HER2阳性乳腺癌引流淋巴结与转移性淋巴结的RNA测序分析鉴定出POSTN作为预后标志物

摘要

我们揭示了HER2阳性乳腺癌淋巴结转移过程中以细胞外基质和PI3K-AKT通路为核心的作用机制，并鉴定POSTN作为预后不良的标志物，可支持风险分层及基于通路的靶向治疗策略。

摘要

HER2阳性乳腺癌在临床上具有侵袭性，常扩散至区域淋巴结，但与淋巴结转移相关的转录组程序尚未完全明确。本研究通过RNA测序（RNA-seq）对6例HER2阳性乳腺癌患者的配对肿瘤引流淋巴结（TDLN）和转移性肿瘤累及淋巴结（TMLN）进行了分析。采用DESeq2进行差异表达分析，并应用Benjamini-Hochberg校正（FDR < 0.05）及绝对log2倍数变化阈值（|log2FC| ≥ 1）。共鉴定出237个差异表达基因（TMLN相对于TDLN中182个上调，55个下调）。功能富集分析显示，细胞外基质（ECM）-受体相互作用、PI3K-AKT信号通路、黏着斑及胆固醇代谢是与转移性淋巴结显著相关的通路，提示在淋巴结转移过程中存在协调的ECM重塑和信号通路激活。在上调最显著的基因中，POSTN被识别为关键候选基因，并进一步与不良的临床病理特征相关。在一项独立验证队列（n = 120）中，较高的POSTN表达水平与较差的无病生存率相关。综上所述，本研究结果提示POSTN可能作为潜在的预后生物标志物，并支持以ECM为核心及PI3K-AKT相关的机制作为HER2阳性乳腺癌淋巴结转移中可干预的生物学特征。

引言

乳腺癌（BC）是女性中最常见的癌症，也是全球癌症死亡的主要原因之一，在中国其发病率和疾病负担持续上升¹。约15%–20%的乳腺癌为HER2阳性（HER2+），其特征是ERBB2基因扩增/过表达，具有侵袭性强、复发和死亡风险更高的表型^2,3。尽管抗HER2全身治疗已显著改善患者预后，但仍有相当比例的患者出现复发或转移，凸显了基于生物学特征进行风险分层以及开发新型治疗策略的迫切需求⁴。

淋巴结转移（LNM）是乳腺癌分期、辅助治疗选择和预后判断的关键因素；腋窝受累提示生存率较差，并促进肿瘤进一步扩散至远处器官^5,6。然而，目前仍缺乏能够有效反映HER2+ 疾病淋巴结转移生物学特征的可靠生物标志物，现有的临床病理学因素仅能部分解释患者预后的异质性⁷。

RNA-seq 技术的进步使得能够在转录组范围内实现高动态范围的表达谱分析，目前该技术已在转化肿瘤学研究中得到广泛应用⁸。然而，大多数针对HER2+ 乳腺癌的表达研究主要集中于原发性肿瘤或非配对队列，而对配对的肿瘤引流淋巴结（TDLN）与肿瘤转移性淋巴结（TMLN）进行比较分析的研究仍较为匮乏，这限制了人们对淋巴结定植及进展过程中潜在分子机制的理解⁹。

基于淋巴结转移的临床重要性，以及既往证据表明细胞外基质（ECM）重塑和PI3K-AKT通路激活在转移定植中的作用¹⁰，我们提出假设：在同一患者中，肿瘤转移性淋巴结（TMLN）相较于配对的肿瘤引流淋巴结（TDLN）将表现出独特的转录组程序，且一组持续上调的ECM相关基因将与不良的临床病理特征及复发风险相关。为验证该假设，我们对6名HER2阳性患者的配对TDLN和TMLN进行了分析，以鉴定与淋巴结播散相关的差异表达基因（DEGs）及通路。随后，我们重点评估了POSTN在独立队列中的预后价值，将ECM重塑与PI3K-AKT信号通路关联至HER2+乳腺癌的临床实用风险分层。HER2检测（依据现行ASCO-CAP标准）、测序质量控制、使用DESeq2进行差异表达基因分析及Benjamini-Hochberg法FDR校正，以及验证流程的详细信息见文献^11,12。

方案

本研究经机构伦理委员会批准，并遵循《赫尔辛基宣言》及有关人类生物样本使用的当地法规进行。本研究已获得中山博爱医院伦理委员会的批准（批准号：KY-2020-012-124）。在开展任何与研究相关的操作前，均已从所有参与者处获得书面知情同意。

