本文介绍了一种利用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）同时定量人血浆中同位素标记和内源性视黄醇类物质的实验方案，其柱上检测限可达6 fmol。该方法采用简单的样品提取步骤和较短的分析运行时间，可实现高通量的样本检测。
本文内容
摘要
摘要
视黄醇同位素稀释（RID）法通过稳定同位素在体内维生素A库中的稀释情况，来估算人体内维生素A的总储存量（TBS）。为此，必须借助质谱法准确且高效地测定血浆中标记与非标记视黄醇的同位素比值。为避免繁琐且耗时的提取和/或纯化步骤（如制备型高效液相色谱和衍生化），采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）对标记和非标记类视黄醇进行快速、灵敏且同步的分析。该方法包含两级检测：（i）首先对母体（前体）离子进行质荷比（m/z）分离，随后（ii）检测其断裂产生的子代（产物）离子。该方法灵敏度高，柱上视黄醇检测限可低至6 fmol。尽管串联质谱具有诸多优势，但仍需通过液相色谱分离视黄醇与视黄酯，因为在电离过程中末端官能团会丢失，导致母离子（m/z为269）和子离子的碎裂模式相似。本文描述了通过溶剂萃取法从血浆中分离内源性及标记的（13C或2H）视黄醇，随后在正离子模式下采用大气压化学电离（APCI）进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）定量分析。
引言
维生素A是一种对人类健康至关重要的脂溶性营养素1。维生素A缺乏会增加严重感染性疾病发病率和死亡率的风险，据估计其全球患病率为29%，在撒哈拉以南非洲（48%）和南亚（44%）地区水平更高2。补充维生素A是降低儿童超额死亡率的有效策略，特别是在撒哈拉以南非洲等高风险地区尤为显著3。然而，每半年一次的维生素A补充措施，与主食中大规模强化维生素A以及微量营养素粉剂的分发相结合，往往由不同的公共和私营机构分别管理，可能导致个体摄入过量的维生素A4,5,6,7,8,9,10。因此，理想的维生素A生物标志物应能够覆盖从缺乏到中毒的整个维生素A营养状态范围。视黄醇同位素稀释（RID）法目前是评估人体总维生素A储存量最准确的间接方法11,12,13，并已通过与肝脏维生素A浓度的对比得到验证，后者被认为是评估维生素A营养状况的最佳生化指标14,15。该方法基于以下原理：口服给予的稳定同位素标记的维生素A示踪剂与体内非标记的维生素A（即被示踪物）在可交换的体池中混合。在给药后特定时间点测定血浆中视黄醇的特异性活性（即血浆中标记的视黄醇示踪剂与总视黄醇的比值（血浆中示踪剂/被示踪物）），即可利用RID计算公式估算维生素A的营养状况11,12,13。
为了准确且精确地测定血浆中视黄醇示踪剂和非标记视黄醇的浓度，已有多种方法被用于定量稳定同位素标记的维生素A，包括气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）、同位素比值质谱技术（IRMS）以及液相色谱-串联质谱技术（LC-MS/MS）16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26。其中，LC-MS/MS技术因其高灵敏度、高特异性、操作简便，并能够直接检测复杂基质中的天然及标记视黄醇，具有显著优势。因此，为了避免耗时的样品前处理步骤（例如为IRMS进行制备型高效液相色谱分离，或为GC-MS进行衍生化处理），LC-MS/MS分析成为理想选择，该方法仅需简单的提取流程，对稳定同位素的检测限极低，且运行时间短7,18,19。本文介绍了一种更新的LC-MS/MS方法，具有更短的运行时间、简化的操作流程，同时保持高灵敏度和高选择性，是适用于大规模人群干预和观察性研究中样本高通量分析的极为合适的方法，尤其适用于需要评估人体维生素A总储存量的研究。
方案
本研究获得了菲律宾大学马尼拉分校研究伦理委员会（IRB ID：UPMREB 2016-282-01）、加州大学戴维斯分校机构审查委员会（IRB ID：903681-2）的批准，并在 ClinicalTrials.gov 注册（ID：NCT03030339）。本研究还获得了加纳卫生服务伦理审查委员会（GHS-ERC 012/07/20）的批准，试验在 https://clinicaltrials.gov 注册，编号为 NCT04632771。
1. 内标物的制备
