我们提供一种微创方案，用于将人干细胞来源的胰腺干细胞胰岛移植到免疫缺陷小鼠的肌肉内 体内 植入及后续分析。
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本文内容
摘要
摘要
人多能干细胞（hPSC）来源的胰腺内分泌细胞是糖尿病细胞治疗和疾病建模的有前景的细胞来源。尽管已有多种分化方案被建立， 体内 植入通常是研究细胞在生理环境下成熟与功能的必要手段。大多数移植方法依赖于肾包膜下或皮下等移植位点，这些位点可能存在技术或生理上的局限性。本文介绍了一种将人多能干细胞（hPSC）来源的胰腺类胰岛细胞团移植至免疫缺陷小鼠骨骼肌内的详细实验方案。该移植位点具有手术操作简便、侵入性低以及移植物易于回收以进行后续分析等优势。本方法可实现干细胞来源胰岛细胞团的骨骼肌内植入，并支持其在口服葡萄糖刺激后胰岛素分泌功能的下游检测。本方案包括细胞团的制备与压缩、移植手术操作、 体内 葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）及用于组织学分析的移植物取出，为临床前小鼠模型中的肌内移植提供了可重复的实验框架。
引言
糖尿病是一种异质性代谢紊乱疾病，其患病率在过去三十年中翻了一番，预计到2050年将影响13亿人1。尽管饮食和生活方式等环境因素在2型糖尿病（T2D）的发病中起着重要作用，但遗传易感性也在其发病机制中具有显著贡献2。胰腺β细胞负责胰岛素的合成与分泌，在糖尿病的病理生理过程中发挥核心作用3。为了理解遗传风险如何导致β细胞功能障碍，由人干细胞分化而来的、以三维内分泌细胞簇形式组织的β细胞（下文简称SC-胰岛）提供了一个信息丰富且高度相关的模型系统4,5。近期的实验方案通过使用特定抑制剂和生长因子模拟胰腺发育的关键阶段，能够高效引导人干细胞分化为可产生胰岛素的β细胞6,7。
这些系统能够以可扩展且可重复的方式可靠地模拟发育过程中的关键阶段，克服了供体来源胰岛的局限性，后者无法支持发育建模，且受限于供应不足的问题。小鼠模型虽然为胰腺发育研究提供了重要见解，但往往难以完全重现人类患者中观察到的表型特征5。因此，基于干细胞的系统可用于表征参与人类胰腺发育及β细胞功能障碍....
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方案
所有涉及多能干细胞（hPSCs）和实验动物的实验均获得机构、地区和国家伦理委员会的批准。本研究所使用的所有hPSC细胞系均在来源机构根据适当的伦理审批和知情同意程序建立并分发。图1展示了整体实验流程，从hPSC的培养，到定向诱导胰腺谱系分化，最终成熟为适合移植的干细胞来源胰岛（SC-islets）。
1. 将人多能干细胞分化为胰腺前体细胞
注意：本方案基于两个关键的前期步骤：1）人多能干细胞（hPSCs）的培养与扩增；2）将其定向分化为内分泌胰腺谱系。这两个步骤已有详细描述7,17。hPSCs 应按照 Lyria-Leyte 等人17的建议，在包被的培养板中使用 B8 培养基进行维持。在细胞进入汇合前的指数生长期收获 hPSCs 用于后续分化。在推荐的接种密度下，细胞应在次日达到 90–100% 汇合度，即可开始分化。向内分泌胰腺谱系的分化操作应依照 Barsby 等人7所述方法进行。所有培养基的完整配方详见表 1。
- 用基底膜来源的细胞外基质新鲜包被分化培养板。
- 接种 0.1....
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结果
结果显示的是将第7阶段的SC-胰岛移植到免疫缺陷小鼠肌肉内，并在移植后6周进行分析的结果。本研究仅分析了少量携带代表性移植物的动物，以证明该操作的可行性。在本研究中，成功的标准定义为能够肉眼回收肌肉内移植物，并通过组织学确认移植的SC-胰岛存活且具有内分泌细胞特征。图1展示了整体分化流程，从人多能干细胞（hPSC）的维持，到定向分化为胰腺谱系，最终成熟为适合移植的SC-胰岛。
为了生成尺寸可控的三维细胞聚集体，将第4阶段胰腺前体细胞的单细胞悬液接种到微孔板中（图2A）。在24–48小时内，形成了致密的球形细胞簇（图2B）。通过荧光显微镜观察报告基因标记的人多能干细胞系（如H1 PDX1C-termEGFP/WT 和 MEL1 I.......
