多发性硬化症与血液恶性肿瘤：一项双向孟德尔随机化研究

Summary

这项双向双样本孟德尔随机化研究使用欧洲GWAS评估多发性硬化症（MS）与血液恶性肿瘤（HM）之间的因果关系。遗传性多发性硬化症与霍奇金淋巴瘤和未明确白血病的概率增加相关;其他亚型或逆向分析无关联。

Abstract

观察性研究报告了多发性硬化症（MS）与血液恶性肿瘤（HM）之间的关联，但结果仍然不一致。我们利用公开的全基因组关联汇总统计数据，对多发性硬化症（n = 115,803）和孟德尔遗传病（n = 218,792）进行了双向孟德尔随机化（MR）分析。主要因果估计使用逆方差加权（IVW）估计器，辅以预先指定的异质性和多效性敏感性分析。遗传上对多发性硬化症的易发性与白血病（未指定亚型）的较高几率相关（比值比[OR] 1.311,95%置信区间[CI] 1.002-1.716，P = 0.048）和霍奇金淋巴瘤（HL）（OR 1.224,95% CI 1.052-1.425，P = 0.009），且无其他白血病、淋巴瘤或浆细胞肿瘤亚型的证据（均为P > 0.05）。检测显示白血病（未指明亚型）和HL分析均无显著异质性或方向性多效性。这些结果提供了与高遗传易感个体中某些HM亚型风险升高的遗传证据相符;然而，这些信号应谨慎解读，并在更大的多祖源数据集和额外的因果框架中进行验证。

Introduction

多发性硬化症（MS）是一种中枢神经系统的慢性自身免疫性疾病，其特征是炎症性脱髓鞘化和复发-缓解过程，可能导致残疾以及沉重的社会和家庭^负担1。血液恶性肿瘤（HM）包括起源于造血或淋巴系统的异质性肿瘤，约占全球所有肿瘤的6.5%。尽管靶向和免疫治疗为许多患者带来了改善的结局，但第³子群体的预后仍然较差。MS与HM之间的关系已被研究数十年，结果分歧^4,5。在一项挪威注册研究中，包含6,883例多发性硬化症病例和37,919名匹配对照组，未观察到多发性硬化症与血液癌症风险之间存在统计学显著关联。同样，丹麦一项研究报告MS患者HM发病率仅有边缘且统计学上无显著性的升高，与对照组相比。相比之下，一些队列研究显示特定情境或亚型风险更高：一项韩国前瞻性研究报告称MS⁶患者淋巴瘤发病率高出4.52倍，大型队列分析（29,617名MS对296,164例非MS）发现^MS7组整体HM风险更高。然而，其他研究未观察到既有MS ^8,9患者患非霍奇金淋巴瘤（NHL）或HL的风险增加。总体而言，关于关联的证据——尤其是在HM亚型层面——仍不确定。

孟德尔随机化（MR）利用生殖系遗传变异作为可改变暴露的代理，原则是等位基因分配相对于许多环境混^{杂因素具有}有效随机性的。通过使用与特定暴露密切相关的遗传工具，磁共振可以加强因果推断，减少混杂或逆转因果关系的偏倚¹¹。

本研究采用双向双样本MR框架，从遗传学角度评估MS与主要HM类别——白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤（MM）之间的潜在因果关系。原创性声明：据我们所知，这是首个双向磁共振，系统性地探究亚型特异性质质与重质性质质的关系，同时预先指定作参数（仪器阈值、灵光灯聚团、协调和灵敏度诊断），实现完全可重复性。

Protocol

本研究分析了公开可得的去识别化、摘要级别的全基因组关联研究（GWAS）统计数据。根据存储库政策及原研究者获得的批准，本次二级分析无需新的机构审查委员会批准或额外的个人知情同意。所有贡献的GWAS在其来源出版物中报告了伦理审批和同意程序。所有分析均遵循机构指南和赫尔辛基宣言。

概述与理由

该研究采用了双向、两样本孟德尔随机化（MR）框架，仅限于欧洲祖源总结统计，以评估多发性硬化症（MS）与血液恶性肿瘤（HM）之间的潜在因果关系。设计遵循三大核心磁共振假设：仪器相关性、无混杂因素独立性和排除限制。因此，工作流程包括：（i）数据集访问与整理，（ii）全基因组显著性且伴随连锁不平衡（LD）聚集的仪器选择，（iii）使用PhenoScanner筛查混杂因素，（iv）等位基因协调并明确处理回文变异，（v）使用Steiger检验¹²进行方向性评估，（vi）使用辅助方法进行初级MR估计，（vii）完整的敏感性诊断，以及（viii）标准化的图形和表格生成，具体如下多重测试对照组。每一步在后续协议子章节中有详细描述，流水线概述见 图1。

