HER2阳性乳腺癌引流淋巴结与转移性淋巴结的RNA测序分析鉴定出POSTN作为预后标志物

摘要

我们揭示了HER2阳性乳腺癌淋巴结转移过程中以细胞外基质和PI3K-AKT通路为核心的作用机制，并鉴定POSTN作为预后不良的标志物，可支持风险分层及基于通路的靶向治疗策略。

摘要

HER2阳性乳腺癌在临床上具有侵袭性，常扩散至区域淋巴结，但与淋巴结转移相关的转录组程序尚未完全明确。本研究通过RNA测序（RNA-seq）对6例HER2阳性乳腺癌患者的配对肿瘤引流淋巴结（TDLN）和转移性肿瘤累及淋巴结（TMLN）进行了分析。采用DESeq2进行差异表达分析，并应用Benjamini-Hochberg校正（FDR < 0.05）及绝对log2倍数变化阈值（|log2FC| ≥ 1）。共鉴定出237个差异表达基因（TMLN相对于TDLN中182个上调，55个下调）。功能富集分析显示，细胞外基质（ECM）-受体相互作用、PI3K-AKT信号通路、黏着斑及胆固醇代谢是与转移性淋巴结显著相关的通路，提示在淋巴结转移过程中存在协调的ECM重塑和信号通路激活。在上调最显著的基因中，POSTN被识别为关键候选基因，并进一步与不良的临床病理特征相关。在一项独立验证队列（n = 120）中，较高的POSTN表达水平与较差的无病生存率相关。综上所述，本研究结果提示POSTN可能作为潜在的预后生物标志物，并支持以ECM为核心及PI3K-AKT相关的机制作为HER2阳性乳腺癌淋巴结转移中可干预的生物学特征。

引言

乳腺癌（BC）是女性中最常见的癌症，也是全球癌症死亡的主要原因之一，在中国其发病率和疾病负担持续上升¹。约15%–20%的乳腺癌为HER2阳性（HER2+），其特征是ERBB2基因扩增/过表达，具有侵袭性强、复发和死亡风险更高的表型^2,3。尽管抗HER2全身治疗已显著改善患者预后，但仍有相当比例的患者出现复发或转移，凸显了基于生物学特征进行风险分层以及开发新型治疗策略的迫切需求⁴。

淋巴结转移（LNM）是乳腺癌分期、辅助治疗选择和预后判断的关键因素；腋窝受累提示生存率较差，并促进肿瘤进一步扩散至远处器官^5,6。然而，目前仍缺乏能够有效反映HER2+ 疾病淋巴结转移生物学特征的可靠生物标志物，现有的临床病理学因素仅能部分解释患者预后的异质性⁷。

RNA-seq 技术的进步使得能够在转录组范围内实现高动态范围的表达谱分析，目前该技术已在转化肿瘤学研究中得到广泛应用^....

方案

本研究经机构伦理委员会批准，并遵循《赫尔辛基宣言》及有关人类生物样本使用的当地法规进行。本研究已获得中山博爱医院伦理委员会的批准（批准号：KY-2020-012-124）。在开展任何与研究相关的操作前，均已从所有参与者处获得书面知情同意。

研究队列与样本
发现队列包括来自6例HER2阳性乳腺癌患者的术中配对肿瘤引流淋巴结（TDLN）和转移性淋巴结（TMLN）组织。对于每位患者，匹配的TDLN定义为无组织学转移证据的引流淋巴结，作为患者内部的对照比较组；而TMLN则经病理学确认为转移性组织。新鲜组织用冷磷酸盐缓冲液（PBS）短暂冲洗后吸干，在切除后30分钟内迅速投入液氮中速冻，并储存于-80 °C直至提取。纳入标准为经病理确诊的浸润性乳腺癌、依据ASCO/CAP标准判定为HER2阳性、具有配对淋巴结样本，且未接受新辅助治疗。排除标准为组织量不足或RNA完整性数值（RIN）< 7.0。一例初筛样本因RIN < 7.0未通过质控而被排除，因此所有发现阶段的分析均一致采用n = 6。独立验证队列包含120例存档的FFPE淋巴结标本，具有临床随访数据，用于qRT-PCR检测和结局分析。在预后模型构建中，根据POSTN表达水平将患者分为高表达组与低表达组（分界点由X-tile软件确定），其中低表达组作为参照对照组。随访信息缺失或协变量不完整的病例被排除在预后模型分析之外。

结果

队列和临床病理学特征
发现队列包括6对配对的TDLN/TMLN样本，验证队列包含120例具有长期随访记录的存档淋巴结标本。两个队列的基线临床病理学特征，包括年龄、肿瘤大小、分级、受体状态和淋巴结状态，总结于表1中。

测序质量与全局数据结构
所有12个发现阶段文库每个样本平均获得约3000万对读段，Q30 ≥ 90%，比对率> 85%。基于方差稳定化计数的主成分分析未发现离群样本，并显示出按淋巴结状态预期的分组趋势，其中TDLN和TMLN形成明显不同的聚类。全基因组差异表达的概览见图1A-B，测序运行和样本水平的质量指标（包括测序深度、重复率和比对率）均达到预设阈值，详见表2。插入片段大小分布呈单峰，经修剪后残留的核糖体序列含量和接头污染均极低。

配对节点中的差异表.......

讨论

HER2阳性乳腺癌的特点是侵袭性增强、淋巴结转移（LNM）频繁，尽管接受了现代全身治疗，预后仍较差¹⁵。传统的临床病理学因素仅能部分解释该亚型的预后差异，因此亟需基于生物学机制的标志物来准确评估淋巴结播散的风险¹⁶。通过对比肿瘤引流淋巴结（TDLN）与肿瘤转移淋巴结（TMLN）的RNA测序（RNA-seq）分析，我们鉴定出237个差异表达基因（DEGs），这些基因主要富集于细胞外基质（ECM）重塑、免疫应答与抗原呈递程序以及脂质代谢通路，提示这些通路在转移能力及淋巴结微环境适应中发挥重要作用¹⁷。

基因本体（Gene Ontology）分类突出显示了干扰素介导的信号传导、抗原加工与呈递、囊泡运输以及主要组织相容性复合体（MHC）复合物组分，这与肿瘤细胞在定植过程中形成的免疫调节性肿瘤-淋巴结界面特征一致¹⁸。本文中所指的免疫应答通路特指经过人工整理的模块，涵盖I型/II型干扰.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
生物分析仪	2100-BA	Agilent, USA	用于评估RNA完整性及质量控制的设备。
DESeq2	N/A	R Bioconductor	用于RNA-seq数据分析的差异表达分析软件。
FastQC 软件	N/A	Babraham Bioinformatics	用于评估RNA-seq数据序列质量的质量控制软件。
HEK293 细胞系	ATCC-CRL-1573	ATCC, USA	用于转染实验的人胚肾细胞系。
qRT-PCR 试剂盒	4385616	ThermoFisher, USA	用于验证基因表达的定量PCR试剂盒。
RNA提取试剂盒	74204	Qiagen, Germany	用于从组织样本中分离高质量RNA的RNA提取试剂盒。
RNA测序试剂盒	RS-122-2001	Illumina, USA	用于RNA样本测序的RNA文库构建试剂盒。
测序平台	NovaSeq 6000	Illumina, USA	用于RNA文库高通量测序的RNA测序平台。
组织冷冻设备	TFE-300	Thermo Fisher, USA	用于在液氮中冷冻组织样本的设备。
鼓膜温度计	55678-TT	ThermoScience, Japan	用于测量体温的精确温度计。