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讨论
在本方案中，我们描述了将SC-胰岛进行肌内移植作为一种操作简便、可重复且微创的方法 体内 成熟，具备功能评估的潜力。尽管肾包膜下移植被广泛认为是 "金标准" 对于啮齿类动物的胰岛或干细胞衍生胰岛（SC-islet）移植，该操作需要更高的技术熟练度和更长的手术时间。相比之下，肌内移植位点具有操作简便和实施快速的优势，符合3R原则中的优化理念，可减少手术复杂性和围手术期应激。这些特点使其在需要评估SC-islet基因修饰效果的研究实验室中尤为适用，尤其适用于将操作便捷性作为优先考虑的研究场景。
利用骨骼肌作为内分泌组织移植部位的概念在临床内分泌学中早有先例，最显著的例子是甲状旁腺自体移植，该技术至今仍常规使用9。这表明肌肉组织具备维持长期内分泌功能的能力。然而，肌肉组织血管化程度相对较低，且血管生成潜力较弱，可能导致功能性的移植需要更长时间才能建立，或需要更高的细胞移植数量20。尽管存在这些局限性，肌内胰岛移植已在糖尿病啮齿类动物模型中多次成.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢美国纽约纪念斯隆-凯特琳癌症中心的黄丹玮博士（Dr. Danwei Huangfu）慷慨提供本研究中使用的人多能干细胞系。本工作获得了西班牙科学、创新与大学部（MICIU/AEI/10.13039/501100011033）以及下一代欧盟/PRTR（Next GenerationEU/PRTR）资助的项目 PID2021-122284NA-I00 和 CNS2023-145179（A.B.），以及由网络生物医学研究联盟（CIBER）项目 CB07/08/0029 和 PID2023-150719OB-I00（M.V.）和卡洛斯三世健康研究所（Instituto de Salud Carlos III, ISCIII）的资助。糖尿病及相关代谢疾病生物医学研究网络中心（CIBERDEM）是 ISCIII 的一项倡议，并获得了欧洲区域发展基金（FEDER）的部分支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐 | Sigma Aldrich | 49752 | |
| 激活素A（Activin A） | Qkine | Qk001 | |
| AggreWell 400 24孔板（微孔板） | Stemcell | 34415 | |
| 贝塔细胞素（Betacellulin） | GenScript | Z03102 | |
| 牛血清白蛋白，第五组分，无脂肪酸 | Goldbio | A-421 | |
| CHIR 99021 | LC labs | C-6556 | |
| Chroman-1 | Medchem Express | HY-15392 | CEPT鸡尾酒 |
| CMRL-1066 | Pan Biotech | P04-84600 | |
| D-(+)-葡萄糖 | Sigma Aldrich | G7021 | |
| 二苯并氮杂䓬（DBZ） | Syncom | 定制产品 | γ-分泌酶抑制剂 |
| DMEM/F12培养基（Dulbecco改良Eagle培养基与Ham’s F12混合） | Corning | 15383541 | |
| EGF | Qkine | Qk011 | |
| 艾米卡桑 | Medchem Express | HY-10396 | CEPT鸡尾酒 |
| 乙醇胺 | Sigma Aldrich | E9508 | |
| FGF2-G3 | GenScript | 定制产品 | |
| FGF7 | GenScript | Z03047 | |
| 肝素 | Sigma Aldrich | H3149 | |
| 胰岛素 | Gibco | 30284510 | |
| L-丙氨酰-L-谷氨酰胺 | Linus | X0551-100 | |
| L-抗坏血酸 | Santa Cruz | sc-202686 | |
| LDN-193189 | Sigma Aldrich | SML0559 | |
| 脂质浓缩液 | Gibco | 11548846 | |
| Matrigel（基底膜来源的细胞外基质） | Falcon | 354230 | |
| MCDB 131 | Corning | 15-100-CV | |
| N-乙酰半胱氨酸 | Thermo Scientific | 10521221 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | 10553325 | |
| 烟酰胺 | Sigma Aldrich | N0636 | |
| NRG-1 | Qkine | Qk045 | |
| Pluronic F-127（抗黏附溶液） | Sigma Aldrich | 82184 | 使用浓度为5%（w/v） |
| 多胺补充剂（1000×） | Sigma Aldrich | P8483 | CEPT鸡尾酒 |
| RepSox | MedChemExpress | HY-13012 | Alk5抑制剂 |
| 维甲酸 | Sigma Aldrich | R2625 | |
| SANT-1 | Selleckchem | S7092 | |
| 索贝替罗（GC1） | Sigma Aldrich | SML1900-5MG | 细胞通透性T3类似物 |
| 丙酮酸钠 | Corning | 25-000-CI | |
| 亚硒酸钠 | Sigma Aldrich | S5261 | |
| T3（3,3′,5-三碘-L-甲状腺原氨酸钠盐） | Sigma Aldrich | T6397 | |
| TGF-β1 | Qkine | Qk010 | |
| TPB | Tocris | 5343 | |
| 微量元素A | Corning | 15333641 | |
| 微量元素B | Corning | 15343641 | |
| Trans-ISRIB | Medchem Express | HY-12495 | CEPT鸡尾酒 |
| 转铁蛋白 | InVitria | 777TRF029 | |
| 曲拉通X-100（非离子型表面活性剂） | Thermo Scientific | 11488696 | |
| TrypLE | Gibco | 11538856 | |
| Y-27632 | LC Laboratories | Y-5301 | ROCK抑制剂 |
| ZM-447439 | MedChemExpress | HY-10128 | |
| ZnSO4 | Sigma Aldrich | Z0251 | |
| 抗体 | |||
| 大鼠抗人C肽（胰岛素） | DSHB | GN-ID4-s | 使用浓度为150 ng/mL |
| 小鼠抗胰高血糖素抗体 | Proteintech | 67286-1-Ig | 1:2000 |
| 兔抗生长抑素抗体 | Millipore | AB5494 | 1:500 |
| 山羊抗大鼠AF488 | Invitrogen | A-11006 | 1:500 |
| 驴抗小鼠AF488 | Invitrogen | A-21202 | 1:500 |
| 驴抗兔AF488 | Invitrogen | A-21206 | 1:500 |
参考文献
- Ong, K. L., et al. regional, and national burden of diabetes from 1990 to 2021, with projections of prevalence to 2050: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2021. The Lancet. 402 (10397), 203-234 (2021).
- Ismail, L., Materwala, H., Al Kaabi, J.
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重印与许可
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