材料、软件与RRIDs

分析在R版本4.3.1（RRID：SCR_001905）中使用RStudio/Posit 2023.12+（RRID：SCR_000432）进行。LD聚块在本地执行时，使用PLINK v1.9（构建2.3;RRID：SCR_001757）¹³。MR估计和数据提取使用R软件包TwoSampleMR v0.5.7 ¹⁰;潜在混杂因素的仪器查询使用了PhenoScanner v1.0;异常值的检测和校正使用MRPRESSO v1.0。对于没有RRID的包裹，会报告精确版本。

数据来源与访问

多发性硬化症综合统计数据来自国际多发性硬化症遗传学联盟的荟萃分析，涵盖47,429例多发性硬化症病例和68,374例对照组，并对照15个队列进行协调质量控制。HM摘要统计数据来自FinnGen（总n=218,792;>1600万变异），包括霍奇金淋巴瘤（HL）、弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）、滤泡性淋巴瘤（FL）、成熟T/NK淋巴瘤（MTNKL）、其他或未明确的非霍奇金淋巴瘤（NHL）、淋巴性白血病、骨髓性白血病、未特定细胞类型的白血病及多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤¹⁴.数据集通过IEU OpenGWAS门户访问，使用文档化的登录标识符¹⁵。因此，本研究的所有分析均仅基于这些公开的摘要级GWAS数据集;未使用或生成任何机构内部队列或个体层面的患者数据。由于我们未能识别出具有统一MS和血液恶性肿瘤亚型定义的额外GWAS以实现完整流程复制，未进行使用独立数据集进行的外部验证，且已承认这是一项局限性。该协议设计时可以直接重新应用到未来的GWAS数据集中进行独立验证。

仪器选择与LD聚团

对于每次暴露，利用TwoSampleMR中的extract_instruments函数应用于OpenGWAS数据集，选择了全基因组显著性（P < 5 × ^10-8）单核苷酸多态性（SNP）。为确保仪器独立性，LD聚团随后在欧洲祖先参考面板上进行，使用TwoSampleMR的内部聚团工具或本地使用PLINK，r²阈值为0.001，物理窗口为10,000千碱基。使用PLINK时，命令行参数被设定为主要显著阈值为5× ^10-8，r² = 0.001，窗口为10 Mb，以确保聚集仪器完全符合这些标准。仪器强度通过暴露效应估计及其标准误（F ≈ β²/SE²）推导出的F统计量进行评估;带有F<10的变体被排除在最终仪器组之外，剩余的SNP则被带入PhenoScanner筛查。

使用PhenoScanner进行混杂因素筛查

为减少已知风险因素导致的水平多效性，每个候选仪器均在PhenoScanner V2中使用phenoscanner R软件包（v1.0）^16,17在GWAS目录中查询。对于每个SNP，我们请求了P、<1×10^⁻5的所有报告关联，并手动检查返回的性状。与既有血液恶性肿瘤风险因素（如吸烟相关暴露或肥胖/人体测量特征（如体重指数、腰围和体脂指标）或与血液恶性肿瘤表型的直接关联的关联，促使对应SNP被排除在¹⁸号工具集中。被视为排除性的特征类别基于与白血病、淋巴瘤或骨髓瘤风险相关的既往证据，18,19,20。查询使用了广泛的关键词词干（例如，烟雾、香烟、BMI、肥胖、腰部、脂肪、血液恶性肿瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤）。所有移除都被记录在跟踪表格中，连同触发排除的PhenoScanner特征一起记录，清理后的乐器列表随后被传递到协调步骤。

协调与回文处理

每个SNP的效应等位基因通过TwoSampleMR软件包中的harmonise_data函数（v0.5.7，R）在暴露和结局数据集间进行协调。我们将所有结局等位基因与暴露效应等位基因对齐，使得正的β系数在两个数据集中始终对应同一等位基因。在OpenGWAS参考面板中，效果等位基因频率介于中间（0.42-0.58）的回文变体（A/T或C/G）被视为链模糊，并通过设置协调动作去除模糊SNP自动移除。效果-等位基因频率超出该范围的回文SNP则保留并根据报告的等位基因频率进行比对。由于FinnGen结果间等位基因可用性和回文状态略有差异，每个HM表型分别进行协调，最终从协调后的R对象中提取进入各结果特异性分析的仪器数量，并报告于表格中。

