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从新生、幼年及成年小鼠肺组织中分离肺泡II型上皮细胞并适用于感染性实验条件

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DOI：

10.3791/69581

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2025年12月19日

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1Infection Immunology Research Group, Institute of Medical Microbiology and Hospital Hygiene, Health Campus Immunology, Infectiology and Inflammation, Otto-von-Guericke University Magdeburg, 2Immune Regulation Research Group, Helmholtz Centre for Infection Research, 3Flow Cytometry and Cell Sorting Platform, Helmholtz Centre for Infection Research, 4Experimental Immunology Department, Helmholtz Centre for Infection Research

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案介绍了一种基于流式细胞术的方法，用于从新生、幼年或成年小鼠肺组织（感染或未感染）中分离出有活力的肺泡Ⅱ型上皮细胞（AECII）。该方法可支持后续对AECII进行分子水平和/或功能研究，以明确其在肺部炎症与感染过程中的作用。

摘要

肺泡II型上皮细胞（AECII）在肺部免疫调节中发挥关键作用，因此是协调肺部稳态的核心组分。这些功能使得AECII在呼吸道病毒感染背景下尤为重要，因为此类病毒靶向下呼吸道上皮并破坏肺泡完整性。临床前小鼠模型是阐明AECII在肺部炎症和/或感染中作用的重要工具。本方案提供了一种详细且可重复的技术流程，用于从新生期、幼年期和成年期小鼠肺组织中分离出活性高、纯度高的AECII。该方法结合机械解离、酶消化以及后续的荧光激活细胞分选（FACS），可获得高度富集的AECII群体，已证实适用于下游的分子和功能分析。对于涉及病原性病毒的应用，本方案包含一个可选的多聚甲醛（PFA）固定步骤，可在较低生物安全等级条件下安全操作，同时不损害RNA完整性。该方案在不同发育阶段均实现了优化的细胞回收率，每只成年小鼠肺可获得高达1.0 × 106个AECII细胞，支持针对病毒致病机制、上皮功能及再生能力等领域的临床前研究。

引言

由于肺泡Ⅱ型上皮细胞（AECII）在肺发育、生理功能、免疫及修复过程中具有多重作用，其在维持肺稳态以及肺损伤后重建稳态中发挥着至关重要的作用。由于AECII是流感病毒A型（IAV）或SARS-CoV-2等大流行病毒的主要细胞靶标，其命运与功能已成为感染生物学研究的重点。在此背景下，先前的研究报道了内在因素（例如., 遗传状态1年龄2,3）以及外在因素（例如，微生物刺激）4）信号对AECII表型及其对空气传播病原体等环境刺激的反应性具有重要影响。值得注意的是，肺部炎症已被证明可导致AECII转录组、蛋白质组和表观遗传状态的持续性改变5,6肺部AECII细胞间的复杂相互作用，以及各种生物和非生物因素对AECII生物学功能的影响，凸显了选择合适模型系统研究其生理与病理机制的重要性。 体内 可对这些细胞进行更详细研究的模型。

FACS 是目前从人和动物组织中富集和纯化原代细胞的金标准技术，因为它能够同时实现多参数的选择（或排除），并且是唯一可将细胞内在特性（如大小、颗粒度或自发荧光）可靠地整合到选择/排除流程中的方法。迄今为止，已有少数已发表的方案提供了基于 FACS 分离原代小鼠 AECII 的方法。Sinha 和 Lowell 报道了一种从成年小鼠分离 AECII 的方法，其组织处理和流式细胞术流程相似，并在 FACS 前通过磁珠法对非靶细胞进行耗竭以富集 AECII7。另一项方案描述了使用磁珠法分离肺中 EpCAM 阳性细胞，或利用转基因小鼠，通过条件性报告小鼠模型鉴定 SPC 阳性（GFP+）细胞，从而实现基于 FACS 的 AECII 分离8。尽管 SPC 表达能够可靠地鉴定小鼠肺中的 AECII，但该方法仅适用于特定的报告小鼠品系，因此无法用于例如野生型小鼠的 AECII 分离。重要的是，尽管这些方案报告了相似的 AECII 产量和纯度，但均未提供适用于从新生、幼年或感染宿主中分离 AECII 的优化步骤。