- 内标储备液：配制浓度为1 mg/mL的乙酸视黄酯乙醇溶液，其中含0.1%丁基羟基甲苯（BHT；w/v）。将储备液分装成若干份，于-80 °C保存，最长可使用3个月。
注意：内标可使用未标记的乙酸视黄酯或标记的乙酸视黄酯。若使用未标记的乙酸视黄酯作为标准品，必须实现乙酸视黄酯与视黄醇峰之间的基线分离（见图1）。 - 内标工作液：将储备液（1 mg/mL）稀释至1 µg/mL，制备内标工作液。首先取60 µL储备液加入300 µL乙醇中稀释，再从中取60 µL加入10,000 µL乙醇中进一步稀释。每份样品中加入20 µL该工作液，相当于添加20 ng乙酸视黄酯。
注意：内标工作液可在-20 °C下保存，最长使用1周。
2. 校准标准品的制备
- 校准储备标准品：分别配制示踪物（tracee）和标记物（tracer）的校准储备标准溶液，浓度为1 mg/mL的视黄醇，溶于含0.1% BHT（w/v）的乙醇中。分装储备液，于-80 °C保存，最长可保存3个月。每份分装液仅使用一次，避免反复冻融。
- 校准工作标准溶液：取100 µL校准储备标准溶液，用容量瓶定容至10,000 µL乙醇中。使用石英比色皿在分光光度计中于325 nm处测定稀释后校准储备溶液的浓度（详见表1）。
- 取适量稀释后的校准储备标准溶液，用50%乙醇和50%乙腈/dH2O（70:30，v/v）将其浓度调整为8 µM/L（用于示踪物），或用100%乙醇将其浓度调整为2 µM/L（用于标记物）。
- 使用50%乙醇和50%乙腈/dH2O（70:30，v/v）配制示踪物的七种不同浓度的双份校准标准品。若提取200 µL血浆，示踪物校准标准品浓度范围应为6–0.03 µM/L。
注意：为实现准确定量，血浆中同位素标记的视黄醇和视黄酯采用双份七点校准曲线进行定量27。校准曲线的最高点浓度应为血浆中示踪物和标记物预期最高浓度的两倍，并需考虑从原始血浆体积浓缩后提取物的浓度因子。校准标准品的配制方法详见补充文件1。
3. 血浆中类视黄醇的提取
- 从-80 °C冰箱中取出血浆样本，在室温下解冻（约30分钟）。
- 解冻后，涡旋振荡每个样品，并短暂离心数秒，以确保管盖内无残留血浆；随后将样品置于冰上。
- 开启制冷离心机，使其冷却至 4 °C。用带螺旋盖的 15 mL 玻璃管（标注受试者编号和时间点），移取 200 µL 去离子水（dH2O）加入每个样品管中。
- 从内标工作液中，用移液器吸取20 µL内标混合液加入玻璃试管中。
- 使用移液器，将 200 µL 血浆加入含有内标和 dH₂O 的相应试管中2O.
- 将400 µL乙醇移液至每个样品管中，轻轻涡旋混匀乙醇与血浆。避免使用涡旋振荡器，以防蛋白质残留粘附于玻璃管壁。
- 第一次己烷萃取时，向每根试管中加入 2 mL 己烷，并拧紧试管盖。
- 将试管放入摇床中，以15,000 rpm振荡30分钟。将试管转移至冷藏离心机中，以1,800 rpm离心 x g 4 °C 下离心 10 分钟。
- 使用玻璃巴斯德吸管，将上清液转移至一组干净且已标记的玻璃试管中。注意避免转移蛋白质沉淀或水分。
- 向剩余残渣中再加入2 mL正己烷，进行第二次正己烷萃取，拧紧管盖，将试管置于轨道摇床中，在15,000 rpm条件下振荡15 min。
- 将试管转移至预冷的离心机中，以1,800 x g离心 g 在4 °C下离心10分钟。使用玻璃巴斯德吸管，将上清液分别转移至含有第一次正己烷萃取上清液（步骤3.9）的玻璃试管中，每个样品对应一个试管。
- 在温和的氮气流下蒸发合并的己烷提取溶剂（每个样品的第一次和第二次提取上清液）2 在暗处的通风橱中静置约30分钟。将加热块温度设为35 °C。
- 将干燥的残留物重悬于50 µL乙醇中，短暂涡旋，然后加入50 µL流动相（70:30乙腈/dH2O (v/v)，再次涡旋混匀。
注意：仅当目标为定量分析视黄醇酯时，才应使用 100 µL 乙醇重新溶解干燥残留物。 - 转移至已标记的0.5 mL微量离心管中。在16,900 x g 5 分钟。
- 将80 µL重悬的残留物转移至带有300 µL内插管的棕色HPLC小瓶中。立即盖紧瓶盖，防止溶剂因蒸发而损失。
- 将玻璃小瓶转移至冻存盒中，用研究名称、提取日期和样本编号进行标记，并于-80 °C冰箱中保存至分析前。
注意：储存样本的分析必须在3至5天内完成。通常，200 µL的血浆样本量足以在给药后90天内检测到标记的维生素A示踪剂。然而，若保持血浆/水/乙醇的体积比为1:1:2，则血浆体积可调整至400 µL。