方向性评估（斯泰格滤波）

方向性评估采用了TwoSampleMR steiger_filtering函数中实现的Steiger方法。对于每个SNP，函数首先计算了暴露和结局的方差（R²），由GWAS的β系数、标准误差和样本量计算出来。研究随后剔除了结果中R²大于暴露的仪器，表明效应可能反向。每个结局数据集分别应用了斯泰格过滤，其余工具（steiger_dir == TRUE）被保存并用于后续的MR分析。每个结局记录了Steiger后工具计数，并与MR估计值一同报告。

初级MR估计与多重测试对照

主要因果估计采用固定效应模型下，采用TwoSampleMR中的mr函数，方法标注为“mr_ivw”、“mr_egger_regression”和“mr_weighted_median”。对每个HM结果，都将协调和斯泰格滤波的仪器传递到m，提取对数比值比和标准误，以指数化得到²¹号二元性状的比谱比（OR）和95%置信区间（CI）。为了检验对无多效性假设的适度违背的鲁棒性，我们还应用了同一软件包中实现的加权中位数和MR-Egger回归估计量^22,23。当Cochran的Q检验（来自mr_heterogeneity）显示显著异质性（P < 0.05）时，研究还拟合了乘法随机效应IVW模型，并报告了固定效应和随机效应结果。九个HM结局的家族误差通过Bonferroni校正控制，α = 0.05/9 = 5.56×^10-3;P值低于该阈值的关联被视为统计学显著，而P值为0.0056≤<0.05的关联则被解读为暗示性，并谨慎描述。

敏感性诊断：异质性、多效性与异常值

Cochran的Q统计量被用于评估IVW和MR-Egger模型间的异质性，该模型通过TwoSampleMR中的mr_heterogeneity函数实现。方向水平多效性通过MR-Egger截距检验（mr_pleiotropy_test）和MR-PRESSO^包中的全局检验进行了评估。MR-PRESSO²⁴ 按照 R 中的推荐设置（NbDistribution ≥ 5,000，SignifThreshold = 0.05）进行，以检测影响性离群值并通过比较离群值移除前后 IVW 估计来量化潜在失^真。对每对暴露-结局对进行了省略一缺失分析（mr_leaveoneout），以确定是否有单一SNP对整体估计值产生了不成比例的影响。为了透明和可重复性，所有诊断输出均从R导出，并与相应的仪器计数一同报告，包括协调、Steiger滤波和MR-PRESSO异常值去除。

仪器强度与NOME评估

MR-Egger的仪器强度采用I²GX统计量，计算为1减去SNP暴露关联的平方标准误差均值除以²⁶仪器间的方差。接近1的值表示对无测量误差（NOME）假设的更符合;较低的数值表明可能存在回归稀释，并应迅速谨慎解读MR-Egger结果。计算并报告了每个结局特异性分析的^{2 GX}。

反孟德尔随机化

整个流程反向重复，将每个HM亚型视为暴露，MS作为结果。当全基因组显著性仪器不足以应对特定HM暴露时，允许在保持相同LD聚团参数、PhenoScanner筛查、协调程序、Steiger滤波和敏感性诊断的同时，选择阈值为P、5<×^10-6 。使用宽松阈值的分析在相应的表格和图例中有清晰标注。

可视化与图形导出

散点图、森林图、漏斗图和省略一图生成，图例置于面板下方，字体大小调整以确保标签不会遮挡标注数据。轴极限在可比结局间进行了标准化，以便于视觉比较。人物以最低300 dpi的分辨率导出，采用无损格式，如TIFF或PNG。所有绘制的数值均与报告估计值进行交叉核对，以确保文本、表格和图表之间的一致性。

可重复性与数据共享

在适用范围内固定了随机种子，记录了软件版本，分析脚本及中间对象归档，以便所有步骤的重运行。记录了数据集接入标识符和表型定义，并根据期刊指南准备了各过滤阶段——聚团后、协调后、斯泰格后过滤和MR-PRESSO后期的仪器列表，准备以电子表格文件形式上传。

