大鼠经腔内大脑中动脉闭塞模型的标准化：带有质量控制措施的详细方案

摘要

本方案展示了一种经过优化的大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）技术，操作时间约为60分钟。通过多模态方法验证，该方案的成功率达到87.5%，死亡率极低，并可产生可重复的梗死和行为学结果，适用于脑卒中研究。

摘要

大鼠大脑中动脉阻塞（MCAO）模型仍是阐明缺血性脑卒中病理生理机制和验证神经保护疗法的参考标准。然而，细微的手术偏差可能显著改变梗死体积和行为学结果。采用一种 "先观察，后系统化" 在该框架下，我们重新审视了模型建立与验证的每一步骤。对关键手术解剖标志和重要操作步骤进行了详细的摄影记录，以标准化解剖定位和线栓放置。采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色法精确绘制再灌注后24小时和72小时脑梗死体积及拓扑结构。神经功能缺损程度采用Zea-Longa、Bederson和改良Garcia评分量表进行评估。24只雄性Sprague-Dawley大鼠接受60分钟短暂性大脑中动脉阻塞（MCAO），并在术后24小时和72小时评估梗死体积和神经功能评分。约87.50%的动物成功实现脑血流阻断（Zea-Longa评分≥1且TTC染色明确显示梗死灶），总体死亡率为12.50%，表明该模型具有高度可靠性。该标准化方案为临床前卒中研究提供了技术优化、可重复的基础，有助于在探究卒中病理生理机制及治疗干预的研究中实现实验室间的可比性。

引言

脑卒中是全球第二大死亡原因和第三大残疾原因^1,2。脑卒中对中低收入国家的影响尤为严重，其发病年龄平均比高收入国家早15年¹。脑卒中主要有两种类型：缺血性脑卒中（占85%）和脑内出血（占15%）³。缺血性脑卒中占所有脑卒中的绝大多数，由脑血流阻塞引起，导致细胞死亡和脑梗死⁴。缺血级联反应涉及多种生化事件，包括显著的促氧化过程^5,6。

尽管已开展了大量临床前和临床研究，但仅有少数疗法被证实有效，其中最显著的是静脉注射组织型纤溶酶原激活剂溶栓治疗和机械取栓术。然而，这些治疗方法受限于狭窄的治疗时间窗和严格的患者筛选标准。因此，迫切需要阐明缺血性损伤、神经血管修复以及卒中后恢复的细胞与分子机制。为此，建立一种可重复且具有临床相关性的动物模型至关重要。

大脑中动脉闭塞（MCAO）模型被广泛用于研究啮齿类动物的缺血性脑卒中^7,8。经腔内栓线闭塞法是最经典且应用最广泛的MCAO技术之一⁹。该技术可建立永久性和短暂性闭塞模型，且无需开颅。一种较新的经股动脉介入技术利用血管内导丝在大鼠中诱导短暂性MCAO，显示出更稳定的结果¹⁰。该模型通常采用经腔内栓线技术闭塞大脑中动脉¹¹。MCAO可导致局灶性脑低灌注，进而引发缺血与再灌注损伤¹²。

尽管MCAO在研究脑卒中病理生理机制及潜在治疗方法方面具有重要价值，但其可能产生体积不一的梗死病灶⁷。因此，对MCAO模型进行改进——例如优化再灌注技术、建立标准化操作流程以及制定统一的评估标准——可减少梗死部位和体积的变异性，从而提高其在缺血性脑卒中研究中的应用价值。

该方案需要经过大约10–15次手术的学习过程才能获得稳定一致的结果¹³成功率可能因操作者经验和大鼠品系而异¹⁴该模型适用于研究急性缺血性卒中，但可能无法完全模拟人类的合并症，如高血压或糖尿病。¹⁵因此，我们致力于设计并严格验证一种优化的MCAO方案，旨在通过标准化操作流程和严格的质量控制措施来降低实验变异性。为实现标准化程度与数据可靠性的双重提升，本研究整合了四项互补性创新：（1）双时间点纵向评估——在再灌注后24小时和72小时，同步获取Zea-Longa、Bederson和改良Garcia量表的神经功能评分，并结合2,3,5-三苯基四氮唑氯化物（TTC）染色测定的梗死体积，以明确水肿消退与功能恢复之间的时间关系；（2）三量表交叉验证——采用双研究者盲法评分，并结合三量表联合校准，显著提高了行为学评估的敏感性与精确度；（3）全程低温快速切片——建立了一套标准操作程序（SOP）， "90 秒冰浴提取，随后在预冷模具中进行单步 2 毫米冠状切片" 旨在最大限度减少自溶和人为误差，确保高保真的体积测量；（4）整合式质量控制框架——建立了一套涵盖术前禁食、麻醉深度控制、术前体温调节及交叉污染预防的全面标准操作程序，以提供可重复且易于推广的MCAO标准操作流程，为实验室间的一致性和跨研究的可比性奠定坚实基础。

