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方法文章

活体双光子成像观察小鼠皮肤触觉感觉轴突形态

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⸱

DOI：

10.3791/69589

⸱

2025年12月30日

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Vanderbilt University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究提出了一种 体内 双光子成像方法用于可视化小鼠前爪皮肤中低阈值机械感受器（LTMR）轴突末梢的结构。通过对单个轴突进行重复、高分辨率成像，该方法为研究发育过程中及成年期皮肤感觉环路的结构与功能提供了一个新平台。

摘要

低阈值机械感受器（LTMRs）是一类体感神经元，能够检测无害的轻触刺激，例如振动、毛发偏转和压力。它们在外周形成亚型特异性的轴突末梢，并将轴突投射至脊髓中枢，以传递触觉信息。目前对LTMR发育与组织结构的理解主要来源于固定组织样本，无法揭示轴突连接与重塑过程中的动态及时间变化特征。本文介绍了一种双光子成像方法，可用于在小鼠前爪发育过程中以及成体阶段可视化LTMR轴突的形态。双光子显微镜能够在完整皮肤组织内实现高分辨率成像，从而在出生后多个时间点对同一轴突末梢进行重复观察。双光子成像还可结合新型小鼠遗传工具，以实现对特定亚型轴突发育过程的解析。对LTMRs的长期成像为研究神经回路的组装以及损伤后的修复机制提供了可能。这些方法建立了一个活体（in vivo）研究系统，将有助于深入理解调控体感轴突发育与再生的细胞机制。

引言

触觉是最先发育的感觉，它在生物体感知和响应物理世界的过程中起着核心作用。触觉由低阈值机械感受器（LTMRs）检测，这类感受器是背根神经节（DRG）神经元的亚型，能够感知无害的机械刺激，包括压陷、振动和毛发偏转1,2。LTMRs为假单极神经元，其外周轴突延伸至外周组织，形成特定亚型的终末结构；其中枢轴突则通过与脊髓神经元建立突触连接，将触觉信息传递至中枢神经系统3。然而，触觉环路是如何建立并维持的，目前仍知之甚少。

20世纪60年代和70年代在猫身上进行的早期基础研究首次鉴定了这些功能上 distinct 的机械感受器及其在有毛皮肤中的反应特性4,5。LTMR亚型根据其独特的形态、传导速度和反应特性进行分类2。主要的LTMR亚型包括Aβ快速适应（RA）和慢速适应（SA）LTMR、Aδ-LTMR和C-LTMR2,6,7。Aβ RA-LTMR、Aδ-LTMR和C-LTMR在毛囊周围形成纵向梭形复合体2。Aδ-LTMR在毛囊尾侧形成极性化的梭形末梢，这一特征对其在毛发偏转时产生方向选择性反应至关重要7。梭形复合体中的轴突末梢与毛干紧密对齐，并被终末施万细胞的指状突起所包绕，这些结构提供营养支持并影响轴突的形态发生8,9,10。在无毛皮肤中，Aβ RA-LTMR轴突终止于触觉小体（Meissner小体），这些卵圆形结构位于真皮乳头内，对皮肤表面的运动刺激具有特异性响应2,11。

LTMR 轴突末梢的组织在发育过程中受内在程序和皮肤依赖性信号的共同调控12,13当受损时，低阈值机械感受器（LTMR）功能障碍与机械性异常性疼痛等病理状态相关12,14然而，完整皮肤中低阈值机械感受器（LTMR）发育与维持的机制仍不明确。目前关于其发育的大部分认知源于固定组织的研究，而此类研究无法捕捉可能发生的动态过程。 体内6,15,16,17,18例如，Aβ RA-LTMRs 和 Aδ-LTMRs 在出生后早期发育阶段表现出在毛囊周围主动支配及轴突修剪现象19毛囊神经支配与维持的实现机制 体内 尚不清楚。

双光子激光扫描显微技术是一种先进的成像技术，可实现对活体组织内荧光标记结构的可视化观察，从而实现了对动态生理过程的高分辨率体内成像20,21。在双光子成像过程中，近红外光的短脉冲仅在焦平面上激发荧光分子，从而将信号限制在微小体积内，并最大限度地减少非焦平面的荧光干扰21,22。这种空间限制显著降低了光毒性，使得能够对结构进行三维、空间分辨的成像20,23,24。此外，双光子显微技术所采用的较长激发波长在组织中的散射更少，因此可在复杂环境中实现更深的穿透深度和更低的背景噪声20,25,26。例如，双光子成像已揭示了脊髓背角神经元中的突触结构可塑性及神经元活动27,28,29。此外，对毛囊进行的长期体内双光子成像研究揭示了小鼠耳部皮肤中毛囊稳态的相关机制23。因此，双光子显微技术非常适合用于体内研究皮肤中的低阈值机械感受器（LTMR）结构，尤其是在需要重复、长期成像以追踪发育过程和慢性变化的情况下。

