一种用于同时检测基孔肯雅、登革热和寨卡病毒感染的即时检测三重PCR平台

摘要

本文推荐一种完全自动化的集成系统，该系统采用三重PCR技术，利用单一样本同时诊断基孔肯雅热、登革热和寨卡病毒的共感染，从而优化临床和基层医疗实验室的检测效率。

摘要

基孔肯雅热（CHIKF）是一种由蚊子传播的急性病毒性疾病，于1952年在坦桑尼亚首次发现，近年来在中国呈间歇性传播，并出现越来越多的本地暴发疫情。截至2025年7月，作为当前疫情中心的广东省已报告本地病例4,824例，其中仅一周内新增感染病例近3,000例。疫情的迅速蔓延迫切需要先进的诊断技术，此类工具对于支持一线防控工作至关重要。我们提出一种可快速同步检测登革病毒（DENV）、基孔肯雅病毒（CHIKV）和寨卡病毒（ZIKV）感染的解决方案，以提升早期疫情预防与控制能力。该方法包括为边境口岸和基层医疗机构开发定制化的检测流程。

在共感染情况下，传统的CHIKV和DENV诊断方法通常缺乏足够的灵敏度和特异性。由于CHIKV、DENV和ZIKV具有相似的传播模式和临床症状，对其进行同步监测至关重要。本实验方案介绍了一种基于TaqMan探针的三重qPCR方法，可在单管反应中于90分钟内同时检测这三种虫媒病毒。与病毒培养和血清学检测相比，该方法通过高特异性地识别活动性感染和共感染状态，提高了检测效率，同时简化了操作流程，并无需特殊仪器设备。

使用临床样本和外部质量评估（EQA）样本进行验证，结果与金标准单重检测方法的符合率达到100%。该方法可作为监测地方性流行区域发热性疾病的有效工具，特别是在资源有限、需快速控制疫情暴发的地区。

引言

基孔肯雅热（CHIKF）是一种日益流行的虫媒病毒性疾病，主要通过埃及伊蚊（Aedes aegypti）和白纹伊蚊（Aedes albopictus）传播。该疾病在热带地区反复暴发，临床表现为急性发热性疾病，常伴有严重关节痛和持续性关节炎¹。截至7月26日，中国广东省佛山市累计报告实验室确诊的基孔肯雅热病例达4,824例，其中87.2%的病例集中在顺德区。这种显著的地理聚集性给区域公共卫生系统带来了巨大负担，并导致高昂的医疗支出以及更广泛的宏观经济挑战²。

在CHIKV、DENV和ZIKV病毒传播范围日益重叠的背景下，当前的诊断方法面临三个主要局限性。首先，血清学检测无法区分急性感染，因为在病毒清除后抗体可长期持续存在¹。其次，病毒培养技术灵敏度较低，且需要数天时间，从而阻碍了及时的临床决策。第三，尽管定量PCR检测具有高特异性（超过95%），但其无法在单次反应中检测共感染，而这一缺陷尤为突出，因为在印度报告的CHIKV-DENV共感染率高达12.8%³。系统发育监测表明，流行病学模式正在发生转变。在印度2019–2022年疫情中占主导地位的ECSA谱系，其包膜蛋白已获得趋同突变：E1-A226V（增强蚊媒感染性）和E2-K252Q（与免疫逃逸相关）。这些突变导致出现了一种毒力更强的基因型....

方案

本研究遵循中国广州南方医科大学广东省人民医院伦理委员会制定的伦理指南（批准号：KY2025-510-01）。有关本研究中所用材料（试剂、化学品、设备和软件）的详细信息，请参见材料表。

1. 受试者选择

1. 选择年龄在18至60岁之间的受试者。
2. 选择在症状出现后12天内出现急性发热性疾病（腋下体温 ≥ 38 °C），并伴有皮疹、关节痛或颈部淋巴结病，且近期曾前往基孔肯雅热流行地区的受试者；或具有相同旅行史的无症状个体。
3. 排除标准：7天内使用过抗菌或抗病毒药物，或发热疾病可明确归因于确诊的HIV感染或恶性肿瘤者。

