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方法文章

血栓特征分析检测：一种基于微流控技术的生物力学血栓形成全面表征平台

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DOI：

10.3791/69555

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2026年1月9日

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology and Department of Pathology, University of Texas Medical Branch

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究描述了一种微流控检测方法，该方法利用剪切应力诱导血液中血栓形成，并通过多维度读数对血栓进行表征。该检测可测量血液样本的促血栓倾向，因此在血栓相关疾病的诊断、药物研发以及基础机制研究中具有重要应用价值。

摘要

血栓形成是一种描述血小板和凝血因子在血管内异常积聚的病理状态。尽管许多研究集中于可溶性激动剂诱导的血小板活化作为血栓形成的潜在机制，但血液流动在促进血栓形成过程中的作用却常常被忽视。特别是在动脉中，血栓形成通常与动脉狭窄相关，后者会增加血流中的剪切应力，从而促进血栓生成过程，这一现象被称为生物力学性血栓生成。长期以来，尚无一种生物检测方法能够全面且详细地揭示生物力学性血栓生成的全过程。为解决这一问题，研究人员开发了一种血栓特征分析检测方法，该方法结合了微流控技术与多色荧光成像技术，能够通过七个检测指标对生物力学性血栓生成进行系统表征，涵盖血栓的大小、组成以及血小板活化水平。该血栓特征分析检测可用于评估人类的促血栓倾向及抗血栓药物的疗效，同时也有助于进一步理解动脉血栓形成的潜在机制。

引言

血栓形成是心血管疾病的主要原因，每年在全球范围内导致数百万人死亡1。目前，在标准临床环境中尚无可用于评估血栓形成风险的生物检测方法。在已商业化的实验室和床旁血液功能检测中，传统的凝血检测和聚集测定法已被证明在预测血栓形成或主要不良心血管事件方面不可靠2,3,4。全球血栓检测5、PFA-100/2006以及全局凝血检测7,8,9,10,11的支持其性能的数据也十分有限。

根据目前的认识，血栓形成过程主要由三种机制促成。除了通常公认的两种机制——即生化介导的血小板聚集和凝血作用——第三种机制是剪切力驱动的血小板聚集，该机制研究较少且常被低估，也被称为 "生物力学血小板聚集"12,13在生物力学血小板聚集过程中，高剪切应力和剪切梯度是驱动血小板交联的主要因素 通过 GPIbα-血管性血友病因子（VWF），整合素αIIbβ3-VWF 和整合素 αIIbβ3-纤维蛋白原相互作用。在动脉血栓形成中，生物力学介导的血小板聚集可能是最关键的机制，因为动脉狭窄引起的高剪切血流会显著增强这一过程。因此，由生物力学介导的血小板聚集所驱动的血栓形成被称为“生物力学血栓形成”。12,14.

在以往的研究中，实验观察生物力学血小板聚集的常用方法是微流控狭窄检测，即在直通道中嵌入一个严重狭窄的区域。当血液在生理壁面剪切应力下流经该通道时，狭窄部位周围会产生病理性的高剪切应力，从而驱动血小板聚集形成血栓。然而，以往的研究仅使用单一读数（用于血小板，反映血栓大小）15,16,17,18,19，或最多两种读数（一种用于血小板，另一种用于其他生物标志物）13,20，因此无法实现对血栓的全面表征。

最近开发了一种血栓特征分析检测方法，该方法将多色荧光成像技术整合到微流控狭窄检测中，可实时追踪血栓内7种生物标志物（血小板、纤维蛋白原水平、血管性血友病因子水平、P-选择素表达水平、磷脂酰丝氨酸暴露水平、伸展型整合素 αIIbβ3 表达水平、完全活化型整合素 αIIbβ3 表达水平），为全面表征生物力学介导的血栓形成奠定了基础21。本文提供了血栓特征分析检测的详细操作流程，包括实验准备、检测实施及相关数据分析方法。该检测所需的硬件设备包括倒置多色荧光显微镜和微流控系统。该方法仅需相对少量的人全血（少于2 mL），具有较高的成本效益（每样本约12美元），并在30分钟内即可获得结果。该检测能够准确识别个体多维度的促血栓异常状态，并评估抗血栓药物对血栓大小、组成及血小板活化状态的影响，因而有望在未来广泛应用于科研与临床领域21。值得注意的是，该检测必须使用新鲜采集的肝素抗凝血液。将血液储存在4 °C条件下或超过6小时，或使用除肝素以外的其他抗凝剂，均可能导致血栓无法形成或结果不准确。

