血栓剖析测定：基于微流控的平台，用于全面表征生物力学血栓形成

Summary

这项工作描述了一种利用剪切应力触发血液血栓形成的微流控测定法，并通过多维读数表征血栓。该检测方法可以测量血液样本的促血栓倾向，因此在疾病诊断、药物发现以及血栓形成相关的基础机制研究中非常有用。

Abstract

血栓是一种病理状况，描述了血小板和凝血因子在血管中异常积累的情况。虽然许多研究聚焦于可溶性激动剂激活血小板作为血栓形成的潜在机制，但人们常常忽视血流也促进血栓形成。尤其是在动脉中，血栓通常伴随动脉狭窄，动脉狭窄会提高血流中的剪切应力，促进血栓形成过程，这一现象称为生物力学血栓形成。长期以来，没有生物测定法能够提供关于生物力学血栓形成过程的全面且详细的见解。为此，开发了一种结合微流控与多色荧光成像的血栓剖析测定法，能够全面表征生物力学血栓形成，七个读数涵盖血栓的大小、组成以及血小板激活水平。该血栓分析法可用于评估人类的促血栓倾向及抗血栓剂的疗效，同时也有助于进一步理解动脉血栓形成的机制。

Introduction

血栓是心血管疾病的主要原因，每年导致全球数百万死亡。目前，标准临床环境中尚无用于评估血栓风险的生物测定方法。在商业化的实验室和现场血液功能测定中，传统凝血测定和凝集测量已被证明在预测血栓或重大不良心血管事件方面不可靠（^2,3,4）。全球血栓测试⁵、PFA-100/200⁶以及全球凝血测试^{7、8、9、10、11}的数据也有限支持其表现。

根据目前的理解，血栓形成过程主要由三种机制共同作用。除了两种传统认可的机制——生化血小板聚集和凝固外，第三种被忽视且常被低估的机制是剪切驱动的血小板聚集，也被称为“生物力学血小板聚集”^12,13。在生物力学血小板聚集中，高剪切应力和剪切梯度是血小板交联的主要驱动力，包括GPIbα-冯·威勒布兰因子（VWF）、整合素α_IIbβ_3-纤维蛋白原相互作用，以及整合素α_IIbβ_3-纤维蛋白原相互作用。在动脉血栓中，生物力学性血小板聚集可能是最关键的机制，因为动脉狭窄引起的高剪切流动极大地强化了这一机制。因此，由生物力学血小板聚集驱动的血栓形成被称为“生物力学血栓形成”^12,14。

在以往的研究中，一种常见的生物力学血小板聚集实验方法是微流控狭窄测定，即将严重狭窄部位嵌入直通道中。当血液在生理壁剪切应力下灌注通道时，狭窄部位周围会产生病理性较高的剪切应力，促使血小板积累形成血栓。然而，以往的研究仅使用单个（针对血小板，反映血浆大小）^{15、16、17、18、19}，或最多两个（一个用于血小板，一个用于另一个生物标志物）读数^13,20，因此无法实现血栓的全面表征。

最近开发出一种血栓剖析分析法，该方法结合了多色荧光成像，实现了7个生物标志物的实时追踪（血小板、纤维蛋白原水平、冯·威勒布兰因子水平、P-选择蛋白表达水平、磷脂酰丝氨酸暴露水平、扩展整合素α_{IIbβ表达水平}、完全活性整合素α_IIbβ₃表达水平）在血栓中，这为全面表征生物力学血栓形成奠定了^基础。本研究提供了关于血栓剖析检测的制备和执行及相关数据分析的详细协议。该检测所需的硬件包括倒置多色荧光显微镜和微流控系统。该检测使用相对较少的全血（少于2毫升），具有较高的成本效益（每样本约12美元），且30分钟内得出结果。该检测方法能够准确检测个体的多维促血栓异常，并评估抗血栓药物在改变血栓大小、成分和血小板活化状态方面的效果，^支持其在未来广泛应用于科研和临床目的。值得注意的是，检测必须使用新鲜采集的肝素化血液。将血液储存在4°C或超过6小时，或使用除肝素外的抗凝剂，要么能防止血栓形成，要么结果不准确。