为此，本实验方案包含一套经过优化的工作流程，用于通过酶消化联合荧光激活细胞分选（FACS）技术从小鼠中分离高纯度且具有活性的Ⅱ型肺泡上皮细胞（AECII）。该先进技术基于先前建立的基于FACS的AECII分离方案。9 并包含重要的优化步骤，通过增加额外的鉴定和排除标记物，提高了AECII的纯度。重要的是，该更新后的方案实现了AECII的回收获取 通过 “接触式”和“非接触式”两种分选策略。此外，由于出生后肺部发育伴随着细胞组成和结构重塑的重大变化，本方案包含针对新生儿、幼年及成年肺组织优化AECII分离的调整步骤。这使得研究者能够在个体发育过程中探究AECII的生物学特性，例如在肺成熟或感染生物学研究背景下。该方法可用于获取具有活性的AECII，以用于后续实验 离体 培养及流感病毒（IAV）感染。此外，本方案包含使用化学固定剂多聚甲醛（PFA）进行固定的步骤。该步骤可有效灭活肺细胞悬液中的多种呼吸道病原体（如SARS-CoV-2、IAV），从而允许后续样本操作（包括基于FACS的AECII分离）在生物安全等级较低的设施中进行。然而，基于PFA的固定会限制后续AECII 离体 用于功能研究时，该方法可获得大量完整的RNA，用于肺泡Ⅱ型上皮细胞的转录组分析，以阐明其在呼吸道感染背景下的生物学作用。

方案

所有动物均在德国感染研究中心的动物设施中培育和饲养，饲养条件为无特定病原体（SPF）环境，并遵循国家和机构的指导原则。对未处理小鼠实施安乐死以进行后续AECII分离的操作，均依照实验动物科学学会（GV-SOLAS，Gesellschaft für Versuchstierkunde）的国家指南进行。实验使用C57BL/6遗传背景的雄性小鼠，年龄分别为2天（新生期）、3周（青春期）或8–12周（成年期）。所用试剂和设备列于材料表中。

1. 小鼠肺组织的制备

  1. 处死小鼠（遵循机构批准的实验方案）：
    1. 对于 成年 和 幼年期 小鼠：给予过量麻醉剂（例如，氯胺酮/赛拉嗪） 通过 腹腔注射
    2. 对于 新生儿 小鼠：断头处死。
      注意：避免对成年和幼年小鼠采用颈椎脱臼法，因为该操作可能损伤气管。
  2. 用70%（v/v）乙醇对小鼠皮毛进行消毒。
    警告：易燃液体。对眼睛有刺激性。远离热源。容器应严格密闭，并做腹侧正中切口以暴露内脏器官。
  3. 小心地去除皮肤和腹膜。
  4. 通过切断小鼠双侧颈静脉和下腔静脉进行放血，使血液从体内流出。
  5. 小心地移除膈肌以暴露心脏和肺。
    注意：务必避免损伤肺组织，肺组织穿孔将显著影响后续酶消化肺组织的效率。
  6. 使用剪刀打开胸腔。
  7. 将套管插入心脏右心室，用冰冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）灌注，直至肺部残留血液被清除，肺组织变为苍白：
    1. 对于 成年 小鼠：使用26 G套管，用10 mL PBS灌注肺部。
    2. 对于 新生儿 小鼠：使用30 G套管，用1 mL PBS灌注肺部。
      注意：不要灌注肺部的 幼年期 小鼠以避免肺血管内压力过高导致肺泡结构破裂。在炎症肺组织中，灌注效果可能较差，肺组织的颜色变化也可能不那么明显。如有需要，可在成年和幼年小鼠中于下一步操作前进行支气管肺泡灌洗。