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方案

本方案遵循德克萨斯大学医学分部人类研究伦理委员会的指南，并已获得其批准。实验硬件装置包括一个微流控设备、灌注组件（连接器、管路、注射器和注射泵）以及一台倒置显微镜，该显微镜配备光学部件，可实现明场和多色荧光成像。显微镜使用一个多通道LED光源和一个多通道滤光立方体，以分离四个荧光通道并最大程度减少相互串色：激发光波长分别为391/32、479/33、554/24、638/31，发射光波长分别为435/30、519/25、594/32、695/58。所有实验操作均需佩戴个人防护装备，包括手套、护目镜和实验服。所用试剂和设备列于材料表中。

1. 微流控装置制备

  1. 设计一个主模具，包含矩形微通道（200 µm 宽 × 50 µm 高），并在其中设置一个管腔狭窄80%的部位。每个通道均设有独立的进样口和出样口，用于连接管路。图1；参见 补充文件 1 用于原始设计文件）。
  2. 根据设计，使用硅片制备SU-8光刻胶母模 通过 标准光刻技术。将模具固定在直径15厘米的培养皿底部（图2A).
  3. 按10:1的质量比将硅弹性体试剂盒中的预聚物基质与固化剂混合，制备PDMS混合物。将混合物倒入主模具中图2B).
  4. 将含有PDMS混合物的培养皿置于真空干燥器中，以脱气并去除截留的气泡。
    注意：将培养板置于真空环境中至少2小时，直至气泡完全去除。
  5. 将PDMS混合物在75 °C下孵育2 h以进行热固化。
  6. 小心地将固化的PDMS从母模上切下（图2C，D）并将其切割成独立的芯片单元。
  7. 使用探针针头在指定位置打孔，以创建入口和出口图2E).
    注意：使用压缩空气除尘器清除打孔中残留的任何碎屑。为尽量减少表面污染，在键合前使用压敏胶密封胶带清洁PDMS装置。
  8. 在化学通风橱中，将75%乙醇喷洒在擦拭布上，用湿润的擦拭布擦拭并清洁载玻片，然后让载玻片自然晾干。
  9. 在化学通风橱中，使用高频发生器分别对玻璃载片和PDMS芯片处理30秒和20秒，然后将每个芯片与玻璃载片对齐。轻轻按压芯片使其与玻璃载片表面结合。
    注意：此步骤必须在通风橱中进行，因为高频发生器在使用过程中会产生臭氧，对人体健康有害。
  10. 将装置在 150 °C 下孵育 15 分钟以进行热键合。冷却后，装置即可使用（图 2F).
  11. 在无尘条件下于室温保存设备。
  12. 使用镊子取下探针针头的塑料部分，并将金属管弯曲成90°。这些弯曲的金属管将用作微流控装置的连接件。

2. 荧光传感器的制备

注意：本实验共使用7种荧光传感器：SZ22-FITC、fibrinogen-Alexa Fluor 405、2.2.9-Alexa Fluor 555、AK4-Alexa Fluor 647、Annexin V-Pacific Blue、MBC 370.2-Alexa Fluor 555、PAC-1-Alexa Fluor 647。其中，fibrinogen、2.2.9 和 MBC 370.2 仅能以未偶联形式商业购得，需在实验室中进行荧光标记偶联。