Protocol

该方案遵循德克萨斯大学医学分校人类研究伦理委员会的指导方针，并已获批准。实验硬件设备包括微流控装置、灌流组件（连接器、管路、注射器和注射器泵）以及一台带有光学元件的倒置显微镜，支持明场和多色荧光成像。显微镜中使用多LED灯塔和多通滤光片立方体，以最小的相互透光方式分割4个荧光通道：激发：391/32,479/33,554/24,638/31，发射：435/30,519/25,594/32,695/58。所有实验作时请佩戴个人防护装备，包括手套、护目镜和实验夹克。试剂和所用设备列于 材料表中。

1. 微流控器件制备

1. 设计一个主模具，包含矩形通道（宽200微米×高50微米），并包含80%光度收窄的部位。每个通道都有专用的管路连接入口和出口（见图1;原始设计文件见 补充文件1 ）。
2. 根据设计，使用硅晶圆 通过标准光 刻制造SU-8光刻胶主模具。将模具贴在15厘米培养皿底部（见图2A）。
3. 通过在硅胶弹性体套件中以10：1的重量比混合预聚合物基底和固化剂，制备PDMS混合物。将混合物倒入主模具（图2B）。
4. 将装有PDMS混合物的板放入真空干燥器中，进行脱气并消除被困气泡。
   注意：保持板子真空至少2小时，直到气泡完全清除。
5. 通过在75°C下培养2小时，热固化PDMS混合物。
6. 小心地从主模具上切割固化后的PDMS（图2C，D），并将其切入单个芯片单元。
7. 通过在指定位置用探针打孔来形成进出口（图2E）。
   注意：使用压缩空气除尘器清除打孔处残留的杂物。为减少表面污染，接接前使用粘性密封胶带清洁PDMS器件。
8. 在化学罩中，在作业湿巾上喷涂75%乙醇，然后用湿润的作业湿巾擦拭和清洁玻璃片。让玻璃玻片晾干。
9. 在化学罩中，用高频发生器处理玻璃滑片和PDMS芯片分别30秒和20秒，然后用玻片对准每个芯片。轻轻将芯片压在玻璃玻片表面，以便包边。
   注意：这一步必须在化学罩内进行，因为高频发生器在使用过程中会产生臭氧，对健康有害。
10. 通过在150°C下孵育15分钟进行热结合。冷却后，设备即可使用（见图2F）。
11. 将设备存放在室温且无尘的环境中。
12. 用钳子取出探针的塑料部分，将金属管弯曲至90°。这些弯曲的管子将用作微流控器件的连接器。

2. 荧光传感器制备

注：实验共使用7个荧光传感器：SZ22-FITC、纤维蛋白原-Alexa Fluor 405、2.2.9-Alexa Fluor 555、AK4-Alexa Fluor 647、附录蛋白V-太平洋蓝、MBC 370.2-Alexa Fluor 555、PAC-1-Alexa Fluor 647。其中，纤维蛋白原、2.2.9和MBC 370.2仅以非偶联形式商业化，需在实验室进行荧光共轭。