4. 内标对照样品的制备
- 用移液器将120 µL乙醇加入微量离心管中，再加入200 µL（70:30）乙腈/dH2O（v/v），涡旋混匀，制备乙醇/流动相溶液。
- 向三个独立的0.6 mL离心管中，分别加入20 µL内标工作溶液。
- 向各管中加入80 µL已制备的乙醇/流动相溶液，涡旋混匀。将三个内标对照样品转移至含300 µL内插管的棕色HPLC小瓶中，并立即盖紧瓶盖，防止溶剂因蒸发而损失。
5. 血浆样本标准
- 为制备实验室标准品，需获取足够的血浆体积，以确保每轮分析至少可检测三个样品。所需血浆总体积取决于需分析的样品数量。
- 将实验室标准品血浆分装至若干小体积冻存管中，每管体积应满足每次分析所需，并于 -80 °C 保存。
注意：实验室标准品必须含有在未知样品中使用的同位素标记的视黄醇示踪剂。可通过合并志愿者样品至同一份分装样本来获得足够材料。 - 每次分析运行时，按照步骤 3 的方法，以与未知血浆样品相同的体积提取至少三个实验室标准品血浆样品。
- 将实验室标准品血浆样品放置在样品架中，各样品之间至少间隔 10 个未知血浆样品。使用实验室标准品血浆计算日内和日间变异。
6. 外部标准样品
- 获取经认证的外部标准品样本，并在 -80 °C 下保存。一种广泛使用的经认证外部标准品是美国国家标准与技术研究院（NIST）标准参考物质 SRM 968。
- 每次分析时，使用步骤 3 的方法，至少提取四个与未知血浆样本相同体积的血浆外部标准品样本。使用外部标准品样本来验证所获得结果的准确性。
7. 人工化合物优化
- 确保APCI加热雾化探针已安装在质谱源腔体内。为每种稳定同位素示踪剂配制输注溶液，浓度约为1 µg/mL。
注：溶液应与流动相相似，并含有一定量酸以促进质子化。推荐使用的溶剂为含0.1%甲酸（v/v）的1:1乙腈/dH2O。 - 用输注溶液填充1 mL鲁尔锁式汉密尔顿注射器，然后通过接地接头使用PEEK管将注射器连接至离子源。设置输注流速为10 µL/s。
- 选择手动调谐，并确保仪器处于调谐与校准模式。启动注射泵，并在正离子模式下选择Q1扫描类型。
- 设置质荷比下限为50 Da，上限约为目标化合物分子量以上100 Da。
- 设置扫描循环次数为500次，扫描速率为200 Da/s。点击开始，并在质谱窗口中观察信号。
- 等待信号稳定后，检查是否出现预期的m/z峰。由于质谱处于正离子模式，需考虑[M+H]+和[M+2H]2+峰。
- 目标峰强度应约为1e6，总离子流（TIC）应在1e7–1e9范围内。持续输注直至信号稳定，然后点击停止。此时应观察到由输注溶液中化合物产生的明显高强度峰。总离子流（TIC）将被显示，表示所有离子信号的总和。
注：12C视黄醇的预期质量为269 Da，因此使用50–300 Da的范围可适当显示[M+H]+和[M+2H]2+离子。
8. 产物离子（MS2）扫描 / 碰撞诱导解离（CE）谱图检查
- 将起始质量设为较低的质量，例如 50 Da，终止质量设为略高于 Q1 质量的值（例如，12C 视黄醇为 269.1）。将循环次数设为 5，碰撞能量（CE）设为 10。检查 Q1 质量是否作为前体离子出现。若未出现更小的碎片离子，则将 CE 增加至 20。
- 随着 CE 的增加，将生成更多的产物离子。继续提高 CE，直至谱图右侧的前体离子完全消失。进一步增加 CE 以观察可能发生的二级碎裂。
9. MRM 扫描
- 从 MS2 扫描中选择丰度最高或最合适的三个产物离子，用于进一步优化。
- 针对每个产物离子，输入测得的 Q1（前体）质量和 Q3（产物）质量，将驻留时间（Dwell Time）设为 200 ms，并根据情况为每个碎片命名（例如，12C_Frag_93）。
- 选择碰撞能量，并利用梯度功能确定最佳碰撞能量（CE）值，然后在每条碎片对应的 CE 列中填入优化后的 CE 值。
- 在完成 CE 优化后，进一步优化去簇电位（Declustering Potential, DP），以尽量减少同量异位素干扰；每次针对一个跃迁过程优化碰撞池出口电位（Collision Cell Exit Potential, CXP）。
10. 源/气体优化
- 这些参数无法自动优化。如果需要提高信号强度，请执行手动优化过程。每次只改变一个参数，并比较信号是否增强、保持不变或减弱。
11. 液相色谱条件