2. 肺组织的酶消化

  1. 成年和幼年小鼠：
    1. 通过去除唾液腺及周围肌肉暴露气管。
    2. 将一根22 G的留置套管插入气管，取出针芯，并将塑料导管向肺部方向推进。
    3. 用一段纱线将气管和导管一起牢固结扎，以固定其位置。
    4. 通过插入气管的导管灌注dispase以制备肺组织：
      警告：吸入后可能引起过敏、哮喘症状或呼吸困难。避免吸入粉尘。佩戴呼吸防护装置。将内容物/容器处置于经批准的废弃物处理厂。）
      1. 对于成年小鼠：注入2 mL dispase。
      2. 对于幼年小鼠：注入500 µL dispase。
        注意：建议使用鲁尔滑动接头的注射器，以便在步骤2.1.4和2.1.5之间更换注射器。为确保肺组织有效酶解，必须保证支气管肺泡腔完全充满酶液。
    5. 更换注射器，随后灌注低熔点琼脂糖（1% (w/v)，45 °C），以维持组织在后续处理过程中的结构完整性。
      1. 对于成年小鼠：使用500 µL低熔点琼脂糖。
      2. 对于幼年小鼠：使用200 µL低熔点琼脂糖。
        注意：为防止液体回流，请保持注射器连接状态。
        注意：使用前需加热溶解低熔点琼脂糖（95 °C），然后将琼脂糖溶液冷却至45 °C，例如置于恒温金属块中。
    6. 用实验室纸巾覆盖肺组织，并加入冰块，使琼脂糖在2分钟内凝固。
    7. 移除冰块、纸巾、注射器和导管。
    8. 将纱线打结以闭合气管，防止酶液从下呼吸道漏出。
    9. 去除心脏和胸腺。
    10. 在纱线上方剪断气管，并完整取出胸腔内的肺组织。
    11. 将肺组织转移至含有预热dispase（37 °C）的15 mL离心管中，在室温（20–25 °C）下孵育45分钟。
      1. 对于成年小鼠：在2 mL dispase中孵育肺组织。
      2. 对于幼年小鼠：在1.5 mL dispase中孵育肺组织。
  2. 新生小鼠
    1. 使用精细剪刀在2 mL离心管盖内收集并剪碎单个肺叶。
    2. 加入500 µL dispase，盖上管盖，并轻轻翻转管子，确保组织完全浸没在dispase中。
    3. 在室温下将肺组织在dispase中孵育45分钟。

3. 肺组织的制备

  1. 适用于成年及幼年小鼠：
    1. 从dispase中取出肺组织，并将肺叶从支气管主干上解剖下来。
    2. 将肺叶放入一个培养皿（直径：8.5 cm）中，内含7 mL DMEM + HEPES、1 µg/mL（终浓度）抗-CD16/32封闭抗体和100 µL DNA酶（终浓度约600 Kunitz单位）。
      警告：吸入后可能引起过敏、哮喘症状或呼吸困难。避免吸入粉尘。佩戴呼吸防护装置。将内容物/容器送至批准的废物处理厂处置。
    3. 使用镊子将肺组织充分分散解离。
      注意：为确保肺组织有效进行酶消化，必须彻底完成机械性组织解离。
    4. 室温下轻轻振荡（200 rpm）孵育10分钟。
      注意：如需暂停操作，细胞悬液可暂时保存于4 °C。
  2. 适用于新生小鼠：
    1. 将含有已消化组织的dispase转移至一个培养皿（直径：5.4 cm）中，内含3 mL DMEM + HEPES、1 µg/mL（终浓度）抗-CD16/32封闭抗体和100 µL DNA酶（终浓度约600 Kunitz单位）。
    2. 室温下轻轻振荡（200 rpm）孵育10分钟。
      注意：如需暂停操作，细胞悬液可暂时保存于4 °C。
  3. 所有年龄段小鼠均继续以下步骤：
    1. 将细胞悬液依次通过孔径递减的尼龙细胞筛（100 µm → 70 µm → 40 µm）过滤，以去除碎片和大块聚集体。
    2. 小心冲洗细胞筛和离心管，以尽量减少细胞损失。若需合并样本，同组小鼠的细胞悬液可使用同一套细胞筛进行过滤。
      注意：如发生堵塞，请更换新的细胞筛。
    3. 根据体积将过滤后的细胞悬液转移至一个或多个15 mL离心管中，在4 °C条件下以140 × g离心12分钟。
    4. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于红细胞裂解缓冲液（ACK缓冲液）中。
      1. 对于成年及幼年小鼠：加入2 mL红细胞裂解缓冲液，孵育2分钟。
      2. 对于新生小鼠：加入3 mL红细胞裂解缓冲液，孵育3分钟。
    5. 用DMEM + HEPES + 10%（v/v）FBS充满15 mL离心管以终止红细胞裂解反应，随后在4 °C条件下再次以140 × g离心12分钟。

