多聚谷氨酰胺脊髓小脑性共济失调由CAG重复扩增引起，导致易于聚集的蛋白质产生。本方案描述了载体构建、立体定位注射以及包涵体和神经元标志物丢失的分析方法，为研究神经退行性疾病的发病机制及评估靶向治疗策略提供了一个可控的实验平台。
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摘要
摘要
多聚谷氨酰胺脊髓小脑性共济失调是一组由致病基因编码区内的CAG三核苷酸重复序列突变引起的六种神经退行性疾病。该突变导致蛋白质中出现异常扩增的多聚谷氨酰胺片段，使其易于聚集，进而形成神经元内包涵体，这是此类疾病的典型特征。这些疾病发病机制所涉及的分子通路复杂，目前尚未完全阐明。迄今为止，这些疾病仍无法治愈。明确易损脑区中的分子机制对于开发治疗策略至关重要。尽管此类模型无法完全模拟选择性易损性，但仍需建立灵活且具有区域特异性的实验平台，以快速检验相关机制和干预手段，避免构建多种转基因品系所需的时间和成本。近年来，我们及其他研究团队已开发出多种基于慢病毒的模型，用于研究扩增蛋白在脑内特定区域表达所造成的影响。这些模型表现出与疾病部分特征相似的神经病理学和行为学表型，凸显了其在揭示发病机制及开发新型治疗策略中的重要价值。本文中，我们以脊髓小脑性共济失调2型（SCA2）为例，描述了一种纹状体模型的建立过程。我们重点介绍了慢病毒载体的构建与生产，以及立体定位注射表达扩增型ataxin-2（致病蛋白）的病毒载体的操作方法。最后，我们对两种主要的神经病理学标志进行了表征：包涵体的形成和神经元标志物的丢失。该模型通过提供一个可调控的平台，重现了这些关键的病理特征，为解析神经退行性病变的区域特异性机制以及评估靶向治疗干预措施提供了有力工具。
引言
脊髓小脑性共济失调中的多聚谷氨酰胺病（polyQ SCAs）是一组由多个致病基因中CAG三核苷酸重复序列异常扩增引起的六种常染色体显性遗传神经退行性疾病，这种扩增导致编码蛋白中产生具有毒性的多聚谷氨酰胺（polyQ）片段1。其中最常见的类型是SCA3/马查多-约瑟夫病和SCA22。这些疾病主要影响特定脑区的神经元细胞，包括小脑、脑干以及纹状体等其他区域，从而导致进行性运动失调、步态障碍、严重的神经退行性病变以及早亡3。
为了研究多聚谷氨酰胺（polyQ）性脊髓小脑共济失调（SCAs）并测试治疗策略，已开发出多种动物模型。转基因小鼠、基因敲入品系以及条件性表达小鼠模型已被用于阐明疾病进展的分子基础及相关的细胞通路4,5。然而，构建新的疾病动物模型耗时且成本高昂，通常不适合用于研究脑区在疾病发病机制中的作用6。
基于慢病毒（LV）的小鼠模型为传统模型提供了一种互补的替代方案，具有成本较低以及能够研究大脑特定区域的优势7,
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方案
所有动物实验均按照《动物研究：体内实验报告指南》（ARRIVE）以及美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》进行。本研究经葡萄牙食品与兽医局（Direção-Geral da Alimentação e Veterinária，DGAV）批准。实验中使用C57BL/6J小鼠，饲养于标准笼具中，光照周期为12小时光照/12小时黑暗，自由供应食物和水 随意供应.
注意：本方案中使用的材料在材料表中有进一步说明。
1. 慢病毒载体的包装
注意：所有涉及慢病毒载体的操作均须在符合机构安全指南的BSL-2级实验室中进行。我们采用四质粒转染系统，因其相较于其他慢病毒生产系统具有更高的生物安全性（转移质粒的详细信息见图1）。
- 在水浴中解冻 HEK 293T 细胞，并使用添加了 2 mM L-谷氨酰胺、10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）将细胞接种至 T75 培养瓶中。本方案所有步骤均使用该完全 DMEM 培养基。为确保高病毒滴度和实验结果的一致性，请使用传代次数 ≤10 的细胞。
注意：操作前务必检测支原体污染情况。 - 当细胞融合....