研究队列与样本
发现队列包括来自6例HER2阳性乳腺癌患者的术中配对肿瘤引流淋巴结（TDLN）和转移性淋巴结（TMLN）组织。对于每位患者，匹配的TDLN定义为无组织学转移证据的引流淋巴结，作为患者内部的对照比较组；而TMLN则经病理学确认为转移性组织。新鲜组织用冷磷酸盐缓冲液（PBS）短暂冲洗后吸干，在切除后30分钟内迅速投入液氮中速冻，并储存于-80 °C直至提取。纳入标准为经病理确诊的浸润性乳腺癌、依据ASCO/CAP标准判定为HER2阳性、具有配对淋巴结样本，且未接受新辅助治疗。排除标准为组织量不足或RNA完整性数值（RIN）< 7.0。一例初筛样本因RIN < 7.0未通过质控而被排除，因此所有发现阶段的分析均一致采用n = 6。独立验证队列包含120例存档的FFPE淋巴结标本，具有临床随访数据，用于qRT-PCR检测和结局分析。在预后模型构建中，根据POSTN表达水平将患者分为高表达组与低表达组（分界点由X-tile软件确定），其中低表达组作为参照对照组。随访信息缺失或协变量不完整的病例被排除在预后模型分析之外。

样本量依据（发现阶段与验证阶段）
发现阶段采用配对的TDLN-TMLN设计，以最大化患者内部对比度并减少个体间变异，同时将多重性控制在FDR = 0.05水平。在验证队列（n = 120）中，POSTN 表达水平根据X-tile确定的截断值进行二分类（高/低 = 40/80）。假设有48个无病生存（DFS）事件且α = 0.05，Schoenfeld近似法表明，在等比例分配条件下，检测到约HR ≥ 2.3的临床相关风险比的统计效能≥ 80%；该预测与观察到的效应量一致（HR = 2.31，95% CI 1.41–3.77）。

HER2阳性定义
HER2 阳性遵循现行标准 ASCO/CAP 标准¹³：免疫组织化学（IHC）3+ 定义为均匀的强膜染色 >10% 的肿瘤细胞，或 原位 原位杂交（ISH）扩增定义为一种 HER2/CEP17 比值≥2.0且每个细胞平均HER2拷贝数≥4.0信号。IHC 2+结果需进行 reflex ISH 检测，并对≥20个侵袭性肿瘤细胞进行盲法重计数以确认扩增状态。

组织处理与RNA提取
所有操作均在冰上进行（除非另有说明），并使用无RNase的耗材。对于每份质量≤100 mg的组织样本，先在1 mL酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿试剂（AGPC）中进行匀浆，随后加入200 µL氯仿，剧烈振荡15秒，并在室温下孵育2–3分钟。通过在4 °C下以12,000 × g离心15分钟实现相分离。将水相转移至新管中，在室温下孵育10分钟后，加入500 µL异丙醇沉淀RNA。在4 °C下以12,000 × g离心10分钟完成沉淀。沉淀用1 mL 75%乙醇洗涤，在4 °C下以7,500 × g离心5分钟，室温晾干5–10分钟，最后溶解于无RNase的水中。当怀疑存在基因组DNA残留时，采用柱上DNase I消化处理。可视化质控点包括：氯仿抽提后清晰的相分离，以及异丙醇沉淀后完整且半透明的RNA沉淀。若A260/230比值偏低，应重复乙醇洗涤；若产量偏低，则应延长沉淀时间或确保离心时充分冷却。

RNA 质量控制
采用分光光度法测定 A260/280 和 A260/230，目标值范围为 1.8–2.1，并结合荧光定量法以提高准确性。完整性通过微流控电泳系统进行评估，要求 RIN ≥ 7.0。以清晰的 18S/28S rRNA 条带峰及无基因组 DNA 拖尾现象作为可接受标准；未达阈值的样本将重新提取或予以剔除。

文库构建
对于完整的RNA样本，采用poly(A)筛选构建链特异性mRNA文库；而对于部分降解的样本，则采用rRNA去除法。每个文库的典型起始RNA量为≥ 1 µg总RNA。片段化在约94 °C下进行8分钟；第一链cDNA合成在50 °C下进行50分钟；第二链合成在16 °C下进行60分钟；接头连接在20 °C下进行15分钟；PCR扩增采用10–12个循环，并根据需要调整以避免过度扩增。纯化步骤使用约0.8x–1.0x的磁珠比例，预期文库大小分布为300 bp（包含接头）。文库质量通过微流控电泳验证；若存在接头二聚体污染，则进行更严格的纯化；若片段大小分布过宽，则适当缩短片段化时间予以校正。

测序
文库采用双端150 bp（PE150）模式进行测序，每个文库目标为获得3000万对读段。测序运行层面的质量要求为Q30 ≥ 90%，且簇密度稳定，无明显通道偏差。为减少批次效应，文库在不同通道间随机分布，测序运行记录需注明各通道分配情况以及所使用的任何哨点对照，以监测交叉污染。