当与表达荧光报告基因的转基因小鼠品系联用时，双光子显微镜可揭示皮肤中的神经元形态3。在体感系统中，由thy1启动子控制表达的黄色荧光蛋白（YFP）（Thy1-YFP）30可特异性标记有毛皮肤中的Aβ-LTMR梭形末梢复合体以及无毛皮肤中的梅克尔小体30,31。在 Thy1-YFP 小鼠中，被标记的轴突对髓鞘碱性蛋白和神经丝蛋白呈阳性反应，这两种蛋白是髓鞘化Aβ轴突的标志物30,31。此外，TrkBCreER小鼠品系利用他莫昔芬诱导型Cre重组酶（CreER），由TrkB（原肌球蛋白受体激酶B）基因启动表达，可在发育过程中特异性标记Aδ-LTMRs7。在皮肤中，双光子显微镜对麻醉小鼠体内的LTMRs成像效果最佳，因为小鼠的活动会影响高分辨率图像的采集。在CreER诱导表达后，需要一定时间才能在轴突末梢观察到荧光蛋白，且每种转基因品系所需的最短等待时间需单独确定。总体而言，该方法适用于在所有发育阶段及成年小鼠中对LTMRs进行可视化观察。

本方案详细说明了使用双光子显微镜在高分辨率下研究发育期及成年小鼠有毛和无毛皮肤中低阈值机械感受器（LTMR）轴突形态的操作步骤。方案中包含多项优化高分辨率成像和长期活体成像的技术要点。该整合性方法可实现对触觉感受轴突组装及其可塑性过程中细胞机制的深入探究。 体内.

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方案

所有实验操作均遵循机构动物护理法规，并经范德堡大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。为确保实验人员的安全，所有操作均需穿戴实验服、无菌手套和口罩。所有工具在使用前均经过彻底灭菌，每次实验前后均用70%乙醇清洁实验台面。本研究中使用的小鼠为青春期及成年期动物，包含两种性别，来源于Thy1-YFP、TrkBCreER和Ai140品系。所用试剂和设备详见材料表。

1. 仪器的准备

  1. 打开激光器。给予充足的预热时间。本研究中使用的是 Chameleon Discovery NX 激光器，其脉冲持续时间为 100 飞秒（fs），重复频率为 80 ± 0.5 兆赫兹（MHz）。
  2. 打开双光子显微镜，并在计算机上启动控制与图像采集软件。
  3. 开启加热垫并将其温度设置为 37 °C，以防止麻醉期间动物体温过低。

2. 麻醉及前肢成像准备

  1. 为诱导麻醉，将小鼠放入诱导室，并将系统设置为3.5%异氟烷，直至小鼠失去翻正反射且呼吸平稳规律（遵循机构批准的方案）。使用室温空气作为载气，流速应设定为每分钟1.0升（L/min）。
  2. 将小鼠置于成像平台的加热垫上，并将异氟烷浓度降低至1.5%，氧气流速调至0.5 L/min。异氟烷应通过鼻罩输送。对于出生后20天以内的小鼠，为维持麻醉状态，异氟烷浓度应设为2–4%。每10分钟监测一次麻醉深度，评估指标包括足底反射和眼睑反射的消失情况、呼吸频率与深度，以及整体肌张力。
  3. 为减少成像过程中由呼吸等引起的运动伪影，应将小鼠身体置于与足爪分离的独立平台上。在本方案中，小鼠身体放置在一个紧邻但不接触足爪固定平台的支撑面上。
  4. 在眼睛上涂抹眼用软膏，以防止成像期间角膜干燥。
  5. 使用棉签轻轻在足爪上涂抹脱毛膏以去除毛发。待其在皮肤上停留约1分钟后，清除脱毛膏，随后用70%乙醇和水清洁小鼠足爪。
  6. 轻轻拉伸皮肤以稳定皮肤表面。使用无菌30 G针头和黑色墨水，在预定成像区域两侧轻刺皮肤，纹制两个相邻的点，确保两点间距约为2毫米（mm）。纹制完成后，将针头妥善丢弃至锐器容器中。
  7. 在玻璃载玻片的四个角各放置一滴真空脂，在载玻片中央放置一小块约1 mm厚的黏土（例如DAS Air-Hardening Modeling Clay）。将载玻片置于物镜下方，并将小鼠足爪精确对准黏土位置（图1A、B）。轻轻滚动小鼠足爪，使其贴合并压入黏土中以展平。随后小心地将一块22 mm × 60 mm的盖玻片覆盖在足爪上以固定载玻片。通过轻微按压盖玻片的各个角来调整小鼠皮肤的角度，直至盖玻片表面与皮肤表面平行于成像平面。成像过程中施加轻柔压力，有助于避免潜在的皮肤损伤。
  8. 如需成像无毛皮肤区域，将载玻片置于物镜下方，并按照步骤2.7所述将小鼠足爪居中放置于载玻片上。使用镊子旋转足爪，使无毛皮肤朝上。用镊子的平端轻轻将足爪压入黏土中。待足爪展平后，按步骤2.7所述方法放置盖玻片并轻压固定。

