采用D-半乳糖在小鼠和HK-2细胞中建立衰老模型。通过蛋白质印迹和免疫荧光检测评估虫草多糖（CCP）对肾脏衰老的影响，并通过活性氧检测和JC-1染色评估线粒体变化。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
采用D-半乳糖在小鼠和HK-2细胞中建立衰老模型。通过蛋白质印迹和免疫荧光检测评估虫草多糖（CCP）对肾脏衰老的影响，并通过活性氧检测和JC-1染色评估线粒体变化。
慢性肾脏病（CKD）是全球重要的公共卫生问题。肾小管上皮细胞（RTECs）的衰老会损害肾脏的再生与修复能力，并通过释放衰老相关分泌表型（SASP）促进CKD进展。Cordyceps sinensis的主要生物活性成分包括虫草多糖（CCP），已被用于多种CKD临床制剂中，并显示出治疗益处。为探讨CCP在肾脏衰老中的作用，本研究建立D-半乳糖诱导的小鼠肾衰老模型，并以CCP进行干预。通过衰老相关染色及肾功能评估来分析治疗效果。此外，建立D-半乳糖诱导的HK-2细胞衰老模型，以探究其潜在的细胞机制。在衰老条件下，采用JC-1染色和活性氧（ROS）检测评估CCP处理后的线粒体变化。通过免疫荧光、蛋白质印迹（western blotting）和定量PCR（RT-PCR）分析CCP对MAPK磷酸化、NF-κB核转位以及NLRP3炎症小体活化的影响。结果显示，在D-半乳糖诱导的细胞和动物衰老模型中，CCP可减轻肾小管间质细胞衰老、肾损伤和纤维化，同时改善线粒体功能。这些作用与调控ROS/MAPK/NF-κB/NLRP3信号通路相关。
慢性肾脏病（CKD）是最常见的肾脏疾病之一，影响全球大量人群。其发生与衰老密切相关1。肾小管是肾脏的主要功能单位，肾小管上皮细胞（RTECs）内的细胞衰老是导致肾功能下降的重要因素2。药物暴露及其他应激因素可诱导与小管应激相关的衰老，进而导致肾功能进行性丧失，并最终发展为终末期肾病（ESKD）。因此，靶向干预RTECs中的细胞衰老可能是延缓肾脏衰老以及预防或治疗CKD的有效策略。
慢性炎症是衰老的特征之一3 ，也是多种年龄相关疾病的重要驱动因素。衰老细胞释放的促炎性细胞因子 collectively 被称为衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype, SASP）4。SASP 可促进持续性炎症反应，诱导邻近细胞发生衰老，并导致机体功能进行性衰退5。D-半乳糖（D-gal）诱导的衰老模型是目前应用最广泛的实验性衰老模型之一。既往研究表明，D-gal 处理可导致细胞内活性氧（ROS）蓄积、线粒体功能障碍、氧化还原稳态失衡以及应激相关细胞衰老的发生6。与耗时较长且个体间变异较大的自然衰老模型相比，D-半乳糖诱导模型具有操作简便、诱导迅....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
所有动物实验均按照机构指南进行，并经南京中医药大学动物伦理委员会批准（伦理批准号：202108A006）。细胞培养和染色过程中产生的所有废弃物均收集于密封容器和生物危害袋中，并由有资质的医疗废物管理服务机构处理。
动物模型与治疗干预
为尽量减少个体间差异，将40只小鼠随机分为五组（每组n = 8），并接受以下干预措施：（1）对照组：每只小鼠灌胃给予0.2 mL生理盐水；（2）模型组：每天皮下注射D-半乳糖（250 mg/kg），按每只小鼠0.2 mL的25 mg/mL溶液给予；（3）低剂量CCP组：在给予D-半乳糖注射的同时，每只小鼠灌胃给予50 mg/kg的CCP（0.2 mL的5 mg/mL溶液）；（4）高剂量CCP组：在给予D-半乳糖注射的同时，每只小鼠灌胃给予100 mg/kg的CCP（0.2 mL的10 mg/mL溶液）；（5）维生素E组：在给予D-半乳糖注射的同时，每只小鼠灌胃给予100 mg/kg的维生素E（0.2 mL的10 mg/mL溶液）。经过8周处理后，处死小鼠，并采集血清、尿液和肾组织样本用于后续分析。
肾功能分析
根据制造商说....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
采用D-半乳糖建立小鼠衰老模型，以维生素E作为常用的抗衰老阳性对照。对衰老小鼠给予不同剂量的虫草多糖（CCP）进行干预。衰老小鼠表现出显著的肾功能损伤，表现为尿蛋白、血清尿酸和肌酐水平升高（图2B-D）。维生素E和CCP干预均能减轻上述异常。SA-β-半乳糖苷酶染色显示，CCP处理小鼠的肾脏细胞衰老程度降低，其效果与维生素E组相当（图2E）。