计算分析与差异表达
分析在 Linux 系统上使用 R（v4.3.2）进行。使用 FastQC（v0.11.9）评估原始测序读段的质量。使用 fastp（v0.23.4）进行接头序列去除和质量剪切，参数包括自动检测接头序列、滑动窗口剪切（窗口大小为 4 bp；平均 Phred 质量值 Q ≥ 20）、最小读段长度为 50 bp，并在检测到相关化学类型时进行 poly-G 剪切。使用 HISAT2（v2.2.1）将测序读段比对至 GRCh37/hg19 参考基因组，采用与文库匹配的链特异性参数以及已知的剪接位点索引。基于 GENCODE v19 注释，使用 featureCounts（Subread v2.0.3）生成基因水平的计数，采用成对末端计数模式、嵌合读段处理、多映射读段感知设置以及正确的链特异性标志。通过要求至少在三个样本中计数 ≥ 10 来过滤低计数基因。采用 DESeq2（v1.40.2）在配对设计下（design = ~ pair + condition）进行差异表达（DE）分析，以比较 TMLN 与 TDLN，使用默认的大小因子标准化方法，并通过 apeglm 方法对 log2 倍数变化进行压缩。使用库克距离评估潜在的离群值。通过 Benjamini-Hochberg 方法控制全转录组范围的多重检验错误率（错误发现率，FDR）。显著性定义为 FDR < 0.05 且绝对 log2 倍数变化阈值（|log2FC|）≥ 1。DESeq2 的负二项分布框架可为计数数据提供适当的均值-方差建模，并在小到中等规模队列中稳定倍数变化估计。作为敏感性分析，我们使用 edgeR 和 limma-voom 方法，在相同的过滤条件和 FDR 阈值下重新执行差异表达检验，结果得到一致的高排名信号，支持主分析策略的稳健性。

功能富集分析（GO 和 KEGG）
使用 R 中的 clusterProfiler（v4.8.3）进行功能注释。上调和下调的差异表达基因（DEGs）分别进行分析。在富集分析前，基因标识符已映射至 Entrez 基因 ID（物种：Homo sapiens）。基因本体（GO）富集分析使用 enrichGO 进行（OrgDb：org.Hs.eg.db；ont = BP/CC/MF；pAdjustMethod = "BH"；pvalueCutoff = 0.05；qvalueCutoff = 0.05），KEGG 通路富集分析使用 enrichKEGG 进行（organism = "hsa"；pAdjustMethod = "BH"；pvalueCutoff = 0.05；qvalueCutoff = 0.05）。背景基因集定义为差异表达分析中经低计数过滤后保留的所有表达基因。此外，对富集结果进一步筛选，仅保留包含 10 至 500 个注释基因的基因集（minGSSize = 10；maxGSSize = 500）。可视化分析使用 ggplot2（v3.5.1）和 ComplexHeatmap（v2.16.1）生成，包括基因比例和 -log10（校正 P 值）的点图；术语 "immune-response pathways" 指涵盖抗原加工与提呈、干扰素信号通路及淋巴细胞活化的 curated GO 模块。

外部数据库查询
通过查询外部资源对候选基因进行分析，以提供正交的背景信息。使用 GEPIA2（v2.0）查询肿瘤与正常组织间 mRNA 的表达差异，将 TCGA 乳腺浸润性癌（TCGA-BRCA）肿瘤样本与正常乳腺组织（GTEx/TCGA 正常样本，如可获得）进行比较。采用 GEPIA2 提供的表达值（log2[TPM+1]）及其默认的组间统计检验方法，为每个查询基因生成箱线图和 P 值。通过查阅人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas, HPA）中组织图谱和病理图谱提供的乳腺组织/癌症免疫组化图像及注释，评估蛋白水平的定位情况，并在数据可获得时记录报告的染色强度及细胞定位（例如，间质 vs 上皮）。

qRT-PCR 验证
独立的淋巴结组织按上述方法处理以提取总RNA，并从1 µg RNA在20 µL逆转录反应体系中合成cDNA。采用基于SYBR的化学法进行定量实时PCR（qRT-PCR），每项反应包含1×预混液和0.2–0.4 µM的每种引物。通过单一熔解曲线峰确认引物特异性，并利用系列稀释标准曲线评估扩增效率，扩增效率在90%–110%范围内视为可接受。每个样本均设技术重复三次，重复间的循环阈值（Ct）标准差需≤0.3。基因表达以GAPDH（或在适用情况下其他经验证的参考基因）为内参进行标准化，并采用2^-ΔΔCt法计算相对表达量。数据正态性通过Shapiro-Wilk检验评估；组间比较对于近似正态分布的数据采用双侧t检验，否则采用Mann-Whitney U检验。