  1. 将纤维蛋白原与 Alexa Fluor 405 进行偶联：
    1. 新鲜配制 0.1 M 碳酸氢钠缓冲液，pH 8.5。
    2. 用磷酸盐缓冲液（PBS；137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，1.8 mM KH2PO4，pH 7.4）将纤维蛋白原储备液稀释至 1 mg/mL。
    3. 向纤维蛋白原溶液中加入 1/10 体积的碳酸氢钠缓冲液。
    4. 将 1 mL 纤维蛋白原与 1 mg Alexa Fluor 405 NHS-酯混合，在旋转仪上室温孵育 1 小时。避 光操作。
    5. 通过在 1,100 × g 条件下离心 2 分钟去除纯化柱中的保存缓冲液，并弃去流出液。将反应液上样至柱中，将柱安装到合适的收集管上，在 1,100 × g 条件下离心 5 分钟，收集纤维蛋白原-Alexa Fluor 405。
    6. 使用分光光度计测定 280 nm（A280；蛋白信号）和 405 nm（A405；染料信号）处的吸光度。计算蛋白浓度和 F/P 比值（荧光染料与蛋白的摩尔比）。
      注：F/P 比值应在 8–10 范围内。
    7. 将纤维蛋白原-Alexa Fluor 405 在 4 °C 避光保存。
  2. 将 2.2.9 和 MBC 370.2 抗体与 Alexa Fluor 555 进行偶联：
    1. 新鲜配制 0.1 M 碳酸氢钠缓冲液，pH 8.5。
    2. 用无胺缓冲液将抗体储备液稀释至 1 mg/mL。
    3. 向抗体溶液中加入 1/10 体积的碳酸氢钠缓冲液。
    4. 将 100 µL 抗体与 1 瓶（100 µg）Alexa Fluor 555 NHS-酯混合，在旋转仪上室温孵育 1 小时。避 光操作。
    5. 通过在 1,100 × g 条件下离心 2 分钟去除纯化柱中的保存缓冲液，并弃去流出液。将反应液上样至柱中，将柱安装到合适的收集管上，在 1,100 × g 条件下离心 5 分钟，收集 2.2.9-或 MBC 370.2-Alexa Fluor 555。
    6. 使用分光光度计测定 280 nm（A280；蛋白信号）和 555 nm（A555；染料信号）处的吸光度。计算抗体浓度和 F/P 比值（荧光染料与抗体的摩尔比）。
      注：F/P 比值应在 1–1.5 范围内。
    7. 将 2.2.9-和 MBC 370.2-Alexa Fluor 555 在 4 °C 避光保存。
      注：避免过度标记——高 F/P 比值可能损害其生物学功能。

3. 采集人类受试者的血液

注意：此操作必须由具备资质的医务人员（例如，持证护士、认证采血员）进行。此外，需获得参与研究的个体签署的知情同意书。

  1. 通过吸取500 µL Tyrode缓冲液（12 mM NaHCO₃）来准备注射器3，10 mM Hepes、137 mM NaCl、2.7 mM KCl、5.5 mM D-葡萄糖、0.5% 牛血清白蛋白，pH 7.4）中，每收集 10 mL 血液加入 0.32 U/mL 肝素。
  2. 采集血液 通过 静脉穿刺。先用空注射器采集最初的2 mL血液并弃去。然后更换为含肝素的注射器以采集血样。缓慢抽吸注射器，以尽量减少血小板活化。
  3. 将采集的血液转移至15 mL离心管中，并在37 °C条件下保存。
    注意：血液样本应在采集后6小时内用于实验。

4. 血栓分析检测

注意：建议在处理血液的所有操作过程中尽可能在生物安全柜内进行，以避免血液溅到实验人员身上。如果无法做到，则应使用台面防溅屏蔽装置。

  1. 将VWF单体用PBS稀释至2 µg/mL。用VWF单体预包被微流控装置，并在室温下孵育1小时。
  2. 将血液样本与荧光探针Set 1或Set 2在室温下孵育10分钟：
    1. Set 1：SZ22-FITC（0.5 µg/mL）、纤维蛋白原-Alexa Fluor 405（60 µg/mL）、2.2.9-Alexa Fluor 555（1 µg/mL）、AK4-Alexa Fluor 647（1 µg/mL）。
    2. Set 2：SZ22-FITC（0.5 µg/mL）、Annexin V-Pacific Blue（1 µg/mL）、MBC 370.2-Alexa Fluor 555（1 µg/mL）、PAC-1-Alexa Fluor 647（1 µg/mL）。
      注：由于两种探针组需分别使用，每份血液样本至少需检测两次（一次使用探针Set 1，一次使用探针Set 2），以获得完整的数据集。
  3. 将微流控装置连接进样口和出样口接头及管路。将进样口接头的另一端连接含有PBS的管路，出样口接头的另一端连接注射器。将注射器安装至注射泵上。将微流控装置固定于倒置显微镜载物台上，并手动调节载物台位置，在显微镜下找到狭窄部位（图3A）。
  4. 使用注射泵以0.5 mL/min的流速向微流控通道和管路中灌注PBS。确保狭窄部位周围无气泡存在。
  5. 将进样管路与血液样本连接，使用注射泵以0.018 mL/min的流速将血液样本灌注通过微流控通道（图3A）。
  6. 设定各荧光通道的曝光时间和增益。通过在4个通道之间交替激发，每次激发一种荧光染料，进行实时多色荧光成像。同时，确定血栓的焦平面，并记录狭窄部位的信号，通常持续15–30分钟（图4）。
    注：需调整各通道的曝光时间，使荧光信号易于分辨，同时避免信号饱和（图4）。在当前系统中，健康受试者的血液样本在形成的血栓中通常产生以下信号强度范围：SZ22-FITC，70–110；纤维蛋白原-Alexa Fluor 405，60–100；2.2.9-Alexa Fluor 555，70–110；AK4-Alexa Fluor 647，45–75；Annexin V-Pacific Blue，35–65；MBC 370.2-Alexa Fluor 555，45–85；PAC-1-Alexa Fluor 647，10–30。然而，少数健康受试者可能产生非典型读数。因此，建议至少检测5份健康受试者的血液样本，以确保为各通道选择合适的曝光时间。

