大鼠经腔内大脑中动脉闭塞模型的标准化：带有质量控制措施的详细方案

摘要

本方案展示了一种经过优化的大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）技术，操作时间约为60分钟。通过多模态方法验证，该方案的成功率达到87.5%，死亡率极低，并可产生可重复的梗死和行为学结果，适用于脑卒中研究。

摘要

大鼠大脑中动脉阻塞（MCAO）模型仍是阐明缺血性脑卒中病理生理机制和验证神经保护疗法的参考标准。然而，细微的手术偏差可能显著改变梗死体积和行为学结果。采用一种 "先观察，后系统化" 在该框架下，我们重新审视了模型建立与验证的每一步骤。对关键手术解剖标志和重要操作步骤进行了详细的摄影记录，以标准化解剖定位和线栓放置。采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色法精确绘制再灌注后24小时和72小时脑梗死体积及拓扑结构。神经功能缺损程度采用Zea-Longa、Bederson和改良Garcia评分量表进行评估。24只雄性Sprague-Dawley大鼠接受60分钟短暂性大脑中动脉阻塞（MCAO），并在术后24小时和72小时评估梗死体积和神经功能评分。约87.50%的动物成功实现脑血流阻断（Zea-Longa评分≥1且TTC染色明确显示梗死灶），总体死亡率为12.50%，表明该模型具有高度可靠性。该标准化方案为临床前卒中研究提供了技术优化、可重复的基础，有助于在探究卒中病理生理机制及治疗干预的研究中实现实验室间的可比性。

引言

脑卒中是全球第二大死亡原因和第三大残疾原因^1,2。脑卒中对中低收入国家的影响尤为严重，其发病年龄平均比高收入国家早15年¹。脑卒中主要有两种类型：缺血性脑卒中（占85%）和脑内出血（占15%）³。缺血性脑卒中占所有脑卒中的绝大多数，由脑血流阻塞引起，导致细胞死亡和脑梗死⁴。缺血级联反应涉及多种生化事件，包括显著的促氧化过程^5,6。

尽管已开展了大量临床前和临床研究，但仅有少数疗法被证实有效，其中最显著的是静脉注射组织型纤溶酶原激活剂溶栓治疗和机械取栓术。然而，这些治疗方法受限于狭窄的治疗时间窗和严格的患者筛选标准。因此，迫切需要阐明缺血性损伤、神经血管修复以及卒中后恢复的细胞与分子机制。为此，建立一种可重复且具有临床相关性的动物模型至关重要。

大脑中动脉闭塞（MCAO）模型被广泛用于研究啮齿类动物的缺血性脑卒中^7,8。经腔内栓线闭塞....

方案

本实验经首都医科大学实验动物伦理委员会批准并监督。所有操作均符合《美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南》（NIH出版物80-23，1996年修订版）的要求，且必须使用无菌器械并采用无菌技术。

1. 动物选择

1. 使用来自认证实验动物供应商（许可证号：SCXK（北京）2021-0011）的雄性Sprague-Dawley大鼠（6–8周龄，体重240–270 g）建立MCAO模型。
2. 常规饲养动物，自由摄食饮水；所有操作均遵循国际伦理准则。
3. 根据动物体重选择以下标准确定栓线尺寸，以确保一致的闭塞效果：
   - 220–250 g：直径0.33–0.35 mm
   - 250–280 g：直径0.35–0.38 mm
   - 280–310 g：直径0.38–0.40 mm
   注意：这些参数考虑了血管直径随年龄增长的变化，可降低蛛网膜下腔出血（SAH）或闭塞不全的发生率¹³。

2. 样本量

1. 使用样本量计算软件进行样本量估算。根据初步数据，MCAO组的预期梗死体积为35% ± 10%（均值 ± 标准差），而假手术（SHAM）组为0% ± 2%，据此估算效应量（Cohen's ....

