一个用于同时检测基孔肯雅、登革热和寨卡病毒感染的三重PCR现场护理平台

摘要

本文建议采用全自动综合系统，利用三重PCR技术，利用单一样本同时诊断基孔肯雅、登革热和寨卡病毒的共感染，从而优化临床和初级护理实验室的检测效率。

摘要

基孔肯热（CHIKF）是一种由蚊子传播的急性病毒病，最早于1952年在坦桑尼亚被发现，目前在中国传播时断续续，局部疫情也日益加剧。截至2025年7月，目前疫情中心的广东省报告了4824例本地病例，其中一周内新增近3000例。这一快速激增带来了对先进诊断技术的紧迫需求。这些工具对于支持前线遏制工作至关重要。我们提出了一种解决方案，能够快速同时检测登革热（DENV）、基孔肯雅热（CHIKV）和寨卡病毒（ZIKV）感染，以增强早期流行预防和控制能力。该方法涉及为边境检查站和初级医疗机构制定定制化检测方案。

传统诊断方法在共感染病例中通常缺乏敏感性和特异性。由于CHIKV、DENV和ZIKV具有相似的传播模式和症状，同时监测至关重要。该方案采用三重qPCR方法，利用TaqMan探针在90分钟内在单管内检测这些虫媒病毒。与病毒培养和血清学检测相比，该方法通过高特异性识别活跃感染和共感染，提升效率，同时简化工作流程并消除对专业设备的需求。

临床和外部质量评估（EQA）样本验证结果与金标准单复合测定法100%一致。该方法是监测流行地区发热病的有效工具，尤其是在资源有限、快速遏制疫情至关重要的地区。

引言

基孔肯雅热（CHIKF）是一种日益常见的节肢病毒疾病，主要由蚊媒介埃及伊蚊和白毛蚊传播。该病以热带地区反复爆发为特征，临床表现为急性发热性疾病，常伴有剧烈关节疼痛和^{持续性关节}炎1。截至7月26日，佛山市累计实验室确诊的基孔肯雅热病例已达4,824例，其中87.2%发生在顺德区，比例高达87.2%。这种显著的地理集中给区域公共卫生基础设施带来了重大负担，导致了显著的医疗成本以及更广泛的宏观经济挑战².

在CHIKV、DENV和ZIKV病毒日益重叠的流行背景下，当前的诊断方法面临三大主要局限。首先，由于病毒清除后抗体持续时间较长，血清学检测无法区分急性感染^1。其次，病毒培养技术的敏感性较低，需要数天时间，从而阻碍临床决策的及时进行。第三，尽管定量PCR检测显示出高特异性（超过95%），但无法在单一反应中检测共感染，这在印度报告的CHIKV-DENV共感染率为12.8%的情况下是一个显著^缺陷3。系统发育监测显示出范式转变。ECSA谱系在印度2019-2022年流行期间占主导地位，其包膜蛋白中出现了趋同突变：E1-A226V（增强蚊子感染力）和E2-K252Q（与免疫逃避相关）。这些突变导致基因型具有更高的毒力，正如喀拉拉邦和马哈拉施特拉邦3区最新监测研究所^{报道的那样}。与此同时，中国面临云南疫情中ECSA基因型的输入及其他基因型的挑战，包括云南^四省在内的多个省份均有本土传播报告。

这些现实带来了紧迫且资源有限的需求：（i） 尽管临床表现重叠，仍需鉴别诊断⁵，（ii） 消除传统实时定量PCR（^qPCR）通常需要的复杂仪器的诊断检测6，以及（iii） 对包括RT-LAMP和基于CRISPR的方法在内的新型现场护理技术的全面验证⁵.为应对这些诊断挑战，我们提出了一种采用全自动集成系统的快速三重PCR检测法，实现单次反应中同时检测CHIKV、DENV和ZIKV。我们通过与作为参考标准的既有单复合^测定5直接对比，验证了三重qPCR检测的表现。以下章节详细介绍了三重测定和参考单复用试测的作流程。两种方法的结果比较分析见代表性结果部分。