5. 数据分析

  1. 使用 ImageJ 1.53 版本（Fiji，美国国立卫生研究院）打开数据文件。
    注意：每个文件应包含来自 4 个不同通道的总共 4 段视频。以下步骤通常适用于用户希望分析的任意时间点。
  2. 使用 SZ22-FITC 通道识别血栓的轮廓，并使用“多边形选区”粗略选择血栓区域（图 5A、B）。
  3. 对于每个通道，依次使用 图像 -> 调整 -> 阈值 消除背景（图 5C），然后使用 分析 -> 测量 测量血栓区域内信号的面积和平均强度。
    注意：SZ22-FITC 标记血小板，因此反映血栓大小。在第一组实验中，纤维蛋白原-Alexa Fluor 405 反映纤维蛋白原富集水平，2.2.9-Alexa Fluor 555 反映血管性血友病因子（VWF）富集水平，AK4-Alexa Fluor 647 反映 P-选择素表达水平。在第二组实验中，Annexin V-Pacific Blue 反映磷脂酰丝氨酸（PS）暴露情况，MBC 370.2-Alexa Fluor 555 反映整合素 αIIbβ3 激活至伸展构象（E+ αIIbβ3），PAC-1-Alexa Fluor 647 反映整合素 αIIbβ3 的完全激活状态（Act. αIIbβ3）21。

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结果

血栓分析实验通过狭窄通道灌注血液，以实现剪切力驱动的血栓形成，并进行实时多色荧光成像，从而获取所形成血栓的多维信息。通过使用第1组和第2组传感器完成实验，可对血栓的多个方面进行表征，包括血栓大小、交联蛋白（血管性血友病因子、纤维蛋白原）的富集程度，以及血小板活化水平（通过P-选择素表达、磷脂酰丝氨酸外翻和整合素αIIbβ3活化反映）21。

从每次实验中收集的数据均可进行深入分析，以获得“信号” 与. 时间”曲线（参见， 图6）。然而，这种方法耗时较长。另一种方法是选择单个时间点，即每个通道仅选取一幅图像进行数据分析。例如，在血栓形成开始后7.5 min，健康血液中的血栓通常已趋于相对稳定，因此可将该时间点选作数据分析的代表性时间点。21如果仅使用一个时间点进行数据分析，则可采用以下步骤获得一个7维血栓特征谱，全面表征血液样本的生物力学促血栓倾向。首先，将每个通道荧光信...

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讨论

通过将微流控狭窄检测与多色荧光成像相结合，血栓分析检测为研究生物力学介导的血栓形成及血小板机械生物学提供了一种便捷而强大的方法。同时，该检测具有广泛的应用价值。例如，可用于筛选特异性抑制生物力学诱导血小板聚集的抗血栓药物，其分子靶点和作用机制可通过效应条形码进行推断21。该方法还可用于研究特定人群的促血栓倾向，以识别和表征心血管疾病风险因素的影响，并评估个体的促血栓倾向。我们相信，血栓分析检测在临床转化方面具有广阔前景，可用于评估个体的促血栓倾向，并协助临床医生为患者制定个性化的抗血栓治疗方案。