1. 将纤维蛋白原与Alexa Fluor 405结合：
   1. 制作一个新鲜的0.1百万碳酸氢钠缓冲液，pH值8.5。
   2. 将纤维蛋白原稀释至1 mg/mL，浸泡于磷酸盐缓冲盐水中（PBS;137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na₂HPO 4,1.8 mM KH₂PO_4，pH 7.4）。
   3. 向纤维蛋白原溶液中加入1/10体积的碳酸氢钠缓冲液。
   4. 将1毫升纤维蛋白原与1毫克Alexa Fluor 405 NHS酯混合，在室温旋转器上培养1小时。防光。
   5. 通过在1,100 ×克 下离心柱，去除储存缓冲液，冷却2分钟，然后丢弃流过缓冲液。将反应溶液装入柱上，将柱安装在兼容的收集瓶上，并在1100 ×克 离心5分钟以收集纤维蛋白原-Alexa氟405。
   6. 使用分光光度计测量280 nm（A₂₈₀，蛋白质信号）和405 nm（A₄₀₅，染料信号）波长下的吸收。计算蛋白质浓度和F/P比（荧光：蛋白质摩尔比）。
      注意：F/P比应在8-10之间。
   7. 将纤维蛋白原-Alexa氟405在黑暗中保存在4°C。
2. 将2.2.9和MBC 370.2抗体与Alexa Fluor 555结合：
   1. 制作一个新鲜的0.1百万碳酸氢钠缓冲液，pH值8.5。
   2. 将抗体高汤稀释至1 mg/mL，浸泡在无胺缓冲液中。
   3. 向抗体溶液中加入1/10体积的碳酸氢钠缓冲液。
   4. 将100微升抗体与1瓶Alexa Fluor 555 NHS酯混合，并在室温下旋转器上培养1小时。防光。
   5. 通过以1,100 × g 离心2分钟，将储存缓冲液从纯化塔中取出，然后丢弃流过缓冲液。将反应溶液装入柱子，将柱安装在兼容的收集瓶上，并以1100× 克 离心5分钟，收获2.2.9或MBC 370.2-Alexa Fluor 555。
   6. 使用分光光度计测量280 nm（A₂₈₀，蛋白质信号）和555 nm（A₅₅₅，染料信号）波长的吸收。计算抗体浓度和F/P比（荧光：抗体摩尔比）。
      注意：F/P比率应在1-1.5之间。
   7. 在黑暗中存储2.2.9和MBC 370.2-Alexa Fluor 555，温度为4°C。
      注意：避免过度标记——高F/P比可能损害生物功能。

3. 人体血液采集

注意：此程序必须由合格的医疗人员（如持证护士、认证采血员）进行。同时，获得参与研究人员的书面知情同意。

1. 通过抽取500微升Tyrode缓冲液（12 mM NaHCO_3,10 mM Hepes，137 mM NaCl，2.7 mM KCl，5.5 mM D-葡萄糖，0.5% 牛血清白蛋白，pH 7.4）准备注射器，该含肝素含量为每10毫升血液，肝素含量为0.32 U/mL。
2. 通过静脉穿刺采集血液。用空注射器收集前2毫升血液，准备丢弃。然后换上含肝素注射器采集血液样本。慢慢拉出注射器以减少血小板的激活。
3. 将收集的血液转移到15毫升离心管中，保持在37°C以下。
   注意：血液样本应在采集后6小时内进行实验。