方案

本实验经首都医科大学实验动物伦理委员会批准并监督。所有操作均符合《美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南》（NIH出版物80-23，1996年修订版）的要求，且必须使用无菌器械并采用无菌技术。

1. 动物选择

1. 使用来自认证实验动物供应商（许可证号：SCXK（北京）2021-0011）的雄性Sprague-Dawley大鼠（6–8周龄，体重240–270 g）建立MCAO模型。
2. 常规饲养动物，自由摄食饮水；所有操作均遵循国际伦理准则。
3. 根据动物体重选择以下标准确定栓线尺寸，以确保一致的闭塞效果：
   - 220–250 g：直径0.33–0.35 mm
   - 250–280 g：直径0.35–0.38 mm
   - 280–310 g：直径0.38–0.40 mm
   注意：这些参数考虑了血管直径随年龄增长的变化，可降低蛛网膜下腔出血（SAH）或闭塞不全的发生率¹³。

2. 样本量

1. 使用样本量计算软件进行样本量估算。根据初步数据，MCAO组的预期梗死体积为35% ± 10%（均值 ± 标准差），而假手术（SHAM）组为0% ± 2%，据此估算效应量（Cohen's d）。针对双侧Mann-Whitney U检验（t检验的非参数替代方法），设定显著性水平α = 0.05，检验效能（1-β）= 0.80，计算所需的最小样本量。
   注：效应量估计为3.5，每组最小样本量为6只动物。
2. 为弥补预期死亡率（12.5%）和排除率（5–10%），MCAO组纳入24只大鼠，SHAM组纳入6只大鼠，以确保对主要终点指标（24小时梗死体积）具有足够的检验效能（>0.90）。

3. 纳入与排除标准

1. 如果动物符合以下标准，则纳入研究：（1）雄性Sprague-Dawley大鼠，体重240–270 g，6–8周龄；（2）无既往神经系统功能缺损（术前神经功能评分 = 0）；（3）麻醉诱导成功且无并发症。
2. 如果动物出现以下情况，则从分析中排除：（1）尸检时发现蛛网膜下腔出血（SAH）；（2）过早死亡（<再灌注后24 h）且与实验干预无关；（3）闭塞失败（神经功能评分 = 0 且无TTC染色定义的梗死灶）；（4）手术技术失败（如颈总动脉破裂）。
   注：这些标准在研究开始前已预先设定，以尽量减少选择偏倚。
3. 动物替换政策：仅对因手术技术失败或术中死亡而被排除的动物进行替换，以维持统计效能。对于模型构建失败（闭塞失败）的动物不予替换，但应将其计入模型成功率的计算中，以避免人为降低数据变异性。

4. 术前准备

1. 准备已灭菌的器械、无菌细丝及铺巾区域。
2. 无需常规禁食；必要时，禁食时间应限制在 2–4 小时内。使用异氟烷（3–4%）诱导麻醉，并在手术过程中以 30–40% 氧气混合维持麻醉浓度于 1.5–2%。通过翻正反射消失和脚趾夹捏反应判断麻醉深度。
3. 使用带有直肠温度监测的反馈控制加热垫，将体温维持在 37 ± 0.5 °C。
4. 剃除颈部和头皮毛发，先用聚维酮碘清洁，再用 70% 乙醇擦拭。
5. 术前 30 分钟皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg），术后每 12 小时给药一次，持续 48 小时；或每日一次皮下注射美洛昔康（1 mg/kg），连续使用 3 天¹⁶。通过观察理毛行为、姿势及自发活动情况评估疼痛程度；若持续出现不适迹象，应给予额外镇痛处理。

