，注射器类型：根据实际使用的型号选择。
注意：注射体积取决于啮齿类动物的物种及目标转导脑区。注射1 µL可实现局灶性表达，而较大总体积（高达10 µL）需极慢的注射速率，且存在较高的组织损伤或反流风险。
- 纹状体定位与注射
- 使用聚维酮碘或氯己定类消毒剂与70%酒精交替消毒手术区域，重复三次，然后进行切口。在存活手术过程中，放置无菌手术巾或经批准的无菌屏障，以维持无菌区域，并在关闭切口时为缝合操作提供无菌操作面。使用无菌手术刀片从两耳之间至眼部做正中切口（约1–1.5 cm）。
- 暴露并清洁颅骨，用棉签去除骨膜。定位前囟，记录立体定位零点（手动或数字方式）。
- 以Bregma为参照确定注射坐标（适用于8-12周龄、体重约18-20 g的小鼠）：前-后（AP）+0.6 mm；内-外侧（ML）±1.8 mm；背-腹侧（DV）：–3.3 mm。
- 在标记的前后/内外（AP/ML）坐标处小心钻孔。缓慢操作，避免穿透脑组织。或者，当颅骨已磨至足够薄时即停止——此时可通过颅骨观察到硬脑膜上的血管。用细针小心刺破硬脑膜。
- 通过降低注射针测试孔位是否正确。通过注射部分溶液直至明显观察到液滴，以检测针头是否堵塞。
- 将注射针缓慢降至DV坐标位置，每侧半球注射2 µL病毒溶液，注射速率为0.25 µL/min。注射完成后，等待5分钟，再缓慢撤出注射针，以避免反流。
- 将编码野生型蛋白（ATXN2WT 或 ATXN3WT）的慢病毒注射至一侧半脑，将编码突变/扩展型蛋白（ATXN2MUT 或 ATXN3MUT）的慢病毒注射至对侧半脑（随机或预先设定）12,13.
注意：使用小鼠脑图谱18几乎所有脑区均可通过立体定位技术进行靶向操作，而不仅限于纹状体，包括大脑皮层、海马、黑质和小脑。由于小脑是脊髓小脑性共济失调（SCAs）的主要病变部位，因此成为载体递送的特别相关靶区。在构建该小脑型SCA3小鼠模型时，我们采用以下坐标：前囟后1.6 mm，中线旁0 mm，颅骨表面下方1 mm，咬合器设定为−3.3，以确保精确定位至小脑皮层。12,15.
- 手术期间的监测
- 监测胡须运动及反射。若观察到运动，给予补充麻醉剂（初始剂量的三分之一）。
- 伤口闭合与恢复
- 用3–5针间断的5-0尼龙缝线关闭切口。皮下注射拮抗药物混合液，剂量为10 µL/g体重，以逆转初始麻醉药物的作用。该溶液的配制方法为：将1.5 mL 0.9% NaCl、500 µL 阿替美唑（5.0 mg/mL）、5.0 mL 氟马西尼（0.1 mg/mL）和3.0 mL 纳洛酮（0.4 mg/mL）混合，终体积为10 mL。
- 将动物置于铺有加热垫的清洁恢复笼内，过夜监测。
注意：注射室应配备生物安全柜用于载体操作。研究人员必须穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括实验服、手套和眼部防护装置。所有废弃物（如针头、注射器和被污染的材料）必须根据机构和国家规定丢弃至生物危害容器中。按照批准的机构兽医方案给予围手术期镇痛，确保在麻醉逆转前药物达到有效浓度。在神经炎症为相关疾病表型的模型中，具有抗炎活性的镇痛药可能干扰炎症指标的检测结果；因此，镇痛方案应在兽医监督下选择，并在动物实验方案中予以合理说明。
4. 组织采集、制备与处理
- 准备
- 准备所有解剖器械以及小鼠安乐死和组织采集所需的溶液（如麻醉剂、含4%多聚甲醛[PFA]的PBS）。
- 提前配制4% PFA，冷冻保存，并在使用前不超过24小时解冻。灌注前确保溶液充分冷却。
警告：PFA 具有毒性。仅可在通风橱内操作，并佩戴适当的个人防护装备（PPE）且接受过相关培训。 - 注射戊巴比妥钠致死剂量（100–200 mg/kg，腹腔内注射）以麻醉动物。通过夹捏脚趾无反射确认深度麻醉；若反射仍存在，追加给药。
- 经心灌注
- 将动物置于解剖装置中并固定。用镊子提起腹部皮肤，用剪刀做一条自下而上的垂直切口。图2A，粉红色箭头）。
- 提起浅筋膜，向上方切开，直至可见肝脏，注意避免损伤腹腔器官。
- 横向切开膈肌，然后将切口延伸至腋窝图2A，白色箭头）。将胸壁向后翻折并固定。
- 将灌注针插入左心室心尖，确保不刺穿心室壁。用精细剪刀在右心房做一小切口图2B).