- 进行色谱分析时，使用含0.1% (v/v) 甲酸的dH2O（A相）和含0.1% (v/v) 甲酸的乙腈（B相）组成的二元流动相梯度。
- 根据所使用的液相色谱系统，分析视黄醇时可选择配备4 mm × 2 mm C18保护柱的100 mm × 2.1 mm（3 µm）ABZ PLUS色谱柱（用于高效液相色谱HPLC），或配备RP18 FIT柱的100 mm × 2.1 mm（1.7 µm）Premier BEH Shield色谱柱（用于超高压液相色谱UPLC）。HPLC和UPLC系统的色谱柱温度应分别维持在40 °C或50 °C。
- 将10 µL血浆提取物直接进样至色谱柱。以0.4 mL/min的流速洗脱分析物。对于HPLC系统，线性梯度程序如下：0–6.0 min，60% B升至95% B；6.1–13.0 min，100% B；13.1–14.0 min，100% B降至60% B；14.0–17.0 min，保持60% B。对于UPLC系统，线性梯度程序取决于研究目的。若仅需测定视黄醇，则梯度程序为：0–1.0 min，40% B升至60% B；1.0–6.0 min，60% B升至95% B；6.5–7.5 min，100% B；7.5–7.6 min，100% B降至40% B；7.6–8.5 min，保持40% B。若需同时分析视黄醇及其酯类，则梯度程序为：0–3.0 min，60% B升至95% B；3.5–6.5 min，100% B；6.5–7.0 min，100% B降至60% B；7.0–8.5 min，保持60% B。
12. 二级质谱条件
- 在正离子模式下，采用大气压化学电离（APCI）进行串联质谱（MS/MS）分析。选择APCI而非电喷雾电离，是因为前者可提供更高的信号强度、更宽的线性范围，并具有更低的背景噪声26。
- 有关[12C]视黄醇、[13C10]视黄醇和[2H6]视黄醇及其相应酯类/乙酸酯在API4000和QTRAP 5500质谱仪上采用选定反应监测（SRM）参数时各自的质量跃迁，请参见表2、表3以及图2。
注意：视黄醇、视黄酯和视黄基乙酸酯的选定离子监测均使用m/z 269的相同碎片离子进行APCI定量，因为该离子对应于质子化分子失去水、脂肪酸或乙酸所形成的产物。由于液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）能够将视黄醇峰与其酯类峰分离，因此单次进样即可在同一份样品中同时测定视黄醇和视黄酯组分的同位素富集度。
13. 视黄醇的定量
- 根据各自的校准标准，测定样品中[12C]视黄醇、[2H6]视黄醇和[13C10]视黄醇的浓度。
- 通过各样品内标浓度相对于内标对照样品的回收率，确定提取过程中的损失。
- 使用美国国家标准与技术研究院（National Institute of Standards and Technology, NIST）标准参考物质（SRM）968，对血浆视黄醇浓度进行确认。
结果
为了说明该分析方法在不同色谱系统中分析稳定同位素标记的视黄醇的有效性，我们展示了两项不同研究的结果。
使用配备前置HPLC的API4000时，分析了111名年龄为12至18个月的菲律宾儿童的血浆样本。这些儿童在第0天口服了400 µg（1.17 µmol）[13C10]视黄醇乙酸酯，随后在给药后第4天采集了6 mL血液样本7,28。血浆总视黄醇的平均浓度为1.1 µmol/L，平均[13C10]视黄醇浓度为0.007 µmol/L。由于在m/z 279至100的转换过程中背景噪声的平均峰高约为50 cps（图1），因此将[13C10]视黄醇的检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别设定为150 cps和500 cps，相当于进样柱上6 fmol和19 fmol。由于在[12C]视黄醇与所用视黄醇乙酸酯内标物之间获得了良好的基线分离，因此无需使用稳定同位素标记的视黄醇乙酸酯。