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结果
本研究利用现有方案成功鉴定出ataxin-2和DARPP-32的表达。在将慢病毒载体立体定位注射至C57BL/6J小鼠纹状体后，两种蛋白均表现出强烈表达 野生型 12周后检测到突变型ataxin-2。我们此前已证明12 这些构建体特异性地靶向神经元，每平方毫米可有效转导约20,000个神经元3在我们的实验条件下，ataxin-2 的免疫染色显示其呈弥散的细胞质分布 野生型 ataxin-2，不形成离散包涵体（22Q； 图3A，黄色箭头）。相比之下，突变型ataxin-2（104Q）表现出具有明显球形形态的细胞质聚集体（图3B（红色箭头）。这些聚集体呈现为边界清晰、高强度的点状结构，明显区别于野生型条件下观察到的均匀胞质染色，直径通常约为1–5 µm。这些离散包涵体的存在被用作定义突变型ataxin-2病理表达成功的操作标准，表明基于慢病毒的实验方案能够有效诱导靶向脑区中依赖多聚谷氨酰胺的蛋白聚集。
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讨论
本文描述了用于多聚谷氨酰胺脊髓小脑性共济失调（polyQ SCA）的纹状体慢病毒小鼠模型的建立方法。同时还描述了 编码高滴度慢病毒载体的制备 野生型 致病蛋白的全长形式，以及通过立体定位手术将慢病毒（LVs）双侧注射至小鼠纹状体。此外，本文还描述了脑组织采集、组织学处理及基于图像的疾病特征量化方法。综合这些技术，可建立一种慢病毒介导的多聚谷氨酰胺（polyQ）脊髓小脑共济失调（SCA）小鼠模型，该模型在纹状体中表现出蛋白聚集和神经元标志物丢失，且该方法也可应用于其他脑区。尽管本实验方案的主要目标是表征神经病理学特征，以作为疾病建模的关键组成部分20，行为改变可能因靶向的脑区不同而出现17在小鼠纹状体内通过慢病毒介导表达突变型ataxin-2后，在旷场实验中，与注射野生型ataxin-2或未注射的对照动物相比，注射突变型ataxin-2的小鼠表现出活动能力增强和类似焦虑的行为。12重要的是，该模型并非旨在复制经典的共济失调性小脑功能障碍，而是用于解析与多聚谷氨酰胺毒性相.......
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
Clévio Nóbrega 实验室的研究经费由 Cure CSB 项目、斯洛文尼亚罕见病儿童维利姆·尤利扬协会（Viljem Julijan Association for Children with Rare Diseases）以及阿尔加维生物医学中心研究所（Algarve Biomedical Center Research Institute, ABC-Ri）提供。本文部分作者获得了葡萄牙科学技术基金会（Fundação para a Ciência e Tecnologia, FCT）资助的博士奖学金，具体编号如下：Tiago Moreira-Gomes（2022.11008.BD）、Inês T Afonso（2022.10161.BD）和 Rafael G Costa（2022.11973.BD）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.9% NaCl | 本地供应商 | — | 用于配制麻醉剂和拮抗剂混合液 |
| 100 mm 细胞培养皿 | SPL Life Sciences | 11090 | |
| ABC试剂盒（亲和素-生物素复合物） | VECTASTAIN Elite | ||
| 阿替美唑（5.0 mg/mL） | 本地供应商 | — | 美托咪定的拮抗剂 |
| 台式离心机 | - | - | |
| II级生物安全柜（符合BSL-2标准） | - | - | |
| 生物素化二抗 | - | - | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | NZYTech | MB47002 | |
| 脑切片（例如，30–40 µm 冠状切片），经DARPP-32免疫染色 | - | - | |
| 细胞计数插件（FIJI） | 内置 / ImageJ | — | 用于手动聚集体计数的工具 |
| CO2 培养箱（37 °C，5% CO2，湿化） | - | - | |
| 计算机工作站 | 本地供应商 | — | 用于图像处理和软件运行 |
| 锥形超速离心管 | Beckman Coulter | 358126 | |
| 棉签 | 本地供应商 | — | 用于去除骨膜 |
| 带样品盘支架的冷冻切片机 | - | - | |
| DAB（二氨基联苯胺） | - | - | |
| 数字立体定位坐标读取器 | Stoelting/WPI | 51725 | 用于坐标测量的数字显示器 |
| Dulbecco’s 改良Eagle培养基（DMEM，高糖） | Gibco/Thermo Fisher | 11-965-092 | |
| 乙醇 70%、96% 和 100% | - | - | |
| 乙醇，70% | 本地供应商 | — | 用于头皮消毒 |
| 芬太尼（0.05 mg/mL） | 本地供应商 | — | 麻醉剂组分 |
| 胎牛血清（FBS），热灭活 | Gibco/Thermo Fisher | 10500064 | |
| FIJI（ImageJ发行版） | NIH / ImageJ | https://fiji.sc/ | 用于聚集体手动定量的开源软件 |
| 精细镊子（用于脚趾夹捏） | 本地供应商 | — | 用于监测麻醉深度 |