4. 用于荧光激活细胞分选的抗体染色

  1. 将细胞重悬于抗体染色液中，该染色液含有与荧光染料偶联的抗 F4/80、抗 CD93、抗 CD11c、抗 CD19、抗 CD31、抗 CD11b、抗 CD16/32、抗 CD45、抗 CD24 和抗 CD326 抗体，并用 DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS 配制。
    注意：为获得最佳染色效果，请仅使用预先滴定好的抗体。若需保留 AECII 细胞用于后续细胞分选，则不应在抗体染色液中加入抗 CD326 抗体。
    1. 对于成年小鼠：每肺使用 600 µL 抗体溶液。
    2. 对于幼年小鼠：每肺使用 400 µL 抗体溶液。
    3. 对于新生小鼠：每肺使用 200 µL 抗体溶液。
  2. 将细胞悬液与抗体在 4 °C 避光条件下孵育 10 分钟。
  3. 孵育结束后，用 DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS 充满离心管以洗涤细胞。
  4. 在 4 °C 条件下，以 140 × g 离心 12 分钟。
  5. 将细胞重悬于 DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS 中：
    1. 对于成年小鼠：每肺重悬于 300 µL 溶液中。
    2. 对于幼年小鼠：每肺重悬于 200 µL 溶液中。
    3. 对于新生小鼠：每肺重悬于 100 µL 溶液中。

AECII 的分选

注意：仪器准备：使用流式细胞分选仪分选 AECII 时，安装 100 µm 喷嘴。

  1. 分选前，将细胞通过50 µm细胞筛过滤。用添加了HEPES和10% (v/v) FBS的DMEM冲洗细胞筛，以防止细胞过度丢失。
    1. 成年 小鼠：每个肺用 300 µL 冲洗细胞滤网。
    2. 幼年期 小鼠：用 200 µL 溶液冲洗每只肺的细胞滤网。
    3. 新生儿 小鼠：每个肺用100 µL冲洗细胞筛。
  2. 在分选前，通过涡旋振荡直接重悬细胞。
  3. 通过识别侧向散射（SSC）较高的事件来圈选AECII细胞门高），II）不表达谱系特异性荧光染料，以及III）表达与抗CD326抗体偶联的CD326荧光染料。
    注意：使用亮度指数高至极高的荧光染料（如 APC、PE 和 BV785），以利于区分非 AECII 与 AECII。若采用非接触式分选方法（在染色液中不加入抗 CD326 抗体），则 AECII 被鉴定为谱系标记阴性、SSC高 和自发荧光阳性/高 细胞。AECII的自发荧光可在绿色光检测器（如FITC或GFP检测器）中识别。
  4. 使用前向散射高度排除双联体或聚集体 与. 区域（FSC-H） 与. FSC-A）和侧向散射高度 与. 侧向散射面积（SSC-H） 与. 侧向散射-面积 (SSC-A)。
  5. 将分选后的细胞收集到含有添加了 HEPES 和 10% (v/v) FBS 的 DMEM 的离心管中，离心后用于进一步分析或培养。

6. 从多聚甲醛固定的AECII中提取RNA（可选）

注意：如果需要从感染了呼吸道病毒病原体等病原体的小鼠中分离 AECII，则必须根据病原体的类型在 BSL2 或 BSL3 条件下进行 AECII 的分离。如果实验人员无法在相应的安全条件下进行细胞分选，可在抗体染色后使用多聚甲醛（PFA）固定上述方法分离的 AECII。该步骤可灭活病原体10,11，因此后续的流式细胞术 AECII 分选可在 BSL1 条件下进行。尽管由于固定处理，细胞不再适用于功能性实验，但仍可用于分子分析。