在验证队列中的预后分析
无病生存期（DFS）为主要终点，从手术日期计算至首次记录的复发事件或末次随访日期（删失）。在主要分析中，POSTN 表达水平根据 X-tile 确定的截断值分为两组（高表达 vs 低表达 = 40/80）；敏感性分析采用其他截断值，如三分位数。采用 Kaplan-Meier 曲线和 log-rank 检验进行单变量比较。通过多变量 Cox 比例风险模型估计风险比（HR）及其 95% 置信区间，并根据预先设定的因素对年龄、肿瘤大小、淋巴结状态、组织学分级和受体状态进行校正。使用 Schoenfeld 残差评估比例风险假设，使用方差膨胀因子检查共线性，使用 dfbetas 评估有影响力观测值。在排除随访缺失或协变量不完整的病例后，进行完整病例分析，具体如上所述。

一般统计与报告
除非另有说明，数据均以均值 ± 标准差或中位数（四分位距）表示，采用双侧检验，且 p < 0.05 被认为具有统计学显著性。对于全转录组分析和富集分析，采用 BH-FDR 方法控制多重性，效应量在可行时均附有 95% 置信区间。

安全与废物处理
苯酚-胍盐试剂和有机溶剂均在经认证的通风橱中操作，并穿戴实验服、腈类手套及防溅保护装备。有机废物和含卤废物分别收集至贴有标签的容器中，并按照机构规定进行处置。生物废物在丢弃前经过高压灭菌或化学消毒，表面和工具使用RNase失活溶液去污染。试剂特有的危害性（如腐蚀性和毒性）已在实验室标准操作程序（SOP）中记录，并在所有操作过程中严格遵守。

结果

队列和临床病理学特征
发现队列包括6对配对的TDLN/TMLN样本，验证队列包含120例具有长期随访记录的存档淋巴结标本。两个队列的基线临床病理学特征，包括年龄、肿瘤大小、分级、受体状态和淋巴结状态，总结于表1中。

测序质量与全局数据结构
所有12个发现阶段文库每个样本平均获得约3000万对读段，Q30 ≥ 90%，比对率> 85%。基于方差稳定化计数的主成分分析未发现离群样本，并显示出按淋巴结状态预期的分组趋势，其中TDLN和TMLN形成明显不同的聚类。全基因组差异表达的概览见图1A-B，测序运行和样本水平的质量指标（包括测序深度、重复率和比对率）均达到预设阈值，详见表2。插入片段大小分布呈单峰，经修剪后残留的核糖体序列含量和接头污染均极低。

配对节点中的差异表...

讨论

HER2阳性乳腺癌的特点是侵袭性增强、淋巴结转移（LNM）频繁，尽管接受了现代全身治疗，预后仍较差¹⁵。传统的临床病理学因素仅能部分解释该亚型的预后差异，因此亟需基于生物学机制的标志物来准确评估淋巴结播散的风险¹⁶。通过对比肿瘤引流淋巴结（TDLN）与肿瘤转移淋巴结（TMLN）的RNA测序（RNA-seq）分析，我们鉴定出237个差异表达基因（DEGs），这些基因主要富集于细胞外基质（ECM）重塑、免疫应答与抗原呈递程序以及脂质代谢通路，提示这些通路在转移能力及淋巴结微环境适应中发挥重要作用¹⁷。

基因本体（Gene Ontology）分类突出显示了干扰素介导的信号传导、抗原加工与呈递、囊泡运输以及主要组织相容性复合体（MHC）复合物组分，这与肿瘤细胞在定植过程中形成的免疫调节性肿瘤-淋巴结界面特征一致¹⁸。本文中所指的免疫应答通路特指经过人工整理的模块，涵盖I型/II型干扰...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
生物分析仪	2100-BA	Agilent, USA	用于评估RNA完整性及质量控制的设备。
DESeq2	N/A	R Bioconductor	用于RNA-seq数据分析的差异表达分析软件。
FastQC 软件	N/A	Babraham Bioinformatics	用于评估RNA-seq数据序列质量的质量控制软件。
HEK293 细胞系	ATCC-CRL-1573	ATCC, USA	用于转染实验的人胚肾细胞系。
qRT-PCR 试剂盒	4385616	ThermoFisher, USA	用于验证基因表达的定量PCR试剂盒。
RNA提取试剂盒	74204	Qiagen, Germany	用于从组织样本中分离高质量RNA的RNA提取试剂盒。
RNA测序试剂盒	RS-122-2001	Illumina, USA	用于RNA样本测序的RNA文库构建试剂盒。
测序平台	NovaSeq 6000	Illumina, USA	用于RNA文库高通量测序的RNA测序平台。
组织冷冻设备	TFE-300	Thermo Fisher, USA	用于在液氮中冷冻组织样本的设备。
鼓膜温度计	55678-TT	ThermoScience, Japan	用于测量体温的精确温度计。