| 氟马西尼（0.1 mg/mL） | 本地供应商 | — | 咪达唑仑的拮抗剂 |
| 镊子和手术刀 | 本地供应商 | — | 用于去除骨膜和暴露颅骨 |
| Hamilton 700/1700系列微量/防漏注射器 | Hamilton / Fisher Sci. | 7653-01/10550203 | 用于装载病毒溶液 |
| Hamilton 小接头可拆卸针头（26G） | Hamilton / Fisher Sci. | 7804-03/ 10698205 | 用于病毒递送 |
| 加热垫（用于啮齿类动物） | Kent Scientific / SOMNI | 例如 04-777-177 | 用于维持体温 |
| HEK 293T细胞（≤第10代，支原体阴性） | ATCC或同等来源 | CRL-3216 | |
| 过氧化氢 | - | - | |
| IHCAggreCount软件 | 按需提供 | N/A | 用于聚集体半自动检测与定量的专有内部软件 |
| 倒置显微镜（用于观察细胞汇合度） | - | - | |
| 实验室涡旋混合器 | - | - | |
| 慢病毒载体（野生型和突变型） | 内部制备 / 核心设施 | N/A | 用于注射的病毒溶液 |
| L-谷氨酰胺（200 mM） | Gibco/Thermo Fisher | 25030081 | |
| 带相机的光学显微镜（明场） | - | - | |
| 美托咪定（1.0 mg/mL） | 本地供应商 | — | 麻醉剂组分 |
| 微型钻头（兼容立体定位仪） | Stoelting / 本地供应商 | — | 用于开颅手术 |
| 微量注射泵（例如，Stoelting） | Stoelting/WPI | 53210 | 用于病毒注射的自动输注泵 |
| 移液器（P1000、P200、P10）及吸头 | - | - | |
| 显微图像（IHC切片） | 内部生成 | N/A | 待分析的免疫组织化学图像 |
| 切片机刀片（低剖面，一次性） | - | - | |
| 咪达唑仑（5.0 mg/mL） | 本地供应商 | — | 麻醉剂组分 |
| 封片介质 | - | - | |
| 纳洛酮（0.4 mg/mL） | 本地供应商 | — | 芬太尼的拮抗剂 |
| 持针器和精细解剖针 | - | - | |
| 正常山羊血清（NGS） | - | - | |
| O.C.T. 包埋剂 | Tissue-Tek | ||
| 眼科软膏（Bepanthen眼鼻软膏，5% 泛醇） | Bayer | 11568-0053 | 防止手术期间角膜干燥 |
| 轨道摇床 | - | - | |
| p24 ELISA试剂盒 | ZeptoMetrix | 0801111 | |
| Parafilm封口膜 | - | - | |
| 多聚甲醛（PFA） | - | - | |
| PBS | - | - | |
| 不含Ca2+/Mg2+的PBS，pH 7.0 | Gibco/Thermo Fisher | 10-010-031 | |
| pCMV-dR8.2 | Addgene | 质粒 #12263 | |
| 青霉素-链霉素（100×） | Gibco/Thermo Fisher | 15140122 | |
| 戊巴比妥 | - | - | |
| 苯肼 | - | - | |
| pMD2.G | Addgene | 质粒 #12259 | |
| 聚乙烯亚胺（PEI），1 mg/mL | Polysciences | 23966 | |
| 一抗 | - | - | |
| pRSV-Rev | Addgene | 质粒 #12253 | |
| qPCR慢病毒滴度测定试剂盒 | abm | LV900 | |
| 光滑毛刷或火焰抛光的玻璃巴斯德移液管（圆头） | - | - | |
| 叠氮化钠 | - | - | |
| 刮勺（脑组织托） | - | - | |
| 立体定位仪（用于小鼠） | Stoelting/WPI | 51730 | 用于精确定位脑区 |
| Stericup 0.22 µm 滤器单元 | MilliporeSigma | SCGPU02RE | |
| 蔗糖 | - | - | |
| 缝合线（例如，尼龙5-0） | Ethicon / 本地供应商 | 1664G | 用于伤口闭合 |
| T75和T175细胞培养瓶 | SPL Life Sciences | 70075/71175 | |
| 转移质粒（目的基因） | - | - | |
| 吐温X-100 | - | - | |
| 配备JS-24.38转子的超速离心机 | Beckman Coulter | JS-24.38 | |
| 涡旋混合器 | - | - | |
| 水浴锅（37 °C） | - | - | |
| 二甲苯替代品 | - | - |
参考文献
- Afonso-Reis, R., Afonso, I. T., Nóbrega, C. Current Status of Gene Therapy Research in Polyglutamine Spinocerebellar Ataxias. Int J Mol Sci. 22 (8), 4249(2021).
- Durr, A. Autosomal dominant cerebellar ataxias: polyglutamine expansions and beyond. Lance....
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重印与许可
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