  1. 为灭活病毒，将抗体标记的单细胞悬液用 500 µL 的 4% (w/v) 多聚甲醛（PFA）固定。
    警告：易燃固体。吞咽或吸入有害。可引起皮肤刺激和严重眼损伤。可能引起过敏性皮肤反应、呼吸道刺激，并有致癌风险。怀疑可导致遗传性缺陷。远离热源。如误吞：如有不适，立即联系中毒控制中心或医生。如吸入：将患者移至空气新鲜处，保持呼吸舒适，并立即联系中毒控制中心或医生。如进入眼睛：用清水小心冲洗数分钟。若佩戴隐形眼镜且易于取出，请摘除隐形眼镜，并持续冲洗。如发生暴露或感到担忧：请寻求医疗建议或就医。
    注意：根据“3R”指导原则，本研究使用了未感染小鼠的 AECII 细胞。AECII 细胞在室温下固定 10 分钟。针对每种可能对人类和环境构成风险的病原体，其固定时间必须单独测试。后续在 S1 条件下进行分选前，必须在 BSL2 或 BSL3 实验室中预先验证经 PFA 固定后无具有复制能力的病毒存在。
  2. 固定后，用 DMEM 洗涤细胞，并在 140 × g 条件下离心 15 分钟。
  3. 将细胞重悬于 300 µL DMEM + HEPES + 10% (v/v) 胎牛血清（FBS）中，并通过 100 µm 细胞筛过滤细胞悬液。
  4. 用额外的 300 µL DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS 培养基冲洗细胞筛，以防止细胞过度损失。
  5. 按照步骤 5 中所述方法进行细胞分选。" AECII 细胞的分选 "。
    注意：在通过实验强制验证病毒已被 4% (w/v) PFA 处理完全灭活后，AECII 细胞可在 BSL1 条件下进行分选。
  6. 从 PFA 固定的细胞中提取 RNA 时，请使用 RNeasy FFPE 试剂盒。
    警告：该试剂盒含有危险化学品。请遵循制造商提供的说明。注意随附的安全数据表，并进行以下调整：
    1. 分选后，在 4 °C 条件下以 140 × g 离心细胞 15 分钟。
    2. 将细胞重悬于 150 µL PKD 缓冲液中，并转移至 1.5 mL 离心管。
    3. 加入 10 µL 蛋白酶 K，在 56 °C 孵育 15 分钟，随后根据细胞数量在 80 °C 孵育最多 15 分钟（见 表 1）。
  7. 继续按照试剂盒说明书进行 RNA 提取流程，包括 DNase 处理、洗涤步骤，最终用 30 µL 无 RNase 水洗脱。

结果

本文所述方案提供了一种优化且详细的从小鼠肺组织中分离和分析AECII的方法，适用于从新生期到幼年期及成年期不同发育阶段的小鼠。该方法包括机械法和酶解法肺组织解离，并结合优化的流式细胞分选流程，采用定制化方案，适用于在生物安全二级（BSL1）条件下对感染动物样本进行处理后的流式分选。

实验数据表明，该分离方法（总结于图1）在获得存活率高且高度纯净（>95%）的AECII细胞群体方面具有高效性。通过流式分选获得的AECII细胞群体纯度极高，分选后分析证实其对已确立的细胞标志物的特异性接近100%（图2）。对分选后细胞样本的定量结果显示，每份全肺制备样品中可获得较高的细胞产量，其中新生小鼠肺组织可获得0.15 × 106 个活AECII，成年小鼠肺组织则可获得1.0 × 106 个细胞（图3A）。分离得到的AECII在整个分离过程中保持典型的形态特征（图3B）和完整的细胞完整性（图3C）。此外，通过使用表达mCherry报告蛋白的小鼠适应性IAV（H1N1，毒株A/Puerto Rico/8/34）（IAV-mCherry12）成功进行ex vivo感染实验，验证了该方案适用于功能性研究，并展示了这些细胞支持病毒复制的能力（图4）。

为了支持需要样本固定的实验流程，本方案包含了一种使用多聚甲醛（PFA）固定的特异性RNA提取方法。对不同处理时间点的PFA固定AECII细胞中提取的RNA质量进行系统分析表明，可从固定样本中稳定地提取出适用于下游分子分析的高质量RNA（表1）。提取RNA的质量与提取过程中80 °C热处理的持续时间呈直接相关关系，从而可根据特定实验需求提供明确的优化指导（表1，图5）。通过定量反转录PCR（qRT-PCR）验证发现，无论是PFA固定的样本还是新鲜对照样本，均可成功扩增管家基因（核糖体蛋白S9，Rps9）和AECII特异性标志物（表面活性蛋白C，Sftpc）（图6）。

小鼠肺组织制备流程图；新生期、幼年期、成年期组织消化，FACS分析，染色。
图1：通过酶消化和流式细胞术分选从新生期、幼年期和成年小鼠肺组织中分离AECII的示意图工作流程。该图展示了来自不同年龄组小鼠肺组织的系统性处理流程。小鼠安乐死后取出肺组织，随后使用dispase进行多步酶消化以实现组织解离。在机械性破碎后，细胞通过一系列孔径递减的滤膜进行过滤纯化。接着裂解红细胞。通过负向筛选富集AECII，即使用针对造血细胞标志物（CD45、CD11b、CD11c、F4/80、CD19、CD16/32）、内皮细胞标志物CD31、血小板标志物CD93以及支气管上皮细胞标志物CD24的抗体标记去除非目标细胞；同时通过抗CD326抗体正向筛选上皮细胞，再根据颗粒状AECII特有的高侧向散射光（SSChigh）特性进行流式细胞术分选。本方案可获得高纯度（≥ 95%）、高活性的原代AECII，适用于后续功能学与分子生物学分析。请点击此处查看该图的放大版本。