5. 大脑中动脉闭塞

1. 将大鼠置于仰卧位，轻轻伸展头部以暴露颈部腹侧。
2. 使用虹膜剪在颈部正中做一纵行切口（1.5–2.0 cm）。
3. 用弯头镊子钝性分离胸锁乳突肌与肩胛舌骨肌，暴露左侧颈总动脉（CCA）分叉处。
4. 用永久性4-0丝线结扎颈外动脉（ECA）远端，近端用临时结扎线结扎。在两根ECA结扎线之间使用显微剪做一个小切口。
5. 使用微血管夹（60 g压力）暂时阻断颈总动脉（CCA）和颈内动脉（ICA）。
6. 通过ECA切口插入一根4-0硅胶包被单丝线（直径0.35–0.40 mm），逆行推进至CCA，然后转向进入ICA，越过CCA分叉处。
   注意：确保尼龙线进入ICA朝向颅底方向，而非侧向分支的翼腭动脉（PPA）。若在<10 mm处遇到阻力，应撤回尼龙线，将动物头部向对侧旋转30°，再重新推进以绕过PPA起始部。
7. 将尼龙线从CCA分叉处推进18–20 mm，直至轻微阻力提示大脑中动脉（MCA）起始段已被阻塞。使用游标卡尺从ECA残端插入点测量尼龙线上预标记的参考线（位于硅胶止动器近端2 mm处），以确认插入深度。尼龙线到位后松开CCA血管夹。

6. 再灌注

1. 闭塞60分钟后，重新切开切口并松开临时的ECA结扎线。
2. 轻柔撤出尼龙线，直至其尖端完全退出ECA残端，从而恢复血流；立即在残端近端放置永久性结扎线，以防止反向出血。逐层缝合伤口。
3. 将大鼠转移至加温的恢复笼中，进行持续监测。

7. 假手术

1. 按照上述MCAO的相同步骤准备动物（禁食、麻醉、体温控制、无菌铺巾）。
2. 进行颈部切口并暴露颈总动脉分叉，操作同上。
3. 分离并暴露血管，但不插入线栓。
4. 保持动脉通畅；不诱导脑缺血。
5. 暴露10分钟后逐层缝合切口。将动物转移至加温的恢复笼中进行监测。

8. 术后神经功能评分

1. 在再灌注后24小时和72小时进行评估，于处死动物前立即进行梗死体积测量。
2. 将动物置于安静、25 °C的环境中适应30分钟。
3. 由两名独立的研究人员在不知分组情况的条件下进行评估；每位研究人员分别在独立的记录表上评分，任何评分者间差异≥1分时需重新评估。
4. 评分量表（按施测顺序）：依次进行Zea-Longa¹⁷（表1）、Bederson¹⁸（表2）和改良Garcia¹⁹（表3）评分，遵循最新发表的标准化操作流程以确保评分标准一致。
5. 统计分析采用两名观察者的平均评分。若任意动物的平均评分差异超过>10%，则剔除该动物数据，并以新的实验动物替代。