方案

本研究遵循广东省人民医院南方医科大学伦理委员会制定的伦理准则（批准号：KY2025-510-01）。关于本研究所用材料（试剂、化学品、设备和软件）的详细信息，可见 材料表。

1. 参与者选拔

1. 选择年龄在18至60岁之间的参与者。
2. 选择在症状出现后12天内出现急性发热性疾病（腋窝睾酮≥38°C）且有皮疹、关节痛或颈淋巴结肿大，且近期曾前往基孔肯雅热流行区的参与者;或者是旅行史完全相同的无症状个体。
3. 排除：7天内使用抗菌/抗病毒药物或因确诊HIV或恶性肿瘤而发热的疾病。

2. 样本采集与处理

1. 检查样品盒的外包装是否受损且未过期，然后取出内部材料。
2. 将受试者伸出手臂。识别肘中静脉，使用止血带，并用70%酒精棉签消毒静脉穿刺部位。
3. 使用无抗凝剂的血液收集管，从受试者肘前静脉采集1~3毫升血液。
4. 轻轻倒置管子5-8次，让它在室温下凝固30分钟。
5. 将血样在4°C、1000 x g 离心机上离心10分钟。离心后获得的血清样本可以立即检测。
6. 小心地将上清液注入无菌微离心管中。立即使用血清进行检测，或将药膏保存在-80°C，直到通过qPCR进一步分析病原体核酸。

3. 自动三重qPCR检测CHIKV、DENV和ZIKV

1. 试剂和管子制备
   1. 从储存中取出所有所需试剂，并在室温下解冻。
   2. 目视检查每个密封的TD检测管是否有损坏或密封失效。丢弃所有受损的管子。
   3. 短暂对TD核酸提取缓冲液进行5秒的涡旋，以确保均匀性。
   4. 无菌方式将500微升均质缓冲液注入TD提取试剂管（内含紫色冻干磁珠）。
   5. 对混合物进行剧烈涡旋，持续30秒，直到所有成分完全溶解，珠子完全重新悬浮。
   6. 将整个复原溶液转移到预先标记的TD检测管中。
2. 样品加载
   1. 将200微升透明、非溶血、无脂肿血清移液管。
   2. 密封管子，倒置十次以均匀混合。
      注意：倒置时，允许石蜡层短暂漂浮在管内。这是流程中的正常部分。
3. 仪器作与数据采集
   1. 将密封的检测管插入分析仪指定的槽位。
   2. 在触摸屏界面上输入样本识别信息。
   3. 按下 Start 检测 按钮即可启动全自动化的闭管工作流程。
      注意：系统将自动执行条码扫描、 通过 磁珠捕获提取核酸以及荧光PCR扩增，无需用户进一步干预。标准程序包括在95°C下进行3分钟的变性步骤，随后进行40个放大循环。
4. 结果解释
   1. 运行结束后，在同一屏幕上观察三个目标（CHIKV、DENV、ZIKV）和内部控制的放大结果。
   2. 在每个目标病原体的荧光通道中记录自动生成的读数，分别为“阳性”、“阴性”或“无效”。
      注意：系统内部软件使用37.0的周期阈值（Ct）进行自动解读。无需人工数据分析。