使用UPLC与QTRAP 5500联用可实现更快的色谱分离，运行时间可低于10分钟。根据研究问题的不同，可采用两种不同的分离方法：（i）若目标是测定以非标记的视黄醇乙酸酯作为内标物时的天然视黄醇及其同位素标记形式，则视黄醇（4.37分钟）与视黄醇乙酸酯（5.33分钟）之间的保留时间可实现良好的基线分离（图3）；（ii）若目标是同时分离天然和同位素标记的视黄醇以及天然和标记的视黄酯，则可在8.5分钟的运行时间内实现良好分离（图4）。然而，由于视黄醇（2.10分钟）与视黄醇乙酸酯（2.43分钟）的保留时间较为接近，建议改用同位素标记的视黄醇乙酸酯（[2H4]视黄醇乙酸酯）。本示例中，血清样本来自80名育龄加纳女性，她们接受了2 mg视黄醇当量剂量的[2H6]视黄醇乙酸酯和[13C10]视黄醇乙酸酯，给药后21天采集血液样本。血清总视黄醇平均浓度为1.89 µmol/L，其中平均[2H6]视黄醇浓度为0.027 µmol/L，平均[13C10]视黄醇浓度为0.025 µmol/L。
该方法实现了较低的检测限（LOD = 6 fmol；LOQ = 19 fmol 进样量），在检测稳定同位素标记的视黄醇时表现出高灵敏度和特异性，并能清晰地实现内源性视黄醇与内标物之间的基线分离。此外，尽管保留时间存在差异，该方法在高效液相色谱（HPLC）和超高效液相色谱（UPLC）系统中均能有效运行。使用同位素标记的内标物（[2H4]视黄醇乙酸酯）可确保在较快的UPLC条件下对视黄酯进行准确定量。通过与美国国家标准与技术研究院（NIST）认证的参考标准物质进行比对验证，证实了该方法的准确性；日内和日间变异系数分别为2.3%和4.4%，表明其具有优异的精密度和可重复性。对来自两个不同人群（菲律宾儿童和加纳妇女）的血浆/血清样本进行成功分析，这些人群采用了不同的给药方案，结果表明该方法在多种营养学研究中具有良好的稳健性和实际应用价值。
图1使用 API4000 质谱仪的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）色谱图 口服0.4 mg [后4天获得血清视黄醇的色谱图13C10] 视黄醇乙酸酯。对质荷比（m/z）从269到93的选定反应监测（SRM）显示了[12C]视黄醇（RT = 5.06 min）和[12C] 乙酸视黄酯（RT = 5.83 分钟）作为内标（IS）。该 [13C10] 视黄醇在 m/z 279 至 100 的信号强度显著超过检测限（LOD）和定量限（LOQ）。色谱条件：（A) 二元流动相梯度，包含 dH2O 中 0.1%（v/v）甲酸和（B) 乙腈中含0.1%（v/v）甲酸；流速0.4 mL/min，线性梯度洗脱程序：60% B升至95% B，6.0 min；6.1 min至13.0 min为100% B；13.1 min至14.0 min由100% B降至60% B；14.0 min至17.0 min保持60% B；色谱柱为100 mm × 2.1 mm（3 µm）ABZ PLUS柱，配备4 mm × 2 mm C18保护柱，柱温维持在40 °C。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图 2：APCI-MS/MS 产物离子质谱图。 流通进样 APCI-MS/MS 产物离子质谱图，分别为 (A) m/z 269 [12C] 视黄醇、(B) m/z 273 [2H4] 视黄醇、(C) m/z 275 [2H6] 视黄醇 和 (D) m/z 279 [13C10] 视黄醇，在正离子模式下获得。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：使用 QTRAP 5500 质谱仪获得的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）色谱图。 口服摄入1.0 mg [2H6] 视黄醇乙酸酯以及口服摄入 1.0 mg [13C10] 视黄醇乙酸酯。选择反应监测（SRM）的 m/z 269→93 显示了[12C] 视黄醇峰（RT = 4.37 min）和视黄基醋酸酯（RT = 5.33 min）作为内标（IS）；2H6] 视黄醇（RT = 4.36 min）在 m/z 275→96 处的信号；以及 [13C10] 视黄醇峰（RT = 4.38）在 m/z 279→100。色谱条件：（A含0.1%（v/v）甲酸的二元流动相梯度洗脱2O 和 (B) 乙腈中含0.1%（v/v）甲酸；流速为0.4 ml/min，线性梯度洗脱程序如下：0–1.0 min，40% B升至60% B；1.0–6.0 min，60% B升至95% B；6.5–7.5 min，100% B；7.5–7.6 min，100% B降至40% B；7.6–8.5 min，保持40% B；色谱柱为100 mm × 2.1 mm（1.7 µm）AcquityTM Premier BEH Shield RP18 VanGuard FIT，柱温维持在50°C。