肺细胞的流式细胞术和显微镜分析；分选前后散点图及染料染色。
图 2：用于从成年小鼠中分离AECII的代表性设门策略。（A）肺单细胞悬液使用针对以下抗原的抗体进行染色：F4/80、CD93、CD11c（偶联APC）、CD19、CD31、CD11b、CD16/32、CD45、CD24（偶联PE）以及CD326（偶联BV785）。（B）对（A）的重新分析，用于纯度分析。分选后的AECII被重新分析，以确认AECII纯度达到97.2%。（C）分选后AECII的代表性荧光显微镜图像。细胞核用DAPI染色（蓝色）。细胞内染色使用一抗抗SPC抗体（种属：兔），二抗使用偶联Alexa 594的山羊抗兔IgG（红色）。仅用DAPI和二抗染色的AECII，以及用一抗和二抗染色的脾细胞作为相应的对照，表明抗SPC抗体和抗兔Alexa 594均具有特异性结合。比例尺：20 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

显示肺细胞存活率的柱状图；新生儿、幼年和成年样本中AECII的显微镜图像。
图3：荧光激活细胞分选后AECII的得率、形态及活力。（A）从新生、幼年和成年小鼠肺组织中获得的活AECII细胞总数。（B）分选后经光镜观察的AECII细胞图像。比例尺：75 µm。（C）分选后通过台盼蓝染色检测的AECII细胞存活率。请点击此处查看该图的高清版本。

Fluorescence microscopy, IAV-mCherry infection results, control vs infected, timepoints 0h and 8h.
图4: 离体 分选后的AECII细胞感染IAV-mCherry。 从成年小鼠分离的AECII细胞进行培养 离体 在Matrigel包被的组织培养板中过夜培养以促进细胞贴壁。随后，用IAV-mCherry（感染复数为2）感染细胞8小时。观察到mCherry信号强度随时间逐渐增强。比例尺：200 µm。 请点击此处以查看此图的放大版本。

经热处理的PFA固定的AECII：蛋白质分析图。图表比较了对照组以及80°C下5-15分钟的处理组。
图5：来自4% PFA固定的AECII的RNA完整性。 使用Qiagen FFPE RNeasy试剂盒（经修改）提取RNA后，PFA固定并分选的AECII的代表性RNA图谱。18S和28S rRNA的特异性峰以及RNA质量数（RQN）反映了从PFA固定的AECII中分离出的完整RNA的完整性和质量。请点击此处查看该图的放大版本。

qPCR扩增曲线；荧光值与循环次数；Rps9和Sftpc的比较；对照组与4% PFA处理组。
图6：对照组（未处理）和4% PFA固定的AECII细胞中管家基因Rps9与AECII特异性基因Sftpc的扩增曲线。请点击此处查看该图的放大版本。

样本80 °C 孵育时间28S/18SRQNRNA 浓度 [ng/µ]
对照 0.5×106-2105.8
对照 1×106-1.91012.3
PFA 固定 0.5×106526.45.5
PFA 固定 0.5×106101.98.13.7
PFA 固定 0.5×106151.88.22.76
PFA 固定 1×106528.26.26
PFA 固定 1×106101.18.45.12
PFA 固定 1×106150.98.55

表1：从4%多聚甲醛固定的AECII细胞中提取的RNA质量——不同固定时间的影响。 根据试剂盒说明书（FFPE RNeasy Kit）并结合步骤6中所述的改进方法，提取AECII细胞的RNA。将固定后的细胞在80 °C下孵育5分钟、10分钟或15分钟，以从样本中洗脱RNA。使用Agilent的Fragment Analyzer测定RNA完整性