- 使用50 mL冰冻的4%多聚甲醛（PFA），以1-2 mL/min的流速进行经心灌注。
注意：冷溶液常会引起尾巴卷曲和肌肉抽搐，这是灌注良好的指标。
- 脑解剖
- 准备一个含有足量4%多聚甲醛（PFA）的离心管，确保能够完全浸没脑组织。使用大号剪刀将小鼠断头。将尸体放入密封的生物危害袋中，进行焚烧处理。
- 将头皮向后剥离以暴露颅骨。辨认枕骨大孔，使用精细剪刀从枕骨大孔处开始平行于脑组织向两侧剪开，逐步去除颅骨图2C).
- 在对侧重复操作，然后在嗅球上方、两眼之间剪开颅骨。
- 将颅骨从小脑向嗅球方向抬起以暴露脑组织。使用刮铲从后向前小心取出脑组织，并将其浸入4% PFA中，在4 °C下固定不超过24 h。
- 用 PBS 配制的 20%–30% 蔗糖溶液替换包埋液，4 °C 下孵育直至完全浸透。脑组织最初会漂浮，完全浸透后会下沉，通常在 24 小时内完成。若仍漂浮，需延长孵育时间，直至其沉降至管底。
注意：此冷冻保护步骤通过降低组织含水量来最大限度地减少冷冻过程中产生的伪影。
轻轻晾干脑组织和离心管，然后于 -80 °C 保存，待后续使用。
- 冷冻切片与游离组织收集
- 切片前，将冷冻切片机温度设为 -20 °C，并设定所需的切片厚度。
注意：对于纹状体，厚度为20–25 µm的冠状切片在结构保存与抗体渗透性之间提供了理想折中，所获切片具有足够的机械强度便于操作，同时保持了高染色质量和空间分辨率。冷冻切片条件也应根据其他脑区进行优化，因为最佳切片厚度可能随细胞构筑而异。对于小脑，通常推荐25–35 µm的矢状切片，该厚度有助于保留小脑皮层的分层结构。 - 将脑组织置于干冰上运输，并在冷冻切片机内平衡5-10分钟。此步骤对于防止组织损伤至关重要。
- 用手术刀切除嗅球，嗅球应质地柔软，易于切割。取豌豆大小的新鲜O.C.T.包埋剂滴加于样本盘上，将小脑与之接触放置图1D). 将脑组织定位以进行冠状切面切片。待其完全冻结后，添加额外的O.C.T. 包埋整个脑组织。
注意：O.C.T. 在室温下呈透明状，完全冷冻后变为不透明的白色；若仍呈现光泽，需在冷冻切片机中延长冷冻时间。 - 将样本圆盘安装在持样器中，并进行修整，直至可见纹状体（每侧半球中的两个白色圆圈）。若两侧半球接受了不同处理，需用针刺穿其中一个半球以保持方向性，并记录该信息以供后续分析。
- 切换至切片模式，使用细毛刷或火焰抛光的玻璃巴斯德移液管，将游离切片收集至48孔板中。
注意：游离漂浮法可改善抗体渗透性，降低背景信号，支持长期保存，并确保切片间距均匀，从而实现纹状体的完整覆盖。 - 用含有0.05%叠氮化钠的PBS填充孔板。
注意：叠氮化钠具有毒性——需佩戴个人防护装备操作，并妥善处理废弃物。 - 将第一片置于A1孔，第二片置于A2孔，并依次连续放置。当培养板填满后，可继续使用新的培养板，或返回A1孔继续放置，直至整个纹状体切片完成（约3个完整的48孔板）。用透明封膜密封培养板，4 °C保存备用。
注意：对于全纹状体分析，从培养板中选择一列即可获得间距均匀、代表整个区域的切片。
- 切片前，将冷冻切片机温度设为 -20 °C，并设定所需的切片厚度。
5. 使用DAB染色的免疫组织化学
- 用 PBS 洗涤切片 3 次，以去除残留的叠氮化钠。在苯肼溶液（0.2–0.3 mg/mL，溶于 PBS）中 37 °C 孵育 30 分钟。
注意：苯肼具有致癌性——此步骤应在通风橱中操作，并将废弃物作为危险废物处理。 - 用 PBS 依次洗涤 3 次，每次分别为 5 分钟、10 分钟、10 分钟。在含 10% 正常山羊血清（NGS）和 0.1% Triton X-100 的 PBS 中，室温下封闭组织 1 小时。
- 在推荐稀释比例的一抗溶液中（例如小鼠抗 ataxin-2 抗体，1:1000，溶于封闭液），4 °C 轻柔振荡孵育过夜。用 PBS 依次洗涤 3 次，每次分别为 5 分钟、10 分钟、10 分钟。
- 加入生物素标记的二抗（1:200，溶于封闭液），室温轻柔振荡孵育 2 小时。用 PBS 依次洗涤 3 次，每次分别为 5 分钟、10 分钟、10 分钟。
- 在 ABC 复合物中室温孵育 30–40 分钟。用 PBS 依次洗涤 3 次，每次分别为 5 分钟、10 分钟、10 分钟。