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图4使用QTRAP 5500质谱仪检测视黄醇和视黄酯的LC-MS/MS色谱图 口服摄入1.0 mg [的血浆室内标准品在6小时后提取的典型LC-MS/MS色谱图2H6] 视黄醇乙酸酯，以及口服摄入 1.0 mg [13C10] 视黄醇乙酸酯。选择反应监测（SRM）的 m/z 269→93 显示了[12C]视黄醇峰（保留时间 = 2.10 分钟）；[2H4]视黄醇乙酸酯在质荷比 m/z 273→94（保留时间 RT = 2.43 分钟）作为内标（IS）；分离[2H6]视黄醇（RT = 2.09 分钟）和[2H6]视黄醇棕榈酸酯（RT = 5.11 min）在 m/z 275→96 处出现峰；以及 [13C10]视黄醇峰（RT = 2.10）在 m/z 279→100。色谱条件：（A) 含0.1%（v/v）甲酸的二元流动相梯度洗脱2O 和 (B) 乙腈中含0.1%（v/v）甲酸；流速为0.4 ml/min，线性梯度洗脱程序如下：0至3.0分钟，60% B升至95% B；3.5至6.5分钟，100% B；6.5至7.0分钟，100% B降至60% B；7.0至8.5分钟，维持60% B；色谱柱为100 mm × 2.1 mm（1.7 µm）AcquityTM Premier BEH Shield RP18 VanGuard FIT，柱温保持在50 °C。 请点击此处以查看此图的放大版本。
| 参数 | |
| 视黄醇在乙醇中的摩尔吸光系数（ɛ）： | 52,770 M-1 cm-1 |
| 稀释倍数： | 100（100 µL 储备校准标准品溶于 10 mL 乙醇中） |
| 测得的平均吸光度： | 0.575 |
| 计算 | |
| 乙醇中[12C]视黄醇的浓度（mol）： | 浓度（mol） = 吸光度 / ɛ × 比色皿光程 |
| = 0.575 / 52770 M-1 cm-1 × 1 cm = 1.09 × 10-5 M | |
| 校正稀释倍数： | 1.09 × 10-5 M × 100 = 1.09 × 10-3 M 或 1.09 mM |
表1：校准标准视黄醇储备液浓度的测定。
| 分析物 | MRM 转换 (m/z) | 去簇电位 (V) | 入口电位 (V) | 碰撞能量 (eV) | 碰撞出口电位 (V) |
| [12C]-视黄醇/酯 | 269→93 | 51 | 10 | 27 | 6 |
| [2H4]视黄基乙酸酯 | 273→94 | 51 | 10 | 27 | 6 |
| [2H6]视黄醇/酯 | 275→96 | 51 | 10 | 27 | 6 |
| [13C10]-视黄醇/酯 | 279→100 | 41 | 10 | 27 | 6 |
表2：选择反应监测（SRM）参数。 使用API4000测定[12C]视黄醇、[13C10]视黄醇和[2H6]视黄醇及其相应酯类的参数
| 分析物 | MRM 转换 (m/z) | 去簇电位 (V) | 入口电位 (V) | 碰撞能量 (eV) | 碰撞出口电位 (V) |
| [12C]-视黄醇/酯 | 269→93 | 94 | 10 | 33 | 8 |
| [2H4]视黄基乙酸酯 | 273→94 | 54 | 10 | 20 | 11 |
| [2H6]视黄醇/酯 | 275→96 | 69 | 10 | 25 | 3 |
| [13C10]-视黄醇/酯 | 279→100 | 102 | 10 | 35 | 9 |
表3：选择反应监测（SRM）参数。 使用QTRAP 5500检测 [12C] 视黄醇、[13C10] 视黄醇和 [2H6] 视黄醇及其相应酯化物的参数
补充文件 1：为示踪剂制备七个不同浓度的校准标准品 请点击此处下载该文件。
讨论