结果

动物被随机分配至再灌注后24小时（n = 10）或72小时（n = 10）的终末TTC染色组。另有4只大鼠接受大脑中动脉阻塞（MCAO）手术但在预定终点前死亡（死亡率为12.5%）。假手术（SHAM）组包含n = 6只动物。因此，实验共使用30只动物（24只MCAO + 6只SHAM）。

大鼠接受60分钟大脑中动脉闭塞（MCAO）以诱导脑缺血（图1）。通过移除血管内缝线并松解颈外动脉（ECA）近端结扎线来启动再灌注。在24只MCAO大鼠中，有3只在72小时内死亡；其中1只在24小时内死亡后经TTC染色显示梗死范围广泛，另2只死于未明原因。另有2只大鼠因建模失败被排除（神经功能评分未达标准，且TTC染色未显示梗死灶）。因此，72小时死亡率为12.50%。我们将建模成功定义为存活超过24小时且Longa评分达到1–3分，建模成功率达到87.50%。

在卒中发生后24小时和72小时（梗死体积测量前）评估神经功能。采用文献中报道的三种最常用的评分量表——Zea-Longa、B.......

讨论

需要明确的是，本研究的主要目标是方法学的标准化，而非生物学发现。建立标准化的MCAO方案对于减少实验室间的差异、提高缺血性脑卒中研究的可重复性至关重要。该方案通过严格的质控措施提高了操作的透明度，并解决了MCAO建模中的常见技术缺陷，包括标准化的线栓插入、温度调控以及组织学处理。

尽管在短暂性大脑中动脉闭塞（MCAO）模型中，梗死体积从24小时到72小时的减少以及部分神经功能恢复属于预期的病理生理现象，但本研究的贡献在于通过严格标准化的操作流程，确立了这些终点指标在时间上的可靠性。本方案提供了一个详细、分步的技术框架，确保未来针对神经炎症级联反应、凋亡通路或治疗干预机制的研究均建立在可重复且可比较的基线数据基础之上。我们明确将本工作定位为一项符合JoVE范畴的技术资源，旨在为标准化的临床前卒中研究提供基础，而非推进机制性认识。

本方案中有多个步骤对于确保稳定的缺血与再灌注至关重要。首先，精确推进阻塞线直至感受到轻微阻力，是实现可重复性大脑中动脉闭塞（MCAO）的关键，因为插入深度的微小偏差可能导致阻塞不完全或蛛网膜下腔出血

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2% TTC 染色液	北京索莱宝科技有限公司 &科技有限公司	T8170	25 克/瓶， ≥98% 纯度
4% PFA	北京索莱宝科技有限公司 &科技有限公司	P1110	500 mL 即用型
可吸收缝合线	山东威高集团医用高分子制品股份有限公司	VCP345H	5-0 Vicryl
Adson镊子	上海金钟外科器械有限公司	JD-11010	1×2 颗牙齿，12 厘米
杜蒙弯头镊	上海金钟外科器械有限公司	JD-11052	11 cm 长度，0.05 mm 细尖
反馈式加热垫	深圳瑞沃生命科学 &科技有限公司	69001	37 ± 0.3 °闭环
ImageJ	美国国立卫生研究院	版本 1.53k
虹膜剪	上海金钟外科器械有限公司	JD-14060	弯曲尖端，10 cm
微血管夹	深圳瑞沃德生命科技有限公司	JD-16010	1.5 cm 弯曲夹
不可吸收丝线	上海浦东金环医疗用品有限公司	S-2304	6-0黑色丝线
PASS 软件	NCSS, LLC，美国犹他州凯斯维尔	版本 15.0	样本量计算软件
大鼠脑组织矩阵	深圳瑞沃德生命科技有限公司	68610	2 mm 冠状切槽
硅胶涂层尼龙丝线	深圳瑞沃德生命科技有限公司	60-1250	0.35 mm 外径，30 mm 硅胶头，环氧乙烷灭菌
小型动物麻醉机	深圳瑞沃德生命科技有限公司	R500IE	异氟烷挥发罐，诱导室 &含面罩
SPSS	IBM 公司，Armonk，NY，美国	版本 26.0	统计分析软件
万纳斯显微剪	上海金钟外科器械有限公司	JD-14058	弯曲尖端，8 cm