4. 血栓剖面分析

注意：建议尽可能在生物安全柜内进行所有血液处理程序，以避免血液泄漏到实验者身上。如果做不到，那就用工作台挡板。

1. 将VWF单体稀释为PBS中的2 μg/mL。先用VWF单体预涂微流控器件，并在室温下孵育1小时。
2. 将血液样本与荧光传感器1号或2号在室温下孵育10分钟：
   1. 组1：SZ22-FITC组（0.5 μg/mL）、纤维蛋白原-Alexa Fluor 405（60 μg/mL）、2.2.9-Alexa 氟555（1 μg/mL）、AK4-Alexa 氟647（1 μg/mL）。
   2. 组2：SZ22-FITC组（0.5 μg/mL），Annexin V-Pacific Blue（1 μg/mL），MBC 370.2-Alexa Fluor 555（1 μg/mL），PAC-1-Alexa Fluor 647（1 μg/mL）。
      注意：由于两组传感器需分别使用，每个血样至少需检测两次（一次使用传感器组1，一次使用传感器组2）以获得完整数据集。
3. 将一个微流控装置与进出口连接器及管路连接。用装有PBS的管子连接入口连接器的另一端，用注射器连接出口连接器的另一端。将注射器安装在注射器泵上。将微流控装置安装在倒置显微镜上，手动移动台以找到显微镜下的狭窄部位（见图3A）。
4. 用注射器泵以0.5 mL/min的流量填充微流控通道和管路PBS。确保狭窄部位周围没有气泡。
5. 将入口管与血液样本连接，并用注射器泵以0.018 mL/min的流量将血液样本灌注通过微流控通道（见图3A）。
6. 设置每个荧光通道的曝光时间和增益。通过在4个通道间交替进行实时多色荧光成像，一次激发一种荧光团。同时，找到血栓的焦点平面，并在狭窄部位记录信号，通常持续15-30分钟（见图4）。
   注意：每个通道的曝光时间需要调整，以便在避免饱和的情况下，清晰地区分荧光信号（见图4）。在现有系统中，健康受试者的血液样本通常在形成的血栓内呈现以下信号强度范围：SZ22-FITC，70-110;纤维蛋白原-Alexa Fluor 405， 60-100;2.2.9-Alexa Fluor 555,70-110页;AK4-Alexa Fluor 647,45-75页;附录V-太平洋蓝，35-65;MBC 370.2-Alexa Fluor 555， 45-85;PAC-1-Alexa Fluor 647,10-30。然而值得注意的是，少数健康受试者会呈现非典型读数。因此，建议至少检测5名健康受试者的血液样本，以确保每个通道的暴露时间选择得当。

5. 数据分析

1. 使用ImageJ 1.53（斐济国立卫生研究院）打开数据文件。
   注意：每个文件应包含来自4个不同频道的4个视频。以下程序通常适用于用户感兴趣的任何时间点。
2. 使用SZ22-FITC通道识别血栓轮廓，并使用“多边形选择”大致确定血栓区域（图5A，B）。
3. 对于每个通道，使用 图像->调整->阈值 以消除背景（图5C），然后使用 分析->测量 测量信号在血栓内的面积和平均强度。
   注意：SZ22-FITC 染色血小板，从而反映血栓大小。在集合1中，纤维蛋白原-Alexa氟405反映纤维蛋白原富集水平，2.2.9-Alexa氟555反映冯·威勒布兰因子（VWF）富集水平，AK4-Alexa氟647反映P-选择表达。在第2组中，附录蛋白V-太平洋蓝反映磷脂酰丝氨酸（PS）暴露，MBC 370.2-Alexa氟555反映整合素α_IIbβ₃ 激活扩展构象（E⁺ α_IIbβ_3），PAC-1-Alexa氟647反映整合素在_IIbβ₃ 完全激活α（Act. α_IIbβ₃）²¹。

Results

血栓剖析分析通过狭窄通道灌注血液，以实现剪切驱动的血栓形成，并进行实时多色荧光成像，收集形成血栓的多维信息。通过同时使用第一组和第二组传感器完成实验，应能从大小、交联蛋白富集（冯·威尔布兰因子、纤维蛋白原）以及血小板激活水平（反映于P选择表达、PS暴露和整合素α_IIbβ_激活^）方面对血栓进行表征。

每个实验收集的数据都可以被彻底分析，以呈现“信号 与时间曲线（参见 图6）。不过，这非常耗时。或者，也可以选择一个时间点，因此每个通道只能用一张图像进行数据分析。例如，血栓形成后7.5分钟通常对应健康血液血栓开始相对稳定的时间，因此可以作为数据分析的代表性时间点²¹。如果仅使用一个时间点进行数据分析，则可通过以下方法推导出一个7维血栓剖面，全面反映血液样本的生物力学促血栓倾向。首先，将每个通道的荧光信号面积和...

