利用多孔膜插入物和RTddPCR分离和定量轴突mRNA

Summary

本研究提出了一种利用多孔膜插入物分离轴突mRNA的稳健方法，实现了神经元与神经突的整体分离及RNA纯化。结合RTddPCR，该方法实现了低拷贝转录本的绝对定量，促进了mRNA转运和局部翻译的研究，具有高灵敏度、可重复性和广泛的实验应用性。

Abstract

mRNA在神经元内定位和翻译的空间动力学对神经元功能的多种机制至关重要，包括神经元连接性、突触可塑性和损伤反应。由于神经元极性极大，许多功能依赖轴突局部翻译特定转录本的能力。然而，定量这些亚细胞RNA群体在技术上仍然具有挑战性。本文介绍了一种可重复的方法，用于从培养的啮齿动物神经元中获得独立的体细胞和轴突富集区室，并定量区室特异性的mRNA表达。初代啮齿动物胚胎或成体神经元在具有1-3微米孔膜的插入物上进行培养。这些膜仅允许轴突进入，允许体细胞和轴突间室物理分离。随后从全神经元和轴突富集部分分离出RNA，进一步用于逆转录酶滴子数字PCR（RTddPCR）及基因特异性引物。该系统提供了亚细胞区间间的绝对定量比较，实现对局部转录本的高灵敏度检测。该方法测量稳态RNA丰度，便于观察轴突RNA随时间变化，以应对神经营养因子、应激或损伤模型。物理区室化与RTddPCR分析的结合减少了交叉污染，并获得稀有转录本的精确拷贝数，提供高灵敏度、可重复性，并检测到控制轴突生长和再生的低拷贝数mRNA。该方法同样适用于下游测试，如测量蛋白质合成、研究RNA稳定性，以及使用siRNA或阻断特定蛋白质的药物进行扰动实验。重要的是，该技术可以适配于不同的神经元亚型、发育阶段或损伤模型。总体而言，这种方法是一种灵活、灵敏且可重复的方式，用于研究轴突mRNA定位的分子基础及其对神经元功能和疾病机制的影响。

Introduction

神经元是生物学中结构最复杂、极化程度最高的细胞之一。它们的工艺很长，有时能达到超过一米的距离。这种极性以不同方式复杂化了细胞的通讯和蛋白质稳态。为满足这些要求，一种更精细的方法是将mRNA运输到轴突和树突等偏远区室，以调节方式促进其对局部信号1^、2、3的翻译。局部翻译使轴突能够以时空方式合成蛋白质。这一过程对轴突发育、突触可塑性、损伤后的再生以及对发育和细胞外刺激的反应至关重要，4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15。

分析轴突中定位mRNA的功能对于理解其在正常神经功能及病理生理中的作用至关重要。轴突mRNA翻译失调已被发现与多种神经退行性疾病^有关，如肌萎缩侧索硬化症（ALS）17,18,19、脊髓性肌萎缩症（SMA）^20,21和阿尔茨海默病（AD）²²。损伤后的轴突再生高度依赖于细胞骨架蛋白、信号分子和^受体^{3,23,24,25,26,27,28}的快速、精确翻译。尽管有这些新颖的概念，该学科在有效定量和捕获轴突特异性mRNA群体方面仍面临挑战。

轴突转录组学的一个挑战是让体细胞和轴突干净地分离。由于大多数mRNA在体细胞中富集，即使是细胞体中的少量污染，也可能影响评估特定mRNA轴突含量的结果。传统技术，包括微流控腔^{室29、30、31、32} 或坎佩诺腔^室33，能够实现轴突方向生长并明确分离两个区室，但轴突产额可能过低，不适合进行如体体RNA测序（RNA-seq）、RNA共免疫沉淀后再测序RNA测序或定量聚合酶链反应（qPCR）等生化研究。尽管大量RNA测序和qPCR有益，但通常缺乏准确识别轴突中低拷贝转录本所需的灵敏度，导致对生理重要物种的错误估计。