血栓分析检测具有高度灵活性。分子传感器可根据定制需求自由更换或移除。例如，若实验者仅关注血栓大小和 E+ αIIbβ3 水平，则只需进行一次实验，使用含有 SZ22-FITC 和 MBC 370.2-Alexa Fluor 555 的血液样本即可。如果实验者希望检测此处列出的传感器组1和组2中未包含的其他生物标志物，只要所标记的荧光染料与通道的光学设置兼容，即可添加相应的分子传...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本论文相关研究及陈实验室血栓分析检测方法的开发得到了美国国立心肺血液研究所资助项目R00HL153678（Y.C.）、美国国立老龄化研究所、克劳德·D·佩珀老年美国人独立中心奖#P30-AG024832（Y.C.）、德克萨斯大学医学分部团队科学试点研究奖（Y.C.）、美国心脏协会博士后奖学金20POST35080023（Y.C.）以及美国心脏协会变革性项目奖25TPA1471420（Y.C.）的支持。部分工作在加州大学圣地亚哥分校的圣地亚哥纳米技术基础设施（SDNI）完成，SDNI是国家纳米技术协调基础设施的成员，由美国国家科学基金会资助（项目编号ECCS-2025752）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10 mL 注射器Henke Sass Wolf5100-X00V0血液样本采集
15 mL 圆底离心管Genesee Scientific28-101血液样本储存
1 mL 气密玻璃注射器Hamilton81331硬件组装
2.2.9MERU VasImmune血栓染色
20 号 1/2 英寸探针针头McMaster-CarrM919制备 PDMS 装置
20 mL 注射器Henke Sass Wolf5200-X00V0血液样本采集
70% 乙醇Sigma-AldrichEX0281-1气密注射器消毒及载玻片清洁
AK4-Alexa Fluor 647BioLegend304918血栓染色
Alexa Fluor 405 NHS 酯InvitrogenA30000纤维蛋白原标记
Alexa Fluor 555 抗体标记试剂盒InvitrogenA88065MBC 370.2 和 2.2.9 标记
Annexin V-Pacific BlueInvitrogen501121505血栓染色
清洁除尘刷Office Depot911245制备 PDMS 装置
带木盒手工美工刀套装Excel Blades44282制备 PDMS 装置
去离子水 ThermoFisher Scientific 751-628气密注射器清洗
干燥器Bel ArtF420270000PDMS 脱气
一次性多功能实验室刮刀LevGo17211混合硅橡胶基质与固化剂 
染料和生物素去除离心柱ZebaA44296S纤维蛋白原标记
纤维蛋白原Innovative ResearchIHUFBG25MG血栓染色
Fusion 200-X 注射泵Chemyx Inc.0720X硬件组装
肝素 Sigma-AldrichH3149血液样本抗凝
高频发生器Electro-technic product Inc.BD-20制备 PDMS 装置
人 VWF 单体Sino Biological Inc.10973-H08C微流控装置包被
Image J v1.53 软件Fiji, 国立卫生研究院数据分析
倒置显微镜LeicaDM IL LED；滤光立方体：Leica DFT51010；光源：LED5硬件组装
Kimwipes 擦镜纸Kimberly- Clark Professional34120载玻片清洁
鲁尔锁紧帽International Medical Industries, Inc.57100B血液样本采集
MBC 370.2KerafastEBW104血栓染色
显微镜盖玻片Paul Marienfeld GmbH & Co. KGES0107222制备 PDMS 装置
迷你剃须刀片刮铲Stanley28-100制备 PDMS 装置
NanoDrop 2000 紫外-可见分光光度计Thermo ScientificND-2000蛋白质浓度及 F/P 比值测定
烘箱Lab-Line Instruments3512制备 PDMS 装置
PAC-1-Alexa Fluor 647BioLegend362806血栓染色
塑料杯ThermoFisher Scientific S04589混合硅橡胶基质与固化剂 
SU-8 光刻胶主 模具加州大学圣地亚哥分校 Nano3 纳米制造洁净室设施制备 PDMS 装置
Sylgard 184 硅橡胶试剂盒Krayden DowDC4019862PDMS
SZ22-FITC Beckman CoulterIM 1756U血栓染色
管路Cole -Palmer Instrument Co.06422-01硬件组装

参考文献

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