本文所述的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法具有极高的灵敏度，检测限可低至 6 fmol/L，从而使得研究者仅需使用 100–200 µL 的血浆即可完成分析19。该靶向串联质谱方法在同时利用定量离子和确证离子时，对视黄醇同位素异构体的身份确认尤为有力18。然而，由于同位素标记的视黄醇类化合物在体内的浓度显著低于生理水平的非标记视黄醇类化合物，因此含有标记视黄醇和视黄酯的血浆样本可能需要额外的浓缩步骤。这一需求取决于多个因素，包括给药后采血的时间点、口服示踪剂的浓度以及 LC-MS/MS 系统的灵敏度。历史上曾采用较高剂量的示踪剂以弥补早期质谱仪灵敏度较低的问题，但近年来的技术进步已使得低剂量示踪成为可能13。在本文所示例中，较高的口服剂量可在较晚的时间点（如第 21 天 versus 第 4 天）仍维持较高的稳定同位素标记视黄醇水平。
由于视黄醇酯的末端官能团在电离过程中会丢失，因此视黄醇和视黄醇酯均表现出相同的母离子质荷比（m/z 269）以及相似的子离子碎片模式。因此，色谱分离对于分别测定两者的浓度至关重要18。此外，由于内源性视黄醇同位素异构体中13C稳定同位素的天然丰度较高，建议在视黄醇示踪剂中引入超过三个13C原子，以避免需要校正人血浆中视黄醇基线水平的天然13C富集问题29。
血浆样本在进行同位素分析前需经过两步处理。首先，需要对血浆样本进行去蛋白处理，随后使用非极性溶剂提取视黄醇和视黄酯，从而形成两相体系18,19,20。尽管上述方案可获得清晰的相分离，但关键在于不得扰动或收集两相体系中的界面层，否则将延长干燥时间并降低分析的准确性。此外，本课题组还探索了视黄类化合物的单相提取法20。具体操作为：将200 µL血浆样本加入2 mL塑料微量离心管中，使用乙醇与乙酸乙酯的混合液提取视黄类化合物。该提取方案可实现对视黄醇以及极性更强的视黄类化合物（如视黄酸异构体）的分析，其回收率与两相提取法相当，且与Kane和Napoli报道的一步乙腈提取法效果相近30。
由于类视黄醇在暴露于紫外光和热时易发生氧化和异构化，因此必须尽快完成分析，并在血浆的采集、处理和储存过程中采取常规预防措施30。传统的稳定同位素标记类视黄醇分析方法需要耗时的分离和/或衍生化步骤。气相色谱-质谱（GC-MS）分析需先使用高效液相色谱法（HPLC）从人血清中分离出视黄醇组分，然后对视黄醇进行衍生化22。尽管气相色谱-碳同位素比质谱法（GC-C-IRMS）无需衍生化，但仍建议采用两个独立的HPLC纯化步骤预先分离视黄醇17,25,31，并且还需测定样本人群中人血浆视黄醇的基线天然13C富集度17,32。相比之下，本文所述的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法具有多项优势。该方法避免了复杂且耗时的提取和/或纯化过程，能够快速、灵敏地同时分析视黄酯和游离视黄醇16,18,26,32。此外，该方法具有高准确度和低变异性的特点，适用于不同的LC-MS/MS系统，因而具有良好的实用性。
披露
作者声明无任何利益冲突。
致谢
本工作的支持由比尔 & 比尔及梅琳达·盖茨基金会（项目编号：OPP1115464）和维也纳国际原子能机构（IAEA）（项目编号：E4.30.30）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 溶剂 | |||
| 色谱纯无水乙醇 | Fisher | 10428671 | |
| 色谱纯乙腈 | Fisher | 10660131 | |
| 95% 正己烷，用于色谱分析，经认证的 HPLC 级 | Fisher | H/0406/17 | |
| 色谱纯异丙醇 | VWR | 20880.32 | |
| 色谱纯异丙醇 | VWR | 20880.32 | |
| 甲醇 99%，2.5 L | Thermo Scientific | 11367996 | |
| 标准品/同位素 | |||
| 全反式视黄醇 | BioXtra | 95144 | |
| 视黄醇乙酸酯 | Sigma | PHR1236 | |
| 稳定同位素标记的视黄醇： | ReseaChem/Buchem BV | ||
| 稳定同位素标记的视黄醇乙酸酯： | ReseaChem/Buchem BV | N/A | 可使用多种稳定同位素进行 RID 方法。不同商业可得同位素列于表 1 中。 |
| 维生素 A (19,19,19,20,20,20-D6) | |||
| 维生素 A (8,9,10,11,12,13,14,15,19,20-13C10) | |||
| 维生素 A 乙酸酯 (10,19,19,19-D4) | |||
| 维生素 A 乙酸酯 (19,19,19,20,20,20-D6) | |||