9. 脑梗死体积的测量

1. 再灌注后24小时和72小时，使用5%异氟烷深度麻醉大鼠。在继续操作前，通过翻正反射消失、足趾夹捏无反应以及呼吸稳定来确认深度麻醉状态。
2. 在确认深度麻醉后90秒内迅速取出脑组织，用冰冻的PBS冲洗，并使用预冷的大鼠脑切片模具将脑组织切成2 mm厚的冠状切片。切片过程中需遵守以下注意事项：
   1. 整个操作过程需在0–4 °C的冰上进行；脑组织取出后90秒内完成，并将其平整地放置于预冷的切片模具中。
   2. 使用锋利刀片进行单次、干净的切割，以获得精确的2 mm冠状切片，并按头-尾顺序将每一片切片收集至冰冻的PBS中。
   3. 每只动物操作后立即用75%乙醇清洗模具和刀片，以防止交叉污染。
3. 将2% TTC预热至37 °C后，完全浸没脑切片，在避光条件下孵育20分钟，每5分钟轻轻摇晃一次，共摇晃20分钟。
4. 用4 °C的PBS冲洗三次，迅速终止反应。随后在4 °C条件下用4%多聚甲醛固定过夜。
5. 在300 dpi分辨率下，对每一片切片的两面各拍摄一张照片。
   1. 使用固定光源，在白色背景下拍摄，以消除阴影和反光。
   2. 将切片平整放置，避免重叠，每张图像中均包含比例尺和编号标签。相机应垂直于切片平面，且在整个拍摄过程中保持焦距和白平衡恒定。
6. 使用ImageJ软件定量分析梗死体积。
   1. 导入300 dpi的图像（RGB格式），并将其转换为8位灰度图像（图像 > 类型 > 8位）。
   2. 应用Otsu自动阈值法（图像 > 调整 > 自动阈值 > 选择Otsu），将梗死区域（白色）与存活组织（红色）区分开。
   3. 使用自由手选区工具勾勒同侧半脑的边界。
   4. 测量面积（分析 > 测量），并记录像素数量。
   5. 计算梗死体积：Σ（梗死面积 × 切片厚度 [2 mm]） × （对侧半脑体积 / 同侧半脑体积），结果以对侧半脑体积的百分比表示。

10. 统计分析

1. 根据情况，以均值 ± 标准差（SD）或中位数 [四分位距] 的形式呈现数据。
2. 对于正态分布数据，采用非配对 Student t 检验进行组间比较；对于非正态分布数据，采用 Mann-Whitney U 检验。
3. 统计学显著性水平设定为 P < 0.05。所有分析均使用适当的统计分析软件进行。

结果

动物被随机分配至再灌注后24小时（n = 10）或72小时（n = 10）的终点 TTC 染色组。另有4只大鼠接受大脑中动脉阻塞（MCAO）手术但在预定终点前死亡（死亡率为12.5%）。假手术（SHAM）组包含n = 6只动物。因此，实验共使用30只动物（24只MCAO + 6只SHAM）。

大鼠接受60分钟大脑中动脉阻塞（MCAO）以诱导脑缺血（图1）。通过移除血管内缝线并松解颈外动脉（ECA）近端结扎线来启动再灌注。在24只MCAO大鼠中，有3只在72小时内死亡；其中1只在24小时内死亡后经TTC染色显示梗死范围广泛，另2只死于未明原因。另有2只大鼠因建模失败被排除（神经功能评分未达标准，且TTC染色未显示梗死灶）。因此，72小时死亡率为12.50%。我们将成功建模定义为存活超过24小时且Longa评分达到1–3分，成功建模率达到87.50%。

在卒中发生后24小时和72小时（梗死体积测量前）评估神经功能。采用文献中报道的三种最常用的评分量表——Zea-Longa、Bederson和改良Garcia量表——进行综合评估（图2）。在24小时时，大鼠（n = 20）在Zea-Longa量表上的得分为2.02 ± 0.41，在Bederson量表上为2.80 ± 0.41，在改良Garcia量表上为8.15 ± 1.18；这些神经功能缺损在72小时时仍然显著（Zea-Longa：1.65 ± 0.59；Bederson：1.93 ± 0.38；改良Garcia：11.00 ± 1.34）。梗死体积以对侧半球体积的百分比表示，在MCAO后24小时为37.61 ± 2.81%，至72小时时下降至28.32 ± 4.18%。

图1：大鼠左侧颈脑动脉生理结构及大脑中动脉栓塞示意图。（A）颈脑动脉解剖结构，（B）插线前状态，（C）插线后状态，以及（D）线栓误入翼腭动脉的情况。CCA：颈总动脉；ICA：颈内动脉；ECA：颈外动脉；PPA：翼腭动脉；MCA：大脑中动脉。“黑色三角”：切口位置；蓝线：线栓。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：大鼠脑动脉闭塞后梗死体积测量及神经行为学评估。（A）脑组织切片的TTC染色。（B）72小时时的梗死体积小于24小时时的梗死体积。（C、D）72小时时的Zea-Longa评分和Bederson评分低于24小时时的评分。（E）72小时时的改良Garcia评分高于24小时时的评分。****P < 0.0001，***P < 0.001，**P < 0.01。请点击此处查看该图的放大版本。

表现	评分 / 分
无神经功能缺损	0
尾部悬吊时对侧前肢屈曲并内收（轻度神经功能缺损）	1
爬行时自发向对侧环形转动（中度神经功能缺损）	2
站立或行走时向对侧倾倒	3
（重度神经功能缺损）
无自发运动，伴有意识障碍	4

表1：Zea-Longa 评分^.