- 新鲜配制 DAB 溶液：向 2.5 mL 超纯水中加入 1 滴缓冲液，涡旋混匀；加入 2 滴 DAB，再次涡旋；加入 1 滴 H₂O₂，再次涡旋混匀。
注意：DAB 具有致癌性——应在通风橱中操作，并妥善处理废弃物。 - 将切片分别置于 DAB 溶液中显色，直至达到所需染色强度（通常为 1–10 分钟）。立即转移至 PBS 中以终止反应。
备注：DAB 活性随时间下降；操作应高效。若同一孔中存在多个切片，应确保彼此不接触，以免影响染色过程。 - 用 PBS 依次洗涤 3 次，每次分别为 5 分钟、10 分钟、10 分钟。将切片贴附于明胶包被的载玻片上，完全干燥。请勿使用石墨铅笔标记载玻片，以免干扰成像。
- 脱水、透明并封片操作如下：将切片浸入蒸馏水中 30 秒，随后通过乙醇梯度脱水：75%、96%、100%（每级 3 分钟）。在二甲苯替代物中透明 5 分钟，晾干。使用快速固化的封片介质加盖盖玻片，并在通风橱内至少固化 24 小时后，再进行成像或储存。
使用 FIJI（ImageJ）定量小鼠纹状体中 DARPP-32 耗竭区域的体积
- 图像采集
- 采集覆盖整个纹状体（大约前囟 +1.0 至 –0.5 mm）的冠状脑切片图像。保持照明、放大倍数（例如 10x）和分辨率的一致性。将图像以 TIFF 格式保存，并使用连续的文件名（例如 Striatum_Bregma_+0.5.tif）。
- 在 FIJI 中进行图像预处理
- 在 FIJI 中打开每张图像。校准像素尺寸：进入 分析 > 设置尺度。使用已知的标尺（如显微测微尺）或图像元数据中的信息（例如 1 像素 = 1 µm）。
- 将图像转换为 8 位： 图像 > 类型 > 8 位。如有必要，调整亮度/对比度以优化耗竭区域的可视化效果（此步骤避免使用阈值分割）。
- 耗竭区域的感兴趣区（ROI）选择
- 使用多边形、自由手绘或画笔工具勾画 DARPP-32 耗竭区域（通常在纹状体中表现为染色较浅或缺失）。进入 分析 > 测量，记录面积（单位：µm2）。
- 通过进入 ROI 管理器 > 添加 > 更多 > 保存 来保存 ROI，或使用“批量测量”功能进行批量分析。
- 对所有相关脑切片重复此操作。
- 耗竭体积的计算
- 将每张切片中的耗竭面积乘以切片间距（通常为 120 – 240 µm，取决于切片厚度和间隔）。
每张切片的体积（mm3） = 耗竭面积（mm2） × 切片间隔（mm） - 将所有切片的体积相加：
总耗竭体积（mm3） = Σ（面积 × 间隔） - 可选：用于可视化的叠加图。使用 图像 > 叠加 > 来自 ROI 功能，可视化跨切片的耗竭区域。导出汇总图像或动画用于图表展示。
- 将每张切片中的耗竭面积乘以切片间距（通常为 120 – 240 µm，取决于切片厚度和间隔）。
- 务必对照小鼠脑图谱检查对齐情况，以确保前后方向定位准确。分别分析每个半球，以区分单侧效应（例如野生型与突变型注射的比较）。
7. 小鼠纹状体中蛋白质聚集体的定量分析
- 使用 FIJI 进行手动定量
- 加载并校准图像。在 FIJI 中打开图像。校准像素大小（如果使用的图像包含元数据，则可跳过此步骤）。
- 前往 分析 > 设置尺度，输入已知距离（例如，1 像素 = 0.5 µm）。在 FIJI 中，前往 插件 > 分析 > 细胞计数器 > 细胞计数器。点击 初始化，然后选择图像。
- 选择一种标记类型（例如，类型 1）用于聚集体。手动点击每一个可见的聚集体以进行标注。记录数据：FIJI 将在细胞计数器面板中显示计数结果。记录每张图像/切片的计数。可手动导出计数结果，或使用宏来汇总结果。
- 使用 IHCAggreCount 进行半自动定量
- 上传并处理图像。打开 IHCAggreCount，点击 上传图像（补充图 1）。