为应对这些挑战，我们和其他人使用透水膜插入物进行轴突和体形34,35,36,37,38,39,40,41的物理分离。这些插入物允许神经元在微孔表面发育，轴突可以通过它们延伸到底部腔室，但不能进入体细胞。这种基本但有效的结构使得培养大量神经元成为可能，且体细胞和轴突物理上有明确的分离。基于膜的方法重要之处在于它避免了微流控器件带来的技术难题，并提供了大量可用于分子和生化研究的轴突材料。插入系统也易于处理机械损伤等领域，使其在许多与神经修复相关的实验环境中非常有用。本文所述的方法通过优化培养条件、调整膜孔特性，并结合基于逆转录酶滴子数字PCR（RTddPCR）的低产率轴突RNA样本验证，进一步优化神经元产率和纯度。

同样重要的是确保轴突分数纯净。我们只有在小心移除上表面残留的体细胞物质后，才从下腔室提取轴突。引物验证显示轴突标志物富集强烈，体细胞标记几乎无或可忽略。分子确认进一步强化了这一区别：轴突组分富含公认的轴突mRNA，如 Gap43，而 Actγ⁴²表达较低。这表明插入系统产生的轴突样本中体细胞含量极低，适合进一步检查。

在分离富集轴突组分后，接下来的难关是测量极低拷贝数的mRNA。轴突分数起始物稀少，轴突中低拷贝数mRNA的存在，推动了传统逆转录酶定量PCR（RT-qPCR）的灵敏性极限，后者采用标准曲线进行定量。此外，RT-qPCR也无法提供特定转录本的绝对拷贝数。而RTddPCR则将cDNA样本分离成数千个滴滴，这有助于利用泊松统计获得精确的转录本计数。这使得即使单个纳克总RNA^{5、6、7、43}中只有少量转录本，也能可靠地找到转录本。

在本稿中，我们提供了一种简化的方法，包括在插入片段上培养不同的成体或胚胎啮齿动物神经元、从全神经元与轴突富集室分离RNA、检测轴突纯度，以及基于RTddPCR的mRNA绝对定量。这些方法可用于确定特定mRNA的水平，这些mRNA在基础条件下定位于轴突，以及它们在轴突切断或生长因子刺激或神经毒性信号下的变化。通过结合蛋白质共免疫沉淀，还可以评估轴突核蛋白（RNP）复合物的动态。例如，我们广泛使用该方法研究存在于轴突活性Ras GTP酶蛋白结合蛋白1（G3BP1）颗粒中的mRNA。G3BP1是应激颗粒⁴⁴的核心成分，我们之前的研究显示它抑制轴突蛋白合成，进而阻断周周神经系统和中枢神经系统的轴^突再生5。此外，该方法还可用于研究轴突翻译失调在多种病理生理条件下的作用，包括ALS、SMA和AD。

本研究的目标是创建并测试一种敏感、可重复且可扩展的轴突mRNA测量方法。通过结合基于切片的区隔培养物与基于RTddPCR的定量，我们为该领域提供了轴突转录组学长期存在的问题解决方案。该方法不仅将促成本地翻译的重要发现，还将为聚焦神经修复和神经退行性退行性治疗的转化研究奠定基础。

Protocol

1. 准备插入片段以进行细胞播种

1. 将插入物以相应孔径放置于6孔板中。
   注意：使用1微米孔径将轴突与体细胞分离，使用3微米孔径将所有神经突（轴突和树突）与体细胞分离。
2. 向6孔板加入100 μg/mL聚L-赖氨酸（PLL），使其接触插入物底部和顶部（每孔2毫升，每份1毫升）。
3. 在37°C下孵育一夜。
4. 用无菌超纯水清洗井口底部和底部——4次洗涤×5分钟。
5. 仅对背根神经节（DRG）神经元，添加5 μg/mL层粘连蛋白（2 mL/孔/孔，1 mL/插入片），并在37°C下培养至少1小时。 确保内衬的上下涂层均匀。
6. 用含100 U/mL青霉素/链霉素的无菌磷缓冲生理盐水（PBS）（pH 7.4）洗涤，洗涤2次×5分钟。
7. 进行解剖并播种约1×10个胚胎皮层神经元6个细胞/插入物，胚胎皮层⁵、^海马体45和基底前脑胆碱能神经元^31,32。对于成年大鼠DRG，平板6-8个DRGs/插入图^5,7（见图1）。

