采用D-半乳糖在小鼠和HK-2细胞中建立衰老模型。通过蛋白质印迹和免疫荧光检测评估虫草多糖（CCP）对肾脏衰老的影响，并通过活性氧检测和JC-1染色评估线粒体变化。
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采用D-半乳糖在小鼠和HK-2细胞中建立衰老模型。通过蛋白质印迹和免疫荧光检测评估虫草多糖（CCP）对肾脏衰老的影响，并通过活性氧检测和JC-1染色评估线粒体变化。
慢性肾脏病（CKD）是全球重要的公共卫生问题。肾小管上皮细胞（RTECs）的衰老会损害肾脏的再生与修复能力，并通过释放衰老相关分泌表型（SASP）促进CKD进展。Cordyceps sinensis的主要生物活性成分包括虫草多糖（CCP），已被用于多种CKD临床制剂中，并显示出治疗益处。为探讨CCP在肾脏衰老中的作用，本研究建立D-半乳糖诱导的小鼠肾衰老模型，并以CCP进行干预。通过衰老相关染色及肾功能评估来分析治疗效果。此外，建立D-半乳糖诱导的HK-2细胞衰老模型，以探究其潜在的细胞机制。在衰老条件下，采用JC-1染色和活性氧（ROS）检测评估CCP处理后的线粒体变化。通过免疫荧光、蛋白质印迹（western blotting）和定量PCR（RT-PCR）分析CCP对MAPK磷酸化、NF-κB核转位以及NLRP3炎症小体活化的影响。结果显示，在D-半乳糖诱导的细胞和动物衰老模型中，CCP可减轻肾小管间质细胞衰老、肾损伤和纤维化，同时改善线粒体功能。这些作用与调控ROS/MAPK/NF-κB/NLRP3信号通路相关。
慢性肾脏病（CKD）是最常见的肾脏疾病之一，影响全球大量人群。其发生与衰老密切相关1。肾小管是肾脏的主要功能单位，肾小管上皮细胞（RTECs）内的细胞衰老是导致肾功能下降的重要因素2。药物暴露及其他应激因素可诱导与小管应激相关的衰老，进而导致肾功能进行性丧失，并最终发展为终末期肾病（ESKD）。因此，靶向干预RTECs中的细胞衰老可能是延缓肾脏衰老以及预防或治疗CKD的有效策略。
慢性炎症是衰老的特征之一3 ，也是多种年龄相关疾病的重要驱动因素。衰老细胞释放的促炎性细胞因子 collectively 被称为衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype, SASP）4。SASP 可促进持续性炎症反应，诱导邻近细胞发生衰老，并导致机体功能进行性衰退5。D-半乳糖（D-gal）诱导的衰老模型是目前应用最广泛的实验性衰老模型之一。既往研究表明，D-gal 处理可导致细胞内活性氧（ROS）蓄积、线粒体功能障碍、氧化还原稳态失衡以及应激相关细胞衰老的发生6。与耗时较长且个体间变异较大的自然衰老模型相比，D-半乳糖诱导模型具有操作简便、诱导迅速以及组内变异相对较小的优势。该模型适用于体内和体外研究。尽管其不能完全模拟缓慢、无病理状态的自然衰老过程，但由于肾脏具有较高的代谢活性且易受氧化应激影响，因此该模型非常适合用于肾脏衰老的研究。从机制上看，D-半乳糖主要通过诱导氧化应激促进细胞衰老，这与聚焦于衰老过程中 ROS 生成和线粒体功能障碍的研究结果一致。
Cordyceps sinensis 是一种传统中药真菌，广泛用于治疗肾脏相关疾病7。其含有多种生物活性成分，包括多糖、腺苷、氨基酸、虫草素和麦角固醇。冬虫夏草的提取物及发酵制剂具有抗炎、抗氧化和抗衰老特性8,9,10,11。例如，冬虫夏草多糖已被证明可通过抑制 TGF-β1/Smad 信号通路，减少哮喘小鼠模型中的炎症浸润12。此外，冬虫夏草多糖可抑制 RAW264.7 细胞中 MAPK 通路的磷酸化，并降低 IL-6 和 IL-1β 等炎症细胞因子的表达13。既往研究表明，冬虫夏草多糖（CCP）作为冬虫夏草的主要生物活性成分，可通过调节自噬并抑制衰老相关分泌表型（SASP）的产生，减轻肾小管上皮细胞的衰老。然而，CCP 对抗活性氧（ROS）介导损伤的分子机制仍尚未完全阐明。