4. 参考单复用qPCR方法比较法

1. 核酸提取试剂的制备
   1. 从套件中取出预包装的96孔板。轻轻敲击96孔板，使试剂和磁珠全部集中到96孔板底部。小心撕下铝箔密封膜，避免96孔板振动，防止液体溅出。
   2. 在96孔板的第1和第7柱中，先加入20微升蛋白酶K，随后加入200~300微升待提取样品。
   3. 自动核酸提取（基于磁珠的方法）
      1. 预包装的96孔板（含样品）被放置在自动核酸提取系统的相应槽位中。
      2. 核酸提取过程如下：在实验室腔体内使用磁棒吸附核酸结合的磁珠。将珠状物转移到下一个指定的试剂孔。启动搅拌装置，通过快速反复搅拌，将液体与磁珠彻底混合。让自动核酸提取器自动执行后续步骤：i） 细胞裂解：25°C下10分钟。ii）核酸吸附：70°C下15分钟，磁吸附3次。iii）洗涤：混合2分钟（重复3次），随后磁吸附两次（每次15秒）。iv）洗脱：进行两次（每次5分钟），磁吸附进行3次。最终，获得高纯度核酸。
   4. 为立即检测，直接抽吸第6和第12柱含核酸的洗溶液。长期储存时，将剩余核酸样品转移到-20°C。
2. 扩增试剂的制备
   注意：对于单plex PCR反应，需准备三条不同的PCR管，使用三种不同的酶和三种对应的反应混合物。试剂的制备分为三个独立步骤。由于制备步骤相似，我们仅在下面演示CHIKV检测试剂的制备步骤。
   1. 从试剂盒中取出核酸扩增反应溶液和CHIKV反应溶液（CHIKV特异引子/探针）。解冻后，将豆子置于22~25°C的环境中，通过剧烈摇晃彻底混合，然后进行短暂离心（1000 x g，15秒，22~25°C）。
   2. 将反应总数计算为N+2（其中N=测试样本数，+2=一个阴性和一个阳性质量控制）。在合适尺寸的微离心管中，将每种反应的主混合物混合：17微升核酸扩增反应溶液（含缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、UDG酶）、3微升CHIKV反应溶液（含引物、CHIKV目标基因探针和IC）。彻底使用Vortex主混音，确保完全混合。在室温（22~25°C）下，以10,000 x g 的压力短暂离心15秒，收集底部的溶液。将20微升主混合液注入每个PCR反应管。
   3. 添加核酸和质量控制样品：分别将5微升来自正对照和阴性对照样本的核酸加入上述PCR反应管（20微升），最终每管25微升;紧密封盖管子，进行瞬时离心（1000 x g，15秒，22~25°C），然后将管子放入PCR仪器。
3. PCR扩增
   1. 设置循环程序如下：预变性：50°C15分钟，然后95°C15分钟（两步合计1个周期）;以下两步，40个周期：94°C变性15秒，55°C退火45秒。
   2. 将荧光信号检测参数设置如下：CHIKV基因的FAM荧光标记;作为试剂盒内部对照的IC基因进行VIC荧光标记。在55°C下收集数据。 反应完成后，确保数据保存以备后续分析。
   3. 使用qPCR专用软件分析数据
      1. 样品信息：在软件的孔板布局图中，标注对应样品装载位置的样品类型（如正对照、负对照、未知样品、内部参考基因等）。
      2. 放置反应管：打开仪器加热模块的盖子，将密封的PCR板/管子稳稳放入内，确保它们与加热模块紧密配合，并紧闭模块盖子（以避免温度不均）
      3. 启动反应：确认软件中的程序设置正确后，点击 开始运行 并记录实验编号以便日后参考。
      4. 停止运行并移除管子：程序完成后，等待加热模块温度降至50°C以下。 然后打开盖子，小心取出PCR板或管子。根据需要进行下游分析或样本存储。
      5. 数据分析 在进行分析前，确认：i） 所有样品和内部对照的放大曲线具有特征性的S形;ii） 荧光阈值设定在指数相内，产生38个周期≤Ct值（CV<5%）;三）控制结果有效，显示无污染。如果有任何条件未满足或样品出现异常放大（例如非典型曲线或临界范围Ct），应相应重新检查整个批次或具体样本。
      6. 使用软件处理原始数据以确定Ct值，使用自动选择的阈值;如果样品的Ct<38且其放大曲线呈S形，则该样品被视为正。