讨论

本文所述的优化方案为从新生期、幼年期和成年期小鼠肺组织中分离和分析AECII提供了一种可靠且可重复的方法。此外，该方案在分选前增加了可选的PFA固定步骤，使得即使小鼠曾感染呼吸道病原体，也可在BSL1条件下进行AECII分选。通过精确实施肺暴露与灌注，随后经气管注入酶和低熔点琼脂糖至肺内，可有效维持组织结构，从而获得高质量的单细胞悬液用于后续分析。结合侧向散射特性进行流式细胞分选，并采用谱系阴性设门及对CD326阳性细胞的正向筛选，最终获得了极高纯度的AECII群体。这种高纯度对于确保后续分子和功能检测真实反映AECII固有的生物学特性至关重要，避免了其他污染细胞类型的干扰，从而提高了基因表达研究和病毒-宿主相互作用研究的可解释性。

上述方案采用多种针对白细胞及非白细胞抗原的荧光标记抗体排除非AECII细胞，随后对AECII进行阳性筛选 通过 侧向散射特性及上皮细胞特异性分子 CD326 的表达。尽管已有研究表明该方法可获得高纯度的 AECII 群体（使用 SPC，一种典型的 AECII 标志物），但迄今为止，所获得群体的纯度仅能通过分选后细胞内染色加以验证。该方案可用于从 SARS-CoV-2 和流感病毒感染的肺组织中分离 AECII，这些细胞在感染过程中主要被病毒靶向，并表现出独特的细胞适应性1然而，该方法可能不适用于肺癌生物学研究中分离小鼠AECII，因为EpCAM（CD326）在小鼠和人类的肺肿瘤细胞中也有表达。13对于这些研究，使用在转录调控下表达荧光蛋白的转基因小鼠品系 Spc 启动子可能为原代AECII的可靠分离提供更合适的方法。

每只新生肺可获得 0.15 × 106 个有活力的 AECII，每只成年肺最多可获得 1.0 × 106 个细胞，表明该方案具有高效性和可扩展性。成功分离大量 AECII 的主要障碍在于肺组织的酶消化不充分以及机械性解离不完全。因此，必须确保在步骤 2.1.4 中酶液完全充满支气管肺泡腔，并在步骤 3.1.3 中仔细进行组织的机械性解离。有效的酶消化将产生浑浊的细胞悬液，其中可见的细胞团块极少，通常可在后续过滤步骤中通过推杆进一步打散。无法通过细胞筛网的大团块通常是由酶消化不充分所致。请注意，不建议延长酶消化时间，因为这可能对后续的免疫染色14 产生不利影响，从而降低基于 FACS 的 AECII 分离准确性。

除了酶解和机械性组织解离的效率外，遗传背景也可能影响AECII的得率。本方案使用了C57BL/6背景的小鼠。鉴于已有报道指出不同品系在发育15、免疫16以及生理学特征上存在特异性差异17,18,19，因此使用其他实验室小鼠品系（如BALB/c、DBA）可能会导致AECII得率不同。此外，来自炎症肺组织（感染性或非感染性）的AECII得率可能显著降低。这可能是由于AECII发生了间接（炎症介导）或直接（病原体介导）的细胞死亡所致，而AECII正是诸如IAV20,21和SARS-CoV-222,23,24等病原体的主要靶细胞。

在机械解离、酶消化和流式分选过程中维持细胞完整性，对于后续的分子和/或功能分析尤为关键。因此，在分选后对AECII的存活率及细胞功能进行了评估。分选后的AECII能够在Matrigel上贴壁，并至少在24小时内维持富含板层体的典型形态，表明其在分离后具备功能活性，适用于后续实验 离体 培养（包括感染模型）。

分选后的AECII细胞高效感染IAV-mCherry报告病毒12 并且观察到强烈的病毒复制，验证了该系统作为阐明上皮细胞内在抗病毒反应的可靠平台。由于AECII调控表面活性物质生物合成、肺泡再生以及先天免疫中的关键过程25,26，对纯化的AECII群体中IAV复制动力学和宿主转录反应进行检测的能力，将提供在混合细胞样本中无法获得的见解。

本方案的一个关键创新在于引入了固定步骤，使得新鲜样本与灭活样本能够进行平行分析。PFA固定及改良的FFPE RNA提取流程可在一定程度上维持RNA的完整性，使其适用于后续转录组学分析，这一点已通过成功的定量逆转录PCR（qPCR）得到验证。

PFA 固定时间可能影响染色质量，从而影响通过 FACS 回收 AECII 的效果。此外，RNA 的得率和质量通常也会受到固定过程的影响。根据所采用的 in vivo 感染模型，实验设计时需考虑这些因素。建议避免过长的固定时间，而应优化 PFA 处理的持续时间，使用经实验证实可确保相应病毒完全灭活的最短必要时间。