2. 从6孔插入物中收集神经元亚细胞片段

1. 每个插入点和一个6孔板的1.5毫升微离心管各250微升TRIzol。先放一边。
2. 在另一块6孔板中，加入每孔2毫升无菌PBS。孔/板的数量应与插入物数量成正比。
3. 从插入件顶部和底部抽取培养基，并将插入物转移到含有PBS的6孔板上。
4. 用镊子轻轻放置插入物，并在插入片顶部加入2毫升PBS。从插入物的顶部和底部吸取介质，然后重复。总共用PBS洗两次，然后保持新鲜PBS中（插入件顶部和底部分别为1毫升和2毫升）。
5. 整个神经元分数的分离
   1. 用无菌细胞刮刀刮除整个神经元部分（插入件顶部）。施加恰到好处的压力，使细胞开始脱落，但膜不会破裂（见图1）。
   2. 从插入片段中收集整个神经元，转移到1.5毫升微离心管中。
   3. 用10000-15000 克 离心管2分钟。
   4. 丢弃上清液，将裂解液重新悬浮于250微升三唑中。
   5. 把这根管标记为整个神经元分数。
   6. 继续进行神经突组分采集。
6. 神经突组分的分离
   1. 拿一支无菌棉签，用一端，沿着整个神经元一侧从上到下，非常慢地呈之字形移动。将插入件旋转90度，并用棉签另一端重复同样过程（如果使用双面棉签，或用新的棉签处理单面棉签）。将该拭子丢弃（见图1）。
   2. 用新的棉签，沿着同心圆移动，从插入物中间开始向外移动。一定要清理墙壁（周长）。
   3. 将膜插入件倒置（神经突面朝上），用新的无菌手术刀切开膜，同时用镊子固定。确保在周边留~2-3毫米的空隙。
   4. 将切开的膜放入含有TRIzol的6孔板中，神经质面朝下。确保它浸没在水里。
   5. 从6孔板收集含有神经浮体裂解液的TRIzol，转移到1.5毫升微离心管。
7. 对于整个神经元和神经突裂解物，应进行RNA分离，或将裂解液保存在-80°C以备后续处理。

3. RNA的分离与定量

1. RNA分离
   注意：这部分务必在无RNase环境下工作，使用专用且无菌的塑料器具和手套。
   1. 每1毫升三唑加入0.2毫升氯仿，剧烈摇晃15秒，并在室温下培养2-3分钟。在12,000 × g 离心机中，4°C分离15分钟，分离成有机层、间相层和含RNA的水层。
   2. 将上层水相转移到新的管子上，避免中间相。沉淀RNA时，加入1体积异丙醇并轻轻混合。在室温下培养10分钟（或在-20°C下更长时间以获得更高产量），以沉淀RNA。在12,000 × g 离心机，4°C离心10分钟，以沉淀RNA。
   3. 丢弃上清液，用1毫升75%乙醇清洗沉淀。短暂旋转并离心机，在7500克×4摄氏度下5分钟。
   4. 溶解RNA：小心取出乙醇洗涤剂，将沉淀风干5-10分钟，避免完全干燥。将沉淀重新悬浮于一小体积无RNase水或1个Tris-EDTA（TE）缓冲液中，在55-60°C下培养至完全溶解。纯化后的RNA储存在-80°C。
2. 利用RiboGreen测定法进行RNA定量
   注意：下图RiboGreen检测法使用了针对核酸的荧光染料，具有更高的灵敏度、特异性，并且比紫外吸收法更能检测完整RNA。如果存在DNA污染问题，可以考虑进行DNase处理。
   1. 准备1个TE缓冲液，将提供的20个TE缓冲液用无RNase水稀释20倍。准备RiboGreen工作液，并用锡箔保护感光染料。高程测定法时，将浓缩染料1：200稀释于1倍热化氢中（10 ng/mL-1 μg/mL），低速测定法则用1倍TE稀释1：2000（2.5 ng/mL-50 ng/mL）。通过将试剂盒中的RNA标准序列稀释为1x TE制备RNA标准，以覆盖预期的样本范围。三份运行标准。
   2. 通过在1倍TE中稀释RNA样品，以适应检测的动态范围来制备样品。三份样本。
   3. 加入等量的RiboGreen工作液和RNA标准或样品（例如各100微升）。在室温下孵育2-5分钟，避免光照。使用适当设置测量荧光（激发~500纳米，发射~525纳米）。测量并减去试剂空白读数（1x TE + 核绿染料）。
   4. 分析与定量：利用标准物的荧光值与浓度绘制标准曲线。利用该曲线确定样品中的RNA浓度（见图2）。

4. cDNA合成

1. 把所有部件都冻在冰