5. 生物安全与废弃物处理

1. 将所有材料转移到指定的抗穿刺生物危害容器中，并通过高压灭菌消毒后，通过机构医疗废弃物系统进行最终处置。立即将这些材料转移到标注为高风险废物的防漏、防刺破生物危害容器中。按照机构指南，通过高压灭菌（例如121°C，30分钟）对所有含有扩增产物的废物进行去污，以灭活病原体并降解核酸。最后，通过指定的医疗废物管理系统处理消毒废物。
   注意：所有步骤均遵循生物安全二级（BSL-2）规范，使用适当的个人防护装备以降低暴露风险。

结果

为验证三重PCR检测系统的稳定性和准确性，我们从内部实验室选取五个具有临床代表性的样本，并从外部EQA盲检样本进行验证。这五个具有代表性的临床样本包括阴性和阳性病例（S1-S5），包括CHIKV和DENV阳性样本，旨在展示该检测的临床适用性并支持检测性能的内部验证（见表1）。2025年EQA针对新兴蚊媒病原体的盲样本面板包含10份灭活血浆样本（DZC2511-2520）。这些产品含有CHIKV、DENV和ZIKV的各种浓度和组合。这些浓度和组合均由NCCL预先确定。使用我们的三重qPCR平台分析该组合与参考结果完全一致（见表2），确认了该检测的稳健性和临床适用性。

三重qPCR检测法在所有验证样本中可靠区分阴性和阳性感染（见图1）。在临床队列中，检测结果发现两个样本（S2、S3）CHIKV阳性，一个样本（S5）为DENV，而S1和S4样本对三个靶点均为阴性（见图2， 表1

讨论

CHIKV是一种正向单链RNA病毒，归类于托加维里德科的α病毒^属7。加速的全球变暖、国际贸易的加强以及旅游网络的扩展共同增加了人类接触虫媒病毒威胁的风险⁸.在过去十年中，分子诊断的快速发展从根本上改变了传染病管理的格局。在这些技术中，qPCR因其快速的周转速度、卓越的分析灵敏度、高的定量准确性以及在^常规作中显著降低交叉污染风险而在中国各地的临床实验室中尤为突出。通过将单次抽血与三重qPCR平台整合，同时检测CHIKV、DENV和ZIKV，我们现在可以在单一分析窗口内筛查单一感染和共感染。这种简化的工作流程为临床医生提供了可作的实验室证据，支持早期、精准且果断的公共卫生干预措施。

本研究通过将三重qPCR整合进一个全自动化、闭式管子平台，优化了现场使用，推动了病毒病毒诊断的发展。与传统的多重PCR需要^{专业设备9、}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
自动核酸提取机	达安	聪明32岁	用于DNA提取
贝克曼 X-12	贝克曼	ALA04H01	支持并注注;血清离心
BSC-1500IIA2-X	生物基地	SEDA的，20143222263	生物安全柜
电子离心机	威尔泰克		用离心法将管壁上的残留液体分离
全自动医用PCR分析仪	Bioustar‌	UP0102	荧光定量PCR扩增
基孔肯雅病毒核酸检测试剂盒（PCR荧光探针法）	DAAN	20250804	检测 基孔肯雅病毒基因
登革热病毒核酸检测试剂盒（PCR荧光探针法）	DAAN	202504003	检测 登革热病毒基因
登革热病毒、寨卡病毒和基孔肯雅病毒核酸检测试剂盒（PCR荧光探针法）	Bioustar‌	20250724	检测 登革热病毒、寨卡病毒和基孔肯雅病毒基因
寨卡病毒核酸检测试剂盒（PCR荧光探针法）	DAAN	202508041	寨卡病毒的检测及nbsp;基因
核酸提取套件	达安		提取核酸
SLAN 全自动医疗PCR分析系统	洪石		数据分析
SLAN-96S 实时 PCR 机器	洪石	SLAN-96S	荧光定量PCR扩增
超低温冷冻柜（DW-YL450）	梅林	SEDA的发20172220091	-20 & deg;C 代表储存试剂
涡旋-5	凯林钟		用于混合试剂