注：IHCAggreCount 应用程序由本实验室开发，是一款独立的科学工具，旨在简化和标准化显微图像中细胞聚集体的定量分析。该软件完全采用 Python 编写，采用模块化架构，将图像处理、处理流程、选择校正、测量计算等功能相互分离。IHCAggreCount 完全兼容 Windows 10 与 Windows 11，以及 macOS 13 Ventura 和 macOS 14 Sonoma，并已在两个平台上成功测试。与传统的手动图像检查方法相比，该软件具有显著的分析优势：可减少用户主观性，消除重复性手动操作，加快图像处理速度，确保测量结果的可重复性，实现一致的感兴趣区域提取，并支持对多个图像进行批量处理。总体而言，该应用程序相较于传统手动方法，为颗粒检测与定量提供了更快、更客观且更稳健的工作流程。该应用程序可根据合理请求向作者索取。 - 图像将显示在原始图像显示区域中。转至“处理”选项卡。应用 HiLo 增强聚集体与背景之间的对比度（参见 补充图 2）。应用亮度阈值以从背景中筛选出聚集体（补充图 3）。使用最小尺寸滤波器去除小颗粒（噪声）（补充图 4）。可选地应用圆形度阈值以排除非聚集体形状（补充图 5）。
- 对于免疫组化聚集体检测，转至“通用”选项卡，点击 计算总聚集体数 和 计算聚集体面积。所有检测到的聚集体将被高亮显示，并列于矩阵表中（ID、面积、平均大小；补充图 6）。
- 上传并处理图像。打开 IHCAggreCount，点击 上传图像（补充图 1）。
- 手动校正（可选）
- 前往校正选项卡，使用“智能添加”在选定区域内自动检测聚集体（补充图 8）。使用手动添加功能手动标注聚集体。使用“智能删除”移除不需要的标签。（高亮显示的聚集体用于视觉检查；补充图 7）。
- 导出结果
- 点击 导出 CSV 以导出当前图像的数据。点击 全部导出 以批量导出多个已分析图像的数据。在 IHCAggreCount 中分析图像时，务必在所有实验组之间保持相同的亮度/对比度设置及其他参数（例如，阈值）。
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结果
本研究利用现有方案成功鉴定出ataxin-2和DARPP-32的表达。在将慢病毒载体立体定位注射至C57BL/6J小鼠纹状体后，两种蛋白均表现出强烈表达 野生型 12周后检测到突变型ataxin-2。我们此前已证明12 这些构建体特异性地靶向神经元，每平方毫米可有效转导约20,000个神经元3在我们的实验条件下，ataxin-2 的免疫染色显示其呈弥散的细胞质分布 野生型 ataxin-2，不形成离散包涵体（22Q； 图3A，黄色箭头）。相比之下，突变型ataxin-2（104Q）表现出具有明显球形形态的细胞质聚集体（图3B（红色箭头）。这些聚集体呈现为边界清晰、高强度的点状结构，明显区别于野生型条件下观察到的均匀胞质染色，直径通常约为1–5 µm。这些离散包涵体的存在被用作定义突变型ataxin-2病理表达成功的操作标准，表明基于慢病毒的实验方案能够有效诱导靶向脑区中依赖多聚谷氨酰胺的蛋白聚集。
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讨论
本文描述了用于多聚谷氨酰胺脊髓小脑性共济失调（polyQ SCA）的纹状体慢病毒小鼠模型的建立方法。同时还描述了 编码高滴度慢病毒载体的制备 野生型 致病蛋白的全长形式，以及通过立体定位手术将慢病毒（LVs）双侧注射至小鼠纹状体。此外，本文还描述了脑组织采集、组织学处理及基于图像的疾病特征量化方法。综合这些技术，可建立一种慢病毒介导的多聚谷氨酰胺（polyQ）脊髓小脑共济失调（SCA）小鼠模型，该模型在纹状体中表现出蛋白聚集和神经元标志物丢失，且该方法也可应用于其他脑区。尽管本实验方案的主要目标是表征神经病理学特征，以作为疾病建模的关键组成部分20，行为改变可能因靶向的脑区不同而出现17在小鼠纹状体内通过慢病毒介导表达突变型ataxin-2后，在旷场实验中，与注射野生型ataxin-2或未注射的对照动物相比，注射突变型ataxin-2的小鼠表现出活动能力增强和类似焦虑的行为。12重要的是，该模型并非旨在复制经典的共济失调性小脑功能障碍，而是用于解析与多聚谷氨酰胺毒性相...
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