| 维生素 A 乙酸酯 (8,9,10,11,12,13,14,15,19,20-13C10) | |||
| 设备 | |||
| 5 ml 可调式溶剂分配器 | Sigma-Aldrich | Z627607-1EA | |
| ABI 4000 液相色谱-串联质谱仪 (LC-MS/MS) | AB Sciex | ||
| 分析天平 | Fisher | 13592970 | |
| 毛细管活塞（移液吸头）CP100 10x96 TIPACK | Gilson | FD148314 | |
| 毛细管活塞 CP250ST 6x96 | Gilson | F148714 | |
| 通风柜 | |||
| Microman E M100E 移液器（正向置换式） | Gilson | FD10004 | |
| Microman E M250E 移液器（正向置换式） | Gilson | FD10005 | |
| Pipetman P100，10–100 µl，金属弹射器 | Gilson | F114057M | |
| Pipetman P1000，100–1000 µl，金属弹射器 | Gilson | F114059M | |
| Pipetman P20，2–20 µl，金属弹射器 | Gilson | F144056M | |
| QTRAP 5500 液相色谱-串联质谱仪 (LC-MS/MS) | AB Sciex | ||
| 冷冻离心机 5810 R | Eppendorf | ||
| 超声水浴槽 | VWR | USC100T | |
| 分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | A51119600C | |
| Techne 样品浓缩仪和加热块 | VWR | ||
| Vibrax VXR Basic 摇床 | IKA | 0002819002 | |
| 涡旋混合器；MS3 basic IKA | Fisher | MPR-555-050L | |
| VX2 试管附件 - werke typ VX2 | IKA | 0000568900 | |
| 耗材 | |||
| 1.5 ml 微量离心管 | Fisher | FB74323 | |
| 100 mm × 2.1 mm (1.7 μm) AcquityTM Premier BEH Shield RP18 VanGuard FIT 色谱柱 | Waters | 186009498 | |
| 100 mm × 2.1 mm (3 µm) Supelcosil ABZ PLUS 色谱柱 | Supelco | 57917 | |
| 1000 µl 移液吸头 | Starlab | S1122-1830 | |
| 100 ml 容量瓶 | Fisher | 11323644 | Pyrex 硼硅酸盐玻璃 A 级认证容量瓶 |
| 200 µl 移液吸头 | Starlab | S1120-8810 | |
| 4 mm × 2 mm SecurityGuard C18 保护柱芯 | Phenomenex | AJ0-4286 | |
| 50 ml 容量瓶 | Fisher | 11313644 | Pyrex 硼硅酸盐玻璃 A 级认证容量瓶 |
| 带内插管的 9 mm 棕色玻璃小瓶 | Fisher | 11583680 | |
| 9 mm 螺纹瓶盖 | Fisher | 13206419 | |
| 纸板冷冻盒 | Starlab | A9623-8181 | |
| Hellma 紫外石英比色皿 | SLS | CEL1600 | |
| 氮气（最高纯度且无氧） | BOC | ||
| 巴斯德移液管 | Fisher | 11546963 | |
| Pyrex 培养管 100×16 mm | Corning | CLS9944916 | |
| 螺口盖，聚四氟乙烯（PTFE）衬垫，16 mm | Corning | CLS999815 | |
| 2 ml 棕色玻璃小瓶，带聚四氟乙烯（PTFE）盖 | Fisher | 11573542 | |
| 9 mm 小瓶螺帽，硅胶白色/聚四氟乙烯（PTFE）红色 | Thermo | 13206419 |
参考文献
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