血栓特征分析检测：一种基于微流控技术的生物力学血栓形成全面表征平台

摘要

本研究描述了一种微流控检测方法，该方法利用剪切应力诱导血液中血栓形成，并通过多维度读数对血栓进行表征。该检测可测量血液样本的促血栓倾向，因此在血栓相关疾病的诊断、药物研发以及基础机制研究中具有重要应用价值。

摘要

血栓形成是一种描述血小板和凝血因子在血管内异常积聚的病理状态。尽管许多研究集中于可溶性激动剂诱导的血小板活化作为血栓形成的潜在机制，但血液流动在促进血栓形成过程中的作用却常常被忽视。特别是在动脉中，血栓形成通常与动脉狭窄相关，后者会增加血流中的剪切应力，从而促进血栓生成过程，这一现象被称为生物力学性血栓生成。长期以来，尚无一种生物检测方法能够全面且详细地揭示生物力学性血栓生成的全过程。为解决这一问题，研究人员开发了一种血栓特征分析检测方法，该方法结合了微流控技术与多色荧光成像技术，能够通过七个检测指标对生物力学性血栓生成进行系统表征，涵盖血栓的大小、组成以及血小板活化水平。该血栓特征分析检测可用于评估人类的促血栓倾向及抗血栓药物的疗效，同时也有助于进一步理解动脉血栓形成的潜在机制。

引言

血栓形成是心血管疾病的主要原因，每年在全球范围内导致数百万人死亡¹。目前，在标准临床环境中尚无可用于评估血栓形成风险的生物检测方法。在已商业化的实验室和床旁血液功能检测中，传统的凝血检测和聚集测定法已被证明在预测血栓形成或主要不良心血管事件方面不可靠^2,3,4。全球血栓检测⁵、PFA-100/200⁶以及全局凝血检测^7,8,9,10,11的支持其性能的数据也十分有限。

根据目前的认识，血栓形成过程主要由三种机制促成。除了通常公认的两种机制——即生化介导的血小板聚集和凝血作用——第三种机制是剪切力驱动的血小板聚集，该机制研究较少且常被低估，也被称为 "生物力学血小板聚集"¹²

方案

本方案遵循德克萨斯大学医学分部人类研究伦理委员会的指南，并已获得其批准。实验硬件装置包括一个微流控设备、灌注组件（连接器、管路、注射器和注射泵）以及一台倒置显微镜，该显微镜配备光学部件，可实现明场和多色荧光成像。显微镜使用一个多通道LED光源和一个多通道滤光立方体，以分离四个荧光通道并最大程度减少相互串色：激发光波长分别为391/32、479/33、554/24、638/31，发射光波长分别为435/30、519/25、594/32、695/58。所有实验操作均需佩戴个人防护装备，包括手套、护目镜和实验服。所用试剂和设备列于材料表中。

1. 微流控装置制备

1. 设计一个主模具，包含矩形微通道（200 µm 宽 × 50 µm 高），并在其中设置一个管腔狭窄80%的部位。每个通道均设有独立的进样口和出样口，用于连接管路。图1；参见 补充文件 1 用于原始设计文件）。
2. 根据设计，使用硅片制备SU-8光刻胶母模 通过 标准光刻技术。将模具固定在直径15厘米的培养皿底部（图2A).
3. 按10:1的质量比将硅弹性体试剂盒中的预聚物基质与固化剂混合，制备PDMS混合物。将混合物倒入主模具中

结果

血栓分析实验通过狭窄通道灌注血液，以实现剪切力驱动的血栓形成，并进行实时多色荧光成像，从而获取所形成血栓的多维信息。通过使用第1组和第2组传感器完成实验，可对血栓的多个方面进行表征，包括血栓大小、交联蛋白（血管性血友病因子、纤维蛋白原）的富集程度，以及血小板活化水平（通过P-选择素表达、磷脂酰丝氨酸外翻和整合素α_IIbβ₃活化反映）²¹。

从每次实验中收集的数据均可进行深入分析，以获得“信号” 与. 时间”曲线（参见， 图6）。然而，这种方法耗时较长。另一种方法是选择单个时间点，即每个通道仅选取一幅图像进行数据分析。例如，在血栓形成开始后7.5 min，健康血液中的血栓通常已趋于相对稳定，因此可将该时间点选作数据分析的代表性时间点。²¹如果仅使用一个时间点进行数据分析，则可采用以下步骤获得一个7维血栓特征谱，全面表征血液样本的生物力学促血栓倾向。首先，将每个通道荧光信.......