Clévio Nóbrega 实验室的研究经费由 Cure CSB 项目、斯洛文尼亚罕见病儿童维利姆·尤利扬协会（Viljem Julijan Association for Children with Rare Diseases）以及阿尔加维生物医学中心研究所（Algarve Biomedical Center Research Institute, ABC-Ri）提供。本文部分作者获得了葡萄牙科学技术基金会（Fundação para a Ciência e Tecnologia, FCT）资助的博士奖学金，具体编号如下：Tiago Moreira-Gomes（2022.11008.BD）、Inês T Afonso（2022.10161.BD）和 Rafael G Costa（2022.11973.BD）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.9% NaCl | 本地供应商 | — | 用于配制麻醉剂和拮抗剂混合液 |
| 100 mm 细胞培养皿 | SPL Life Sciences | 11090 | |
| ABC试剂盒（亲和素-生物素复合物） | VECTASTAIN Elite | ||
| 阿替美唑（5.0 mg/mL） | 本地供应商 | — | 美托咪定的拮抗剂 |
| 台式离心机 | - | - | |
| II级生物安全柜（符合BSL-2标准） | - | - | |
| 生物素化二抗 | - | - | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | NZYTech | MB47002 | |
| 脑切片（例如，30–40 µm 冠状切片），经DARPP-32免疫染色 | - | - | |
| 细胞计数插件（FIJI） | 内置 / ImageJ | — | 用于手动聚集体计数的工具 |
| CO2 培养箱（37 °C，5% CO2，湿化） | - | - | |
| 计算机工作站 | 本地供应商 | — | 用于图像处理和软件运行 |
| 锥形超速离心管 | Beckman Coulter | 358126 | |
| 棉签 | 本地供应商 | — | 用于去除骨膜 |
| 带样品盘支架的冷冻切片机 | - | - | |
| DAB（二氨基联苯胺） | - | - | |
| 数字立体定位坐标读取器 | Stoelting/WPI | 51725 | 用于坐标测量的数字显示器 |
| Dulbecco’s 改良Eagle培养基（DMEM，高糖） | Gibco/Thermo Fisher | 11-965-092 | |
| 乙醇 70%、96% 和 100% | - | - | |
| 乙醇，70% | 本地供应商 | — | 用于头皮消毒 |
| 芬太尼（0.05 mg/mL） | 本地供应商 | — | 麻醉剂组分 |
| 胎牛血清（FBS），热灭活 | Gibco/Thermo Fisher | 10500064 | |
| FIJI（ImageJ发行版） | NIH / ImageJ | https://fiji.sc/ | 用于聚集体手动定量的开源软件 |
| 精细镊子（用于脚趾夹捏） | 本地供应商 | — | 用于监测麻醉深度 |
| 氟马西尼（0.1 mg/mL） | 本地供应商 | — | 咪达唑仑的拮抗剂 |
| 镊子和手术刀 | 本地供应商 | — | 用于去除骨膜和暴露颅骨 |
| Hamilton 700/1700系列微量/防漏注射器 | Hamilton / Fisher Sci. | 7653-01/10550203 | 用于装载病毒溶液 |
| Hamilton 小接头可拆卸针头（26G） | Hamilton / Fisher Sci. | 7804-03/ 10698205 | 用于病毒递送 |
| 加热垫（用于啮齿类动物） | Kent Scientific / SOMNI | 例如 04-777-177 | 用于维持体温 |
| HEK 293T细胞（≤第10代，支原体阴性） | ATCC或同等来源 | CRL-3216 | |
| 过氧化氢 | - | - | |