3. LTMR形态的双光子显微镜成像

注意：以下参数可根据具体实验进行调整。本实验中使用的是数值孔径为1、工作距离为2.00 mm的20倍水浸物镜。步骤3.1–3.6描述了用于Thy1-YFP小鼠右侧前爪的具体参数，可作为参考指南。

  1. 在盖玻片上滴一滴蒸馏水，直接覆盖在小鼠足部。
  2. 降低物镜，直至形成水柱。
  3. 当物镜对准小鼠足部后，关闭显微镜箱，并使用LED屏幕对样本进行聚焦 通过 X、Y 和 Z 控制器。LED 屏幕显示由显微镜内置 LED 照明的实时图像。
    注意：LED 模式 用于在切换至双光子模式前确认物镜已对准目标区域。LED图像可显示血管和毛囊等表面特征，为对准和定位提供视觉参考。小鼠足部的纹身在LED屏幕上呈现为黑色斑点。利用这些标记物，找到并聚焦于黑色斑点之间的区域，以确保对小鼠足部同一区域进行重复成像。
  4. 一旦找到样本，关闭LED屏幕。要对组织进行双光子成像，将显微镜从 镜子 设置为 二向色镜 通过显微镜右上侧的杠杆翻转来设置。
  5. 关闭遮光窗帘并打开检测器以观察YFP。
  6. 使用Prairie View，打开 快门， 并切换软件至成像模式。用于成像 Thy1-YFP打开可调谐激光器，将其设置为960纳米（nm），增益调至700-800。在成像GFP时，将可调谐激光器设置为920 nm。
    1. 对于出生后第10天及更小的小鼠，将初始激光功率设为50，随后逐步增加至达到所需信号强度。较低的初始激光功率可减少光穿透深度，降低光损伤风险。在设定好激光波长、增益和功率后，开始扫描。
      ​注意：为获取高分辨率的1.00倍视野图像或无毛指尖内迈斯纳小体的图像，建议采用1024 × 1024的图像尺寸，成像视野为601.9 µm × 601.9 µm，像素大小为0.588 µm × 0.588 µm。为成像毛囊周围环层神经末梢，建议在8.00倍放大倍数下采用1024 × 1024的图像尺寸，成像视野为75.2 µm × 75.2 µm，像素大小为0.147 µm × 0.147 µm。需注意，成像视野和像素大小会随放大倍数的调整而变化。
  7. 使用X、Y和Z控制器定位成像区域，根据需要调整放大倍数，并开始图像采集。通常在皮肤表面下约10–20 µm的起始位置可获得最佳图像。
    注意：毛发皮肤的高分辨率图像通常具有1 µm或2 µm的步长，包含约40至120个切片。而无毛皮肤的高分辨率图像通常具有2 µm至4 µm的步长，包含约80至100个切片。这导致典型的z轴范围为100–250 µm，整体最大成像深度约为300 µm。
  8. 成像过程将限制在25分钟内，以尽量缩短异氟烷暴露时间，降低麻醉相关不良反应对动物的风险。多余的异氟烷由麻醉用活性炭过滤罐吸收，该过滤罐可作为普通垃圾丢弃。

4. 术后护理

  1. 将小鼠足部从载玻片上取下，并将小鼠放回恢复笼中。
  2. 将小鼠笼置于加热垫上保持温暖，直至小鼠完全从麻醉状态恢复。
  3. 将小鼠放回其原有饲养笼，继续观察30分钟，确保小鼠能与同笼伙伴正常共处。

5. In vivo 慢性成像 LTMR 形态

  1. 按照步骤 2.4-3.3，将小鼠放置在双光子显微镜下。
  2. 通过 LED 屏幕定位前次成像时的墨点标记，调整屏幕方向使其对准两点之间，以确保目标区域被完整捕获。在显微镜扫描模式下，检查是否存在大神经或毛囊排列等解剖标志，以确认定位到相同区域。
  3. 一旦找到成像区域，继续执行步骤 3.4-3.6 进行成像。
  4. 检查通过双光子激发皮肤区域所获得图像的质量、强度以及主要轴突的形态，确保当前图像视野与前次成像会话中获取的图像具有可比性。