本研究探讨了CCP对小鼠肾脏衰老的保护作用，并利用D-半乳糖诱导的肾小管上皮细胞衰老模型，评估其对炎症、氧化应激和细胞衰老的影响。我们进一步探究了CCP是否调控活性氧（ROS）的产生、线粒体功能以及包括MAPK磷酸化、NF-κB核转位和NLRP3炎症小体活化在内的下游信号通路。综上所述，本研究旨在为CCP在肾脏衰老及年龄相关性肾损伤研究中的应用提供实验依据。整体实验流程及 proposed 机制总结于图1中。
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所有动物实验均按照机构指南进行，并经南京中医药大学动物伦理委员会批准（伦理批准号：202108A006）。细胞培养和染色过程中产生的所有废弃物均收集于密封容器和生物危害袋中，并由有资质的医疗废物管理服务机构处理。
动物模型与治疗干预
为尽量减少个体间差异，将40只小鼠随机分为五组（每组n = 8），并接受以下干预措施：（1）对照组：每只小鼠灌胃给予0.2 mL生理盐水；（2）模型组：每天皮下注射D-半乳糖（250 mg/kg），按每只小鼠0.2 mL的25 mg/mL溶液给予；（3）低剂量CCP组：在给予D-半乳糖注射的同时，每只小鼠灌胃给予50 mg/kg的CCP（0.2 mL的5 mg/mL溶液）；（4）高剂量CCP组：在给予D-半乳糖注射的同时，每只小鼠灌胃给予100 mg/kg的CCP（0.2 mL的10 mg/mL溶液）；（5）维生素E组：在给予D-半乳糖注射的同时，每只小鼠灌胃给予100 mg/kg的维生素E（0.2 mL的10 mg/mL溶液）。经过8周处理后，处死小鼠，并采集血清、尿液和肾组织样本用于后续分析。
肾功能分析
根据制造商说明书，使用商用检测试剂盒检测肌酐、尿酸和尿蛋白以评估肾功能。采用多功能酶标仪分别在505 nm、510 nm和585 nm波长下测定肌酐、尿酸和尿蛋白的吸光度值。
组织切片染色
将石蜡包埋的肾组织切成 4 µm 厚的切片。切片脱蜡后，用苏木精孵育 5 分钟，流水冲洗，再用 1% 酸性乙醇分化 5 秒，再次冲洗。随后用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤 1 分钟，切片用伊红复染 3 分钟，脱水并封片。对于马松三色染色，切片脱蜡后按上述方法用苏木精染色，接着用猩红S染色 5 分钟，苯胺蓝染色 5 分钟，然后脱水并封片。
细胞活力检测
将HK-2细胞以每孔1 × 10⁵个细胞的密度接种至12孔板中。经D-半乳糖和虫草多糖处理24小时后，向每孔加入10% CCK-8溶液14。在37 °C孵育30分钟后，使用酶标仪在450 nm处测定吸光度。虫草多糖的质量控制文件及HK-2细胞的STR鉴定结果见补充文件1。
逆转录定量聚合酶链式反应
细胞培养24小时后，移除培养基，使用提取试剂提取总RNA。采用微量分光光度计测定RNA浓度，并通过2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。去除基因组DNA后，通过逆转录反应合成cDNA。引物序列见材料表。
细胞内活性氧水平的测定
将HK-2细胞以每孔1 × 10⁵个细胞接种至12孔板中。待细胞融合度达到60–70%时，用D-半乳糖预处理12小时。药物处理24小时后，弃去培养基，用PBS洗涤细胞一次。通过加入对活性氧敏感的荧光探针，在37 °C孵育20分钟检测细胞内活性氧水平，并在激发/发射波长488/525 nm下采集荧光图像15。
蛋白质印迹
使用 RIPA 缓冲液裂解细胞蛋白，并在 4 °C 下以 13,000 × g 离心 15 分钟以澄清裂解液。将蛋白样品煮沸 10 分钟使其变性，取等量蛋白（每样本 20 µg）进行电泳分离，随后转移至 PVDF 膜。膜在室温下封闭 1 小时后，与一抗于 4 °C 孵育过夜。用 PBST 洗涤后，加入 HRP 标记的二抗孵育，最后使用增强型化学发光（ECL）底物进行检测。16抗体详细信息和试剂标识符列于下文 材料表.