表现	评分/分值
抓住动物的尾巴并将其提起，使身体悬空于实验台上方10 cm处。正常大鼠的双侧前肢均会伸展朝向地面。存在神经功能缺损的大鼠可能出现以下行为：
无神经功能缺损	0
轻瘫的前肢屈曲并紧贴腹部，而未受影响的肢体则朝向实验台伸展	1
除第1项所述行为外，当动物俯卧于实验台上时，向轻瘫侧施加侧向推力，其抵抗能力明显减弱	2
除第1项和第2项所述行为外，动物行走时向轻瘫侧转圈	3

表2：Bederson评分^.

项目	表现	评分/分值
a)     自发运动	活动正常	3
（观察大鼠在笼中5分钟内的活动情况）	轻度受损	2
	中度受损	1
	无自发运动	0
b)    四肢对称性运动	姿势对称	3
	姿势不对称	2
	偏瘫	1
c)     前肢伸展	对称	3
（抓住尾巴，使前肢接近桌面边缘；观察前爪伸展情况）	轻度不对称	2
	明显不对称	1
	偏瘫	0
d)    抓握与攀爬能力	抓握牢固，攀爬有力	3
	单侧功能缺陷	2
	无法攀爬或出现转圈行为	1
e)     躯体双侧触觉反射	双侧对称	3
	一侧反应迟钝	2
	一侧无反应	1
f)     双侧触须触碰反应	对称	3
	不对称	2
	无反应	1

表3：改良Garcia评分。总分：0–18分；分数越高，神经功能越好。

讨论

需要明确的是，本研究的主要目标是方法学的标准化，而非生物学发现。建立标准化的MCAO方案对于减少实验室间的差异、提高缺血性脑卒中研究的可重复性至关重要。该方案通过严格的质控措施提高了操作的透明度，并解决了MCAO建模中的常见技术缺陷，包括标准化的线栓插入、温度调控以及组织学处理。

尽管在短暂性大脑中动脉闭塞（MCAO）模型中，梗死体积从24小时到72小时的减少以及部分神经功能恢复属于预期的病理生理现象，但本研究的贡献在于通过严格标准化的操作流程，确立了这些终点指标在时间上的可靠性。本方案提供了一个详细、分步的技术框架，确保未来针对神经炎症级联反应、凋亡通路或治疗干预机制的研究均建立在可重复且可比较的基线数据基础之上。我们明确将本工作定位为一项符合JoVE范畴的技术资源，旨在为标准化的临床前卒中研究提供基础，而非推进机制性认识。

本方案中有多个步骤对于确保稳定的缺血与再灌注至关重要。首先，精确推进阻塞线直至感受到轻微阻力，是实现可重复性大脑中动脉闭塞（MCAO）的关键，因为插入深度的微小偏差可能导致阻塞不完全或蛛网膜下腔出血^20,21。其次，严格维持术中正常体温（37 ± 0.5 °C）以及术后体温管理至关重要，因为体温过低或过高均会显著改变梗死区域范围和神经功能结局^12,22。第三，应在90秒内迅速取出脑组织并进行冰浴冷却，以最大限度减少自溶现象并保持组织完整性，从而确保TTC染色和体积分析的准确性²³。若这些步骤能够被 consistently 实施，将显著提高动物模型的可靠性以及不同研究之间的可比性。