Results

器乐变体的选择

采用全基因组显著性阈值P < 5×10^⁻8，初步检索了22,466个MS单核样本。在 PLINK 中的 LD 聚团（r² < 0.001，窗口 10,000 kb）后，仍保留了 72 个 SNP 作为仪器，每个 SNP 的 F > 10（范围 30-1,044）。为通过已知风险通路减少多效性，通过PhenoScanner V2去除了11个与潜在HM混杂因素相关的SNP（如体质指数、腰围、体重、髋围、脂肪百分比、脂肪质量、1年前体重变化、出生体重、基础代谢率、皮肤癌、卵巢癌）。此外，之前与NHL相关的rs12365699被排除在NHL亚型（FL、DLBCL、MTNKL及其他/未明确NHL）分析之外。MS与每个HM结局的协调导致每个结局切除四个中间等位基因频率的回文SNP（rs12434551、rs12478539、rs4896153、rs4939490）。共计455例暴露-结局工具实例进入了九个HM结局的MR分析;补充 表1提供了GWAS数据集的综合概述，各结果...

Discussion

这项以欧洲血统为基础的两样本孟德尔随机化（MR）研究提供了遗传证据，支持多发性硬化症（MS）遗传风险较高的个体中霍奇金淋巴瘤（HL）和未特定细胞类型白血病的风险更高，但并未显示与其他白血病亚型、非霍奇金淋巴瘤（NHL）亚型或多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤的有力关联²⁷.HL和未指定白血病的信号在家族误差控制下具有暗示性而非确定性（Bonferroni α = 0.0056），应结合诊断和研究限制进行解释²⁸。方向检查（Steiger滤波）仅保留每个结果方向有效的工具;MR-PRESSO显示HL估计对去除单一影响变异具有稳健性（前后异常值估计相似）;^I2GX值（≈0.93-0.95）支持MR-Egger的仪器强度。反向分析（HM → MS）均为零，^在所检视的条件下反向因果关系存在。

关于多发性硬化症及其后续淋巴瘤的广泛文献存在差异。关于淋巴瘤风险增加的报告范围...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
邦费罗尼修正（α = 0.0056）	统计方法参考及nbsp;	BC-0056	多重检测纠正方法以控制假阳性率
科克伦Q统计量	科克伦，1954年及;	Q-001（https://www.jstor.org/stable/2334368）	用于评估磁共振仪器之间的异质性
F-统计量	TwoSampleMR 文档	F-049（https://cran.r-project.org/web/packages/TwoSampleMR/vignettes/perform_mr.html）	评估磁共振中仪器强度的指标
HM汇总统计（GWAS）	FinnGen	https://www.finngen.fi/en	血液恶性肿瘤的基因组数据（n = 218,792），包括霍奇金淋巴瘤（HL）、非霍奇金淋巴瘤（NHL）、白血病等。
I2GX 统计量	Bowden 等，2016年	I2GX-074（https://academic.oup.com/ije/article/44/2/512/753845）	统计量用于评估“无测量误差”假设的合规性
LD聚团参数	链接	https://www.cog-genomics.org/plink/1.9	LD聚团参数以确保遗传工具的独立性
MR-PRESSO v1.0	MR-PRESSO	1445年（https://github.com/rondolab/MR-PRESSO 年）	异质性及离群值检测与校正软件
硕士总结统计（GWAS）	国际MS遗传学联盟	https://imsgc.net	多发性硬化症（MS）基因组数据（n = 115,803），来自欧洲队列
表型扫描器 V2	表型扫描器	1550年（http://www.phenoscanner.medschl.cam.ac.uk 年）	用于筛查遗传工具与已知混杂因素（如吸烟、BMI）关联的数据库
PLINK v1.9	链接	SCR_001757（https://www.cog-genomics.org/plink/1.9）	全基因组关联分析与连锁不平衡（LD）聚团的软件
R 版本 4.3.1	R基金会	SCR_001905（https://www.r-project.org）	开源统计计算软件
斯泰格测试	TwoSampleMR 方法论	STG-001（https://cran.r-project.org/web/packages/TwoSampleMR）	孟德尔随机化中方向性的统计检验
TwoSampleMR v0.5.7	RStudio / CRAN	1134年（https://cran.r-project.org/package=TwoSampleMR 年）	用于两样本孟德尔随机化（MR）分析的R包
加权中位数与MR-Egger	孟德尔随机化方法	WM-026（https://cran.r-project.org/package=MendelianRandomization）	磁共振敏感性分析的替代估计量