Discussion

通过结合微流控狭窄测定法与多色荧光成像，血栓剖析分析为研究生物力学血栓生成和血小板机械生物学提供了便捷且强大的方法。同时，该测定在广泛的应用中非常有用。例如，它可以用于筛选特异性抑制生物力学血小板聚集的抗血栓药物，其中分子靶点和作用机制可从条形码²¹推断出。它还可用于研究特定人群中的促血栓倾向，识别和表征心血管疾病风险因素的影响，并评估个体的促血栓倾向。我们认为血栓剖析分析在临床转化中具有前景，可评估个体的促血栓倾向，并帮助医生为患者制定个性化的抗血栓方案。

血栓剖析法具有多功能性。分子传感器可以自由更换或拆卸以满足个性化需求。例如，如果实验者只关注血栓大小和E⁺ α_IIbβ₃ 水平，则会对含有SZ22-FITC和MBC 370.2-Alexa Fluor 555的血液进行单次实验。如果实验者有兴趣测试此处列出的传感器组1和2中未包含的其他生物标志物，可以添加相应的分子传感器以替代当前设置中的，只要标记...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10毫升注射器	亨克·萨斯·沃尔夫	5100-X00V0	血液样本采集
15毫升猎鹰管	杰尼西科学	28-101	血液样本储存
1毫升气密玻璃注射器	汉密尔顿	81331	硬件组装
2.2.9	MERU VasImmune		血栓染色
20根×1/2探针	麦克马斯特-卡尔	M919	制造PDMS设备
20毫升注射器	亨克·萨斯·沃尔夫	5200-X00V0	血液样本采集
70%乙醇	西格玛-奥尔德里奇	EX0281-1	气密注射器消毒和玻璃玻片清洁
AK4-Alexa Fluor 647	生物传说	304918	血栓染色
Alexa Fluor 405 NHS Ester	Invitrogen	A30000	纤维蛋白原标记
Alexa fluor 555抗体标记套件	Invitrogen	A88065	MBC 370.2 和 2.2.9 标签
附录V-太平洋蓝	Invitrogen	501121505	血栓染色
清洁刮尘器	办公车库	911245	制造PDMS设备
手工模型刀具套装带木盒	Excel刀片	44282	制造PDMS设备
去离子水及nbsp;	ThermoFisher Scientific	751-628	气密注射器的清洗
干燥器	贝尔·阿特	F420270000	脱气PDMS
一次性多功能实验室铲子	列夫戈	17211	混合硅胶弹性体基底和固化剂;
染料和生物素去除旋转柱	泽巴	A44296S	纤维蛋白原标记
纤维蛋白原	创新研究	IHUFBG25MG	血栓染色
Fusion 200-X 注射器泵	Chemyx公司	0720X	硬件组装
肝素	西格玛-奥尔德里奇	H3149	血液样本抗凝
高频发生器	电工产品公司	BD-20	制造PDMS设备
人类VWF单体	中生生物股份有限公司	10973-H08C	微型晶体器件涂层
Image J v1.53 软件	斐济，国家卫生研究院		数据分析
倒置显微镜	徕卡	DM IL 领导;滤镜方块：徕卡DFT51010;灯塔：LED5	硬件组装
金威兹	金伯利——克拉克职业	34120	玻璃玻片清洗
鲁尔锁电容	国际医疗工业公司	57100B	血液样本采集
MBC 370.2	凯拉法斯特	EBW104	血栓染色
显微镜罩玻璃	保罗·马里恩费尔德有限责任公司及KG连	ES0107222	制造PDMS设备
迷你剃刀片刮刀	斯坦利	28-100	制造PDMS设备
NanoDrop 2000 紫外-可见分光光度计	热力科学	ND-2000	蛋白质浓度与体能/能量比测量
烤箱	实验室线仪器	3512	制造PDMS设备
PAC-1-Alexa Fluor 647	生物传说	362806	血栓染色
塑料杯	ThermoFisher Scientific	S04589	混合硅胶弹性体基底和固化剂;
SU-8光刻胶主版 霉菌	加州大学圣地亚哥分校Nano3纳米制造洁净室设施		制造PDMS设备
Sylgard 184 硅胶弹性体套件	克雷登·道	DC4019862	PDMS
SZ22-FITC	贝克曼·库尔特	IM 1756U	血栓染色
漂流管	科尔-帕尔默仪器公司	06422-01	硬件组装