使用微流控仪器评估核糖体RNA（rRNA）的丰度可作为估算生物样本中mRNA质量的替代方法。所述的AECII细胞固定/RNA提取方案能够分离出完整且质量足以用于后续转录组分析的RNA，这由28S/18S rRNA比值>1和RNA质量数（RQN）值>8得以证实。需要注意的是，80 °C孵育步骤会显著降低RNA的得率和质量。可根据需要调整热处理时间，以提高RNA得率和质量，满足后续应用需求。

总体而言，这些方法学上的改进为研究肺泡Ⅱ型上皮细胞（AECII）在健康状态、感染性疾病以及发育过程（从新生儿到成人）中的生物学特性提供了全面的工具包。该方法所获得的AECII细胞产量高、纯度高，可用于多组学分析，包括转录组学、蛋白质组学和染色质可及性检测，以及功能学实验（例如， 离体 感染）以进一步解析AECII的相关机制 体内.

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者谨此感谢 Tatjana Hirsch 和 Friederike Kruse 提供的专业技术协助，感谢 Lisa Hönicke 和 Justine Smout 提供的有益讨论，以及 Yoshihiro Kawaoka 提供的 IAV-mCherry 报告病毒。本研究由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，DFG，德国研究基金会）TRR 359 项目（项目编号 491676693，资助对象：D.B. 和 J.H.）、COVIPA 倡议计划（KA1-Co-02，亥姆霍兹联合会，资助对象：D.B.）以及德国研究基金会资助项目（BO 7036/1-1，资助对象：J.D.B.）提供资金支持。我们感谢马格德堡奥托-冯-格里克大学医学院开放获取出版基金提供的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ACK 缓冲液--8.29 g NH4Cl, 1 g KHCO3, 200 µL 0.5 M EDTA，加 Milli-Q 水至 1000 mL，调节 pH 至 7.2–7.4
抗小鼠 CD11beBioscience12-0112-83克隆株 M1/70；PE 标记
抗小鼠 CD11cBiolegend117310克隆株 N418；APC 标记
抗小鼠 CD16/32BD Biosciences553141克隆株 93；纯化抗体
抗小鼠 CD16/32BD Biosciences561727克隆株 2.4G2；PE 标记
抗小鼠 CD19Biolegend115508克隆株 6D5；PE 标记
抗小鼠 CD24Biolegend101808克隆株 M1/69；PE 标记
抗小鼠 CD31Biolegend102408克隆株 390；PE 标记
抗小鼠 CD326Biolegend118245克隆株 G8.8；BV785 标记
抗小鼠 CD45BD Biosciences553081克隆株 30-F11；PE 标记
抗小鼠 CD93eBioscience17-5892-82克隆株 AA4-1；APC 标记
抗小鼠 F4/80Biolegend123116克隆株 BM8；APC 标记
抗小鼠 SPC abcamab211326宿主种属：兔；克隆株：EPR19839；纯化抗体
Aria-FusionBD Biosciences细胞分选仪
Aria-II SORPBD Biosciences细胞分选仪
Biozym Plaque AgaroseBiozym840101溶于 H2O，终浓度为 1% (w/v)
细胞筛（100 µm、70 µm、40 µm）BD Falcon352360, 352350, 352340
CellTrics（50 µm）Sysmex04-004-2327
牛胰脱氧核糖核酸酶 I，每瓶 2000 Kunitz 单位Sigma-AldrichD4263将一瓶内容物新鲜溶解于 330 µL DMEM 中
Dispase，100 mL（5000 酪蛋白水解单位）Corning354235无菌过滤（孔径 0.22 µm），分装为每管 4 mL 至 15 mL 离心管中，-20 °C 保存
DMEMGibco31885-049低糖型，含丙酮酸钠，加入 HEPES（终浓度 25 mM）
FACS DivaBD Biosciences分选软件
FlowJoFACS 数据分析软件
山羊抗兔Alexa 594 标记
留置套管针 Introcan 22GBraun4252098B
RNeasy FFPE 试剂盒Qiagen73504
Symphony S6 SEBD Biosciences细胞分选仪

参考文献

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从新生、幼年及成年小鼠肺组织中分离肺泡II型上皮细胞并适用于感染性实验条件
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