讨论

通过将微流控狭窄检测与多色荧光成像相结合，血栓分析检测为研究生物力学介导的血栓形成及血小板机械生物学提供了一种便捷而强大的方法。同时，该检测具有广泛的应用价值。例如，可用于筛选特异性抑制生物力学诱导血小板聚集的抗血栓药物，其分子靶点和作用机制可通过效应条形码进行推断²¹。该方法还可用于研究特定人群的促血栓倾向，以识别和表征心血管疾病风险因素的影响，并评估个体的促血栓倾向。我们相信，血栓分析检测在临床转化方面具有广阔前景，可用于评估个体的促血栓倾向，并协助临床医生为患者制定个性化的抗血栓治疗方案。

血栓分析检测具有高度灵活性。分子传感器可根据定制需求自由更换或移除。例如，若实验者仅关注血栓大小和 E⁺ α_IIbβ₃ 水平，则只需进行一次实验，使用含有 SZ22-FITC 和 MBC 370.2-Alexa Fluor 555 的血液样本即可。如果实验者希望检测此处列出的传感器组1和组2中未包含的其他生物标志物，只要所标记的荧光染料与通道的光学设置兼容，即可添加相应的分子传.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 mL 注射器	Henke Sass Wolf	5100-X00V0	血液样本采集
15 mL 圆底离心管	Genesee Scientific	28-101	血液样本储存
1 mL 气密玻璃注射器	Hamilton	81331	硬件组装
2.2.9	MERU VasImmune		血栓染色
20 号 1/2 英寸探针针头	McMaster-Carr	M919	制备 PDMS 装置
20 mL 注射器	Henke Sass Wolf	5200-X00V0	血液样本采集
70% 乙醇	Sigma-Aldrich	EX0281-1	气密注射器消毒及载玻片清洁
AK4-Alexa Fluor 647	BioLegend	304918	血栓染色
Alexa Fluor 405 NHS 酯	Invitrogen	A30000	纤维蛋白原标记
Alexa Fluor 555 抗体标记试剂盒	Invitrogen	A88065	MBC 370.2 和 2.2.9 标记
Annexin V-Pacific Blue	Invitrogen	501121505	血栓染色
清洁除尘刷	Office Depot	911245	制备 PDMS 装置
带木盒手工美工刀套装	Excel Blades	44282	制备 PDMS 装置
去离子水	ThermoFisher Scientific	751-628	气密注射器清洗
干燥器	Bel Art	F420270000	PDMS 脱气
一次性多功能实验室刮刀	LevGo	17211	混合硅橡胶基质与固化剂
染料和生物素去除离心柱	Zeba	A44296S	纤维蛋白原标记
纤维蛋白原	Innovative Research	IHUFBG25MG	血栓染色
Fusion 200-X 注射泵	Chemyx Inc.	0720X	硬件组装
肝素	Sigma-Aldrich	H3149	血液样本抗凝
高频发生器	Electro-technic product Inc.	BD-20	制备 PDMS 装置
人 VWF 单体	Sino Biological Inc.	10973-H08C	微流控装置包被
Image J v1.53 软件	Fiji, 国立卫生研究院		数据分析
倒置显微镜	Leica	DM IL LED；滤光立方体：Leica DFT51010；光源：LED5	硬件组装
Kimwipes 擦镜纸	Kimberly- Clark Professional	34120	载玻片清洁
鲁尔锁紧帽	International Medical Industries, Inc.	57100B	血液样本采集
MBC 370.2	Kerafast	EBW104	血栓染色
显微镜盖玻片	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	ES0107222	制备 PDMS 装置
迷你剃须刀片刮铲	Stanley	28-100	制备 PDMS 装置
NanoDrop 2000 紫外-可见分光光度计	Thermo Scientific	ND-2000	蛋白质浓度及 F/P 比值测定
烘箱	Lab-Line Instruments	3512	制备 PDMS 装置
PAC-1-Alexa Fluor 647	BioLegend	362806	血栓染色
塑料杯	ThermoFisher Scientific	S04589	混合硅橡胶基质与固化剂
SU-8 光刻胶主 模具	加州大学圣地亚哥分校 Nano3 纳米制造洁净室设施		制备 PDMS 装置
Sylgard 184 硅橡胶试剂盒	Krayden Dow	DC4019862	PDMS
SZ22-FITC	Beckman Coulter	IM 1756U	血栓染色
管路	Cole -Palmer Instrument Co.	06422-01	硬件组装