我们改进了传统的MCAO方法，以提高其可重复性和操作便捷性。通过使用预冷的脑切片模具和标准化的切片流程，减少了人为误差和切片伪影。此外，由两名不知分组情况的研究人员采用三级神经功能评分系统（Zea-Longa评分、Bederson评分和改良Garcia评分）进行功能评估，提高了评估的稳健性和敏感性^17,18,19。通过覆盖各个实验阶段的详细标准操作程序，有助于识别常见问题，如线栓位置不当、过早再灌注或术后低体温。针对常见并发症的故障排除指导包括：（1）闭塞线位置错误（进入PPA），表现为在推进10–12 mm时无阻力感且神经功能立即改善；若出现此情况，应立即回撤线栓，将动物头部向对侧旋转30°，并以轻微内偏角度重新沿颅底方向推进；（2）过早再灌注，表现为闭塞期间神经功能突然改善；应确保硅胶止位器牢固固定于ECA残端，确认线栓直径与动脉大小匹配（240–270 g大鼠适用直径为0.35–0.40 mm），若仍存在移位，可考虑使用更长的线栓（增加0.5 mm硅胶涂层长度）；（3）术后低体温（直肠温度<36ºC）：将加热垫温度调至38 °C，在动物上方30 cm处放置热光源，并腹腔注射温热无菌生理盐水（0.5 mL，37ºC）。

尽管取得了这些进展，本实验方案仍存在若干局限性。首先，该技术需要较长的学习周期（10–15 次手术）才能达到稳定的成功率，且大鼠血管解剖结构的个体差异可能影响线栓的放置位置^21,24。其次，目前的方案依赖术后验证（神经功能评分和 TTC 染色），而非术中脑血流监测（LDF 或 LSCI），这限制了手术过程中的质量控制，并无法在早期排除闭塞不完全的动物²⁵。第三，验证仅限于年轻的雄性 Sprague-Dawley 大鼠，限制了该方法在雌性、老年动物及合并疾病模型中的普适性^26,27。未来的研究应纳入：（1）两种性别的动物，以将性别作为生物学变量加以考察；（2）具有血管合并症的老年大鼠（12–18 月龄）；以及（3）实时脑血流（CBF）监测，以提高药物干预研究的可重复性。

该方法在临床前药物筛选中具有重要价值，因其结果的一致性和转化相关性至关重要。本文所述的标准化方案有望显著提高缺血性脑卒中研究的严谨性和可重复性。该方案的未来应用包括：（1）在再灌注时间窗内给予神经保护剂的临床前筛选；（2）利用24小时和72小时时间点开展缺血-再灌注损伤的机制研究；（3）探索卒中后的神经可塑性及功能恢复；（4）结合遗传学或药理学干预手段，验证潜在治疗靶点。通过提供详细且配有视频支持的标准操作流程（SOP），我们的目标是促进该方法在不同专业水平实验室中的广泛应用，最终推动更可靠、更具临床相关性的临床前脑卒中研究。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2% TTC 染色液	北京索莱宝科技有限公司 &科技有限公司	T8170	25 克/瓶， ≥98% 纯度
4% PFA	北京索莱宝科技有限公司 &科技有限公司	P1110	500 mL 即用型
可吸收缝合线	山东威高集团医用高分子制品股份有限公司	VCP345H	5-0 Vicryl
Adson镊子	上海金钟外科器械有限公司	JD-11010	1×2 颗牙齿，12 厘米
杜蒙弯头镊	上海金钟外科器械有限公司	JD-11052	11 cm 长度，0.05 mm 细尖
反馈式加热垫	深圳瑞沃生命科学 &科技有限公司	69001	37 ± 0.3 °闭环
ImageJ	美国国立卫生研究院	版本 1.53k
虹膜剪	上海金钟外科器械有限公司	JD-14060	弯曲尖端，10 cm
微血管夹	深圳瑞沃德生命科技有限公司	JD-16010	1.5 cm 弯曲夹
不可吸收丝线	上海浦东金环医疗用品有限公司	S-2304	6-0黑色丝线
PASS 软件	NCSS, LLC，美国犹他州凯斯维尔	版本 15.0	样本量计算软件
大鼠脑组织矩阵	深圳瑞沃德生命科技有限公司	68610	2 mm 冠状切槽
硅胶涂层尼龙丝线	深圳瑞沃德生命科技有限公司	60-1250	0.35 mm 外径，30 mm 硅胶头，环氧乙烷灭菌
小型动物麻醉机	深圳瑞沃德生命科技有限公司	R500IE	异氟烷挥发罐，诱导室 &含面罩
SPSS	IBM 公司，Armonk，NY，美国	版本 26.0	统计分析软件
万纳斯显微剪	上海金钟外科器械有限公司	JD-14058	弯曲尖端，8 cm