SA-β-半乳糖苷酶衰老染色
将HK-2细胞以每孔1 × 10⁵个细胞的密度接种于12孔板中。当细胞融合度达到60-70%时，用D-半乳糖预处理12小时。按照试剂盒说明书进行SA-β-半乳糖苷酶染色，并在光学显微镜下观察染色细胞17。
线粒体膜电位的测定
采用JC-1荧光探针，按照供应商说明书检测线粒体膜电位。JC-1单体在激发/发射波长490/530 nm处检测，而JC-1聚集体在525/590 nm处检测。当观察到清晰的红色或绿色荧光信号时采集图像。
统计分析
数据以柱状图或点状图表示，并使用引用的软件进行分析。Western blot 条带强度使用 ImageJ 进行定量。数据采用方差分析（ANOVA）进行分析，组间比较随后进行 t 检验。统计学显著性定义为 P 值 < 0.05。符号表示与对照组（*）或 D-gal 组（#）的比较（*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001）。
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采用D-半乳糖建立小鼠衰老模型，以维生素E作为常用的抗衰老阳性对照。对衰老小鼠给予不同剂量的虫草多糖（CCP）进行干预。衰老小鼠表现出显著的肾功能损伤，表现为尿蛋白、血清尿酸和肌酐水平升高（图2B-D）。维生素E和CCP干预均能减轻上述异常。SA-β-半乳糖苷酶染色显示，CCP处理小鼠的肾脏细胞衰老程度降低，其效果与维生素E组相当（图2E）。
肾组织的H&E染色显示，对照组小鼠的肾小管结构保持完整，细胞形态正常（图3A、D）。相比之下，D-半乳糖组出现肾小管扩张、细胞肿胀以及炎性细胞浸润。Masson三色染色显示该组胶原沉积增加（图3B、E）。维生素E或CCP处理可减轻这些病理改变，并缓解纤维化。此外，CCP和维生素E均能减少肾组织中活性...
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本研究证实了虫草多糖对肾小管上皮细胞的保护作用，并提供了证据表明其通过调控ROS/MAPK/NF-κB/NLRP3信号通路减轻HK-2细胞的炎症性衰老。这些发现进一步阐明了 Cordyceps sinensis来源化合物在治疗急性和慢性肾脏疾病中的潜在作用机制，为未来抗衰老治疗策略的研究提供了参考。
细胞衰老是一种复杂的生物学过程，也是影响多个器官的退行性疾病的重要诱因1。肾脏特别容易受到与衰老相关的损伤，这种损伤伴随着进行性功能下降和特征性的组织学改变。肾衰老（RS）与慢性肾脏病（CKD）密切相关，在CKD的不同阶段均观察到加速衰老的现象，导致衰老细胞在肾组织中积聚19。越来越多的证据表明，肾小管上皮细胞（RTECs）的衰老在肾脏老化过程中起着关键作用，并促进肾纤维化的发展9
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作者声明无利益冲突。
本研究由国家自然科学基金（编号：8217150545，82575032）资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Caspase-1/活化型 兔多克隆抗体 | WL03450 | 中国沈阳 | |
| CCK-8试剂盒 | C0037 | 碧云天，上海，中国 | |
| CCP | B21296 | 中国沈阳，源野生物 | |
| 肌酐检测试剂盒 | C011-2-1 | 中国江苏南京 Jiancheng | |
| D-半乳糖 | HY-N0210 | 美国MCE | |
| ERK 兔多克隆抗体 | 4695 | 美国 CST | AB_390779 |
| gapdh 兔多克隆抗体 | ac033 | Abclonal，中国武汉 | |
| H & E 染色试剂盒 | G1120 | Solarbio，北京，中国 | |
| JC-1试剂盒 | C2003S | Biyotime，上海，中国 | |
| Masson染色试剂盒 | G1340 | Solarbio，北京，中国 | |
| NLRP3 兔多克隆抗体 | WLH3383 | 中国台湾，Wanlei，Shengyang | |
| P21 兔多克隆抗体 | 64016s | CST，美国 | AB_2892063 |
| p38 兔多克隆抗体 | 9212 | CST，美国 | AB_330713 |
| p50 兔多克隆抗体 | 3035 | CST，美国 | AB_330564 |
| p65 兔多克隆抗体 | 8242 | CST，美国 | AB_10859369 |
| p-ERK 兔多克隆抗体 | 4370 | CST，美国 | AB_2315112 |
| 磷酸化 SAPK/JNK 单克隆抗体 | 4668 | CST，美国 | AB_823588 |
| p-p38 兔多克隆抗体 | 4511 | CST，美国 | AB_2139682 |
| ROS染色试剂盒 | S0033S | 中国上海碧云天生物技术有限公司 | |
| SAPK/JNK 抗体 | 9256 | CST，美国 | AB_2250373 |
| SA-β-gal试剂盒 | C0602 | Biyotime，中国上海 | |
| 尿酸检测试剂盒 | C012-2-1 | 中国南京 Jiancheng | |
| 尿蛋白检测试剂盒 | C035-2-1 | 中国南京 Jiancheng | |
| 维生素E | S27812 | 中国沈阳，源野生物 | |
| <强>PCR引物 | |||
| 基因名称 | 上游引物 | 反向引物 | |
| Caspase-1 | 5’-TACAGACAAGGGTGCTGAACAA-3’ | 5’-CGGAATAACGGAGTCAATCAAA-3’ | |
| GAPDH | 5’-AGAAGGTGGTGAAGCAGGCGTC-3’ | 5’-AAAGGTGGAGGAGTGGGTGTCG-3’ | |
| NLRP3 | 5’-GATCTTCGCTGCGATCAACAG-3’ | 5’-CGTGCATTATCTGAACCCCAC-3’ |
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