肾组织的H&E染色显示，对照组小鼠的肾小管结构保持完整，细胞形态正常（图3A、D）。相比之下，D-半乳糖组出现肾小管扩张、细胞肿胀以及炎性细胞浸润。Masson三色染色显示该组胶原沉积增加（图3B、E）。维生素E或CCP处理可减轻这些病理改变，并缓解纤维化。此外，CCP和维生素E均能减少肾组织中活性.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
本研究证实了虫草多糖对肾小管上皮细胞的保护作用，并提供了证据表明其通过调控ROS/MAPK/NF-κB/NLRP3信号通路减轻HK-2细胞的炎症性衰老。这些发现进一步阐明了 Cordyceps sinensis来源化合物在治疗急性和慢性肾脏疾病中的潜在作用机制，为未来抗衰老治疗策略的研究提供了参考。
细胞衰老是一种复杂的生物学过程，也是影响多个器官的退行性疾病的重要诱因1。肾脏特别容易受到与衰老相关的损伤，这种损伤伴随着进行性功能下降和特征性的组织学改变。肾衰老（RS）与慢性肾脏病（CKD）密切相关，在CKD的不同阶段均观察到加速衰老的现象，导致衰老细胞在肾组织中积聚19。越来越多的证据表明，肾小管上皮细胞（RTECs）的衰老在肾脏老化过程中起着关键作用，并促进肾纤维化的发展9
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
作者声明无利益冲突。
本研究由国家自然科学基金（编号：8217150545，82575032）资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Caspase-1/活化型 兔多克隆抗体 | WL03450 | 中国沈阳 | |
| CCK-8试剂盒 | C0037 | 碧云天，上海，中国 | |
| CCP | B21296 | 中国沈阳，源野生物 | |
| 肌酐检测试剂盒 | C011-2-1 | 中国江苏南京 Jiancheng | |
| D-半乳糖 | HY-N0210 | 美国MCE | |
| ERK 兔多克隆抗体 | 4695 | 美国 CST | AB_390779 |
| gapdh 兔多克隆抗体 | ac033 | Abclonal，中国武汉 | |
| H & E 染色试剂盒 | G1120 | Solarbio，北京，中国 | |
| JC-1试剂盒 | C2003S | Biyotime，上海，中国 | |
| Masson染色试剂盒 | G1340 | Solarbio，北京，中国 | |
| NLRP3 兔多克隆抗体 | WLH3383 | 中国台湾，Wanlei，Shengyang | |
| P21 兔多克隆抗体 | 64016s | CST，美国 | AB_2892063 |
| p38 兔多克隆抗体 | 9212 | CST，美国 | AB_330713 |
| p50 兔多克隆抗体 | 3035 | CST，美国 | AB_330564 |
| p65 兔多克隆抗体 | 8242 | CST，美国 | AB_10859369 |
| p-ERK 兔多克隆抗体 | 4370 | CST，美国 | AB_2315112 |
| 磷酸化 SAPK/JNK 单克隆抗体 | 4668 | CST，美国 | AB_823588 |
| p-p38 兔多克隆抗体 | 4511 | CST，美国 | AB_2139682 |
| ROS染色试剂盒 | S0033S | 中国上海碧云天生物技术有限公司 | |
| SAPK/JNK 抗体 | 9256 | CST，美国 | AB_2250373 |
| SA-β-gal试剂盒 | C0602 | Biyotime，中国上海 | |
| 尿酸检测试剂盒 | C012-2-1 | 中国南京 Jiancheng | |
| 尿蛋白检测试剂盒 | C035-2-1 | 中国南京 Jiancheng | |
| 维生素E | S27812 | 中国沈阳，源野生物 | |
| <强>PCR引物 | |||
| 基因名称 | 上游引物 | 反向引物 | |
| Caspase-1 | 5’-TACAGACAAGGGTGCTGAACAA-3’ | 5’-CGGAATAACGGAGTCAATCAAA-3’ | |
| GAPDH | 5’-AGAAGGTGGTGAAGCAGGCGTC-3’ | 5’-AAAGGTGGAGGAGTGGGTGTCG-3’ | |
| NLRP3 | 5’-GATCTTCGCTGCGATCAACAG-3’ | 5’-CGTGCATTATCTGAACCCCAC-3’ |
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。