| IHCAggreCount软件 | 按需提供 | N/A | 用于聚集体半自动检测与定量的专有内部软件 |
| 倒置显微镜（用于观察细胞汇合度） | - | - | |
| 实验室涡旋混合器 | - | - | |
| 慢病毒载体（野生型和突变型） | 内部制备 / 核心设施 | N/A | 用于注射的病毒溶液 |
| L-谷氨酰胺（200 mM） | Gibco/Thermo Fisher | 25030081 | |
| 带相机的光学显微镜（明场） | - | - | |
| 美托咪定（1.0 mg/mL） | 本地供应商 | — | 麻醉剂组分 |
| 微型钻头（兼容立体定位仪） | Stoelting / 本地供应商 | — | 用于开颅手术 |
| 微量注射泵（例如，Stoelting） | Stoelting/WPI | 53210 | 用于病毒注射的自动输注泵 |
| 移液器（P1000、P200、P10）及吸头 | - | - | |
| 显微图像（IHC切片） | 内部生成 | N/A | 待分析的免疫组织化学图像 |
| 切片机刀片（低剖面，一次性） | - | - | |
| 咪达唑仑（5.0 mg/mL） | 本地供应商 | — | 麻醉剂组分 |
| 封片介质 | - | - | |
| 纳洛酮（0.4 mg/mL） | 本地供应商 | — | 芬太尼的拮抗剂 |
| 持针器和精细解剖针 | - | - | |
| 正常山羊血清（NGS） | - | - | |
| O.C.T. 包埋剂 | Tissue-Tek | ||
| 眼科软膏（Bepanthen眼鼻软膏，5% 泛醇） | Bayer | 11568-0053 | 防止手术期间角膜干燥 |
| 轨道摇床 | - | - | |
| p24 ELISA试剂盒 | ZeptoMetrix | 0801111 | |
| Parafilm封口膜 | - | - | |
| 多聚甲醛（PFA） | - | - | |
| PBS | - | - | |
| 不含Ca2+/Mg2+的PBS，pH 7.0 | Gibco/Thermo Fisher | 10-010-031 | |
| pCMV-dR8.2 | Addgene | 质粒 #12263 | |
| 青霉素-链霉素（100×） | Gibco/Thermo Fisher | 15140122 | |
| 戊巴比妥 | - | - | |
| 苯肼 | - | - | |
| pMD2.G | Addgene | 质粒 #12259 | |
| 聚乙烯亚胺（PEI），1 mg/mL | Polysciences | 23966 | |
| 一抗 | - | - | |
| pRSV-Rev | Addgene | 质粒 #12253 | |
| qPCR慢病毒滴度测定试剂盒 | abm | LV900 | |
| 光滑毛刷或火焰抛光的玻璃巴斯德移液管（圆头） | - | - | |
| 叠氮化钠 | - | - | |
| 刮勺（脑组织托） | - | - | |
| 立体定位仪（用于小鼠） | Stoelting/WPI | 51730 | 用于精确定位脑区 |
| Stericup 0.22 µm 滤器单元 | MilliporeSigma | SCGPU02RE | |
| 蔗糖 | - | - | |
| 缝合线（例如，尼龙5-0） | Ethicon / 本地供应商 | 1664G | 用于伤口闭合 |
| T75和T175细胞培养瓶 | SPL Life Sciences | 70075/71175 | |
| 转移质粒（目的基因） | - | - | |
| 吐温X-100 | - | - | |
| 配备JS-24.38转子的超速离心机 | Beckman Coulter | JS-24.38 | |
| 涡旋混合器 | - | - | |
| 水浴锅（37 °C） | - | - | |
| 二甲苯替代品 | - | - |
参考文献
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