2. 样品采集与处理

1. 检查采样盒的外包装是否破损且未过期，然后取出内部材料。
2. 让受试者手臂伸展。确定肘正中静脉，绑扎止血带，并用70%酒精棉片消毒穿刺部位。
3. 使用不含抗凝剂的采血管，从受试者肘前静脉采集1~3 mL血液。
4. 轻轻将采血管倒置5~8次，于室温静置30分钟，使其充分凝固。
5. 将血液样本在4 °C下以1000 × g 离心10分钟。离心后获得的血清样本可立即进行检测。
6. 小心地将上清液血清分装至无菌微量离心管中。血清应立即用于检测，或分装后于-80 °C保存，用于后....

结果

为验证三重PCR检测系统的稳定性和准确性，我们从本实验室选取了五份具有临床代表性的样本，并选取了十份外部EQA盲样进行验证。这五份代表性临床样本包括阴性和阳性病例（S1-S5），其中包含CHIKV和DENV阳性样本，用于展示该检测方法的临床适用性，并支持对检测性能的内部验证（表1）。2025年针对新发蚊媒病原体的EQA盲样样本集包含10份灭活血浆样本（DZC2511-2520），其中含有不同浓度和组合的CHIKV、DENV和ZIKV，其浓度和组合由国家临检中心（NCCL）预先确定。使用本研究的三重qPCR平台对该样本集进行分析，结果与参考结果完全一致（表2），证实了该检测方法的稳健性和临床适用性。

三重qPCR检测在所有验证样本中均能可靠地区分阴性和阳性感染（图1）。在临床队列中，该检测鉴定出两个样本（S2、S3）为基孔肯雅病毒（CHIKV）阳性，一个样本（S5）为登革病毒（DENV）阳性，而样本S1和S4对三种检测靶标均为阴性（

讨论

CHIKV 是一种正义单链 RNA 病毒，属于披膜病毒科（Togaviridae）甲病毒属（alphavirus）⁷。全球气候变暖加速、国际贸易加剧以及旅游网络的扩展，共同增加了人类暴露于虫媒病毒威胁的风险⁸。在过去十年中，分子诊断技术的快速发展从根本上改变了传染病管理的格局。在这些技术中，实时荧光定量 PCR（qPCR）因其检测周期短、分析灵敏度极高、定量准确性高以及在常规操作中显著降低交叉污染风险，已在中国各地的临床实验室中获得广泛应用²。通过将单次采血与可同时检测 CHIKV、DENV 和 ZIKV 的三重 qPCR 平台相结合，我们现在能够在同一分析窗口内筛查单一感染和共感染情况。这一简化的检测流程为临床医生提供了可操作的实验室证据，有助于支持早期、精准且果断的公共卫生干预措施。

本研究通过将三重qPCR整合到一个完全自动化、封闭式反应管平台中，推动了虫媒病毒诊断技术的发展，该平台专为现场即时检测而优化。与需要专用设备的常规多重PC.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
自动化核酸提取仪	DAAN	Smart 32	用于DNA提取
BECKMAN X-12	BECKMAN	ALA04H01	用于  血清离心
BSC-1500IIA2-X	BIOBASE	SEDA 20143222263	生物安全柜
E-Centrifuge	WEALTEC		离心去除管壁残留液体
全自动医用PCR分析仪	Bioustar‌	UP0102	荧光定量PCR扩增
基孔肯雅病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）	DAAN	20250804	检测  基孔肯雅病毒基因
登革病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）	DAAN	202504003	检测  登革病毒基因
登革病毒、寨卡病毒和基孔肯雅病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）	Bioustar‌	20250724	检测  登革病毒、寨卡病毒和基孔肯雅病毒基因
寨卡病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）	DAAN	202508041	检测寨卡病毒  基因
核酸提取试剂盒	DAAN		提取核酸
SLAN 全自动医用PCR分析系统	HONGSHI		数据分析
SLAN-96S 实时荧光定量PCR仪	HONGSHI	SLAN-96S	荧光定量PCR扩增
超低温冰箱（DW-YL450）	MELING	SEDA 20172220091	-20 °C 用于试剂储存
Vortex-5	Kylin-bell		用于试剂混匀