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结果

在本研究中，采用双光子显微镜观察了发育过程中及成年期皮肤中 Aβ RA-LTMR 和 Aδ-LTMR 轴突结构。成熟梭形末梢在小鼠出生后约第20天及以后出现，此时已完全发育19,32。成年小鼠有毛皮肤中轴突终末的整体组织结构通过最大强度投影成像展示（图2A）。利用三维重建可观察这些轴突终末的深度和形态，其中包含 Aβ 场域-LTMRs、Aβ RA-LTMRs 以及部分未明确的 Aβ 亚型轴突（视频1）。在此成像视野中，毛囊可通过其自发荧光被识别（图2A）。围绕护毛和针毛/无毛毛囊的梭形末梢密度为 15.8 个末梢/mm2，并可进一步以高分辨率成像（图2B,D）。单个 Aβ RA-LTMR 梭形末梢可在单个 z 平面中被观察到（图2E

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讨论

本研究展示了利用双光子显微镜观察新生期和成年小鼠完整皮肤中低阈值机械感受器（LTMR）形态的方法。这种纵向成像技术克服了组织固定带来的局限性，能够在完整组织中实时观察轴突结构。通过双光子成像所观察到的Aβ RA-LTMR和Aδ-LTMR轴突形态，与此前经多聚甲醛（PFA）固定组织所获得的结果一致2,6,7,19,33,34。在长期成像过程中，未观察到激光功率引起局部皮肤发热或损伤的迹象，未出现明显的炎症反应或形态学改变。综上所述，这种活体成像方法有望揭示不同类型机械感受器群体在发育过程中以及成年个体中的发育与重塑机制19,3

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披露

作者声明无相关利益冲突。

致谢

我们感谢 Hannah Elam 博士、Snighda Mukerjee 博士、Rachelle Larivee 和 Tegy J. Vadakkan 博士在本研究过程中提供的所有支持与帮助。感谢 Ryan Michael Nuera 在建立异氟烷系统方面提供的协助。本工作由霍华德·休斯医学研究所 Hanna Gray 奖学金（资助号：GT17518）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
20倍物镜 – 超高数值孔径 1.0Olympus1-U2B965双光子显微镜系统搭建
22×60 盖玻片VWR16004-330双光子显微镜系统搭建
空气硬化型油泥DAS双光子显微镜系统搭建
麻醉空气泵（HF），110VRWD Life Science Inc.R510-30异氟烷麻醉系统
同心式麻醉面罩RWD Life Science Inc.R510-M异氟烷麻醉系统
麻醉诱导舱 – 小鼠和大鼠用RWD Life Science Inc.V105异氟烷麻醉系统
Bruker Ultima Investigator Plus 激光扫描显微镜Bruker Nano, Inc. 双光子显微镜系统搭建
蝶形针头Fisher Scientific1484041双光子显微镜系统搭建
Chameleon Discovery NX 配 TPC：双通道Coherent1385777双光子显微镜系统搭建
新生小鼠用带管路的锥形面罩RWD Life Science Inc.68680异氟烷麻醉系统
双通道发射滤光片（et525/70m 和 et595/50m）及 t565lpxr  二向色镜分光器NikonINVP-01双光子显微镜系统搭建
落射荧光滤光片组 ET-GFP ET470/40x 和 ET252/50m；二向色镜 T495LPXR Nikon518065双光子显微镜系统搭建
乙醇Decon Laboratories Inc.双光子显微镜系统搭建
带控制器的远红外加热垫（交流电源）Kent ScientificRT-0515双光子显微镜系统搭建
GaAsp 检测器（2个） Hamamatsu Photonics HED-UP-2 双光子显微镜系统搭建
气体过滤罐RWD Life Science Inc.R510-31-6异氟烷麻醉系统
高真空润滑脂Sigma AldrichZ273554成像系统
异氟烷，USP（250 mL）Piramal Critical Care6679-017-25异氟烷麻醉系统
激光防护箱 Teco Technology成像系统
小鼠：B6.129S6(Cg)-Ntrk2tm3.1(cre/ERT2)Ddg/JJAX27214
小鼠：B6.Cg-Igs7tm140.1(tetO-EGFP,CAG-tTA2)Hze/JJAX30220
小鼠：B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/JCharles River3709
Nair 脱毛膏Amazon28001双光子显微镜系统搭建
原始数据文件Zenodo10.5281/zenodo.17370834
带大型矩形插片夹持器的刚性支架ThorlabsMP15M双光子显微镜系统搭建
小型动物麻醉操作平台RWD Life Science Inc.R510-PGL异氟烷麻醉系统
Soothe 润滑眼膏Bausch + Lomb双光子显微镜系统搭建
Superfrost Plus 显微镜载玻片Fisher Scientific12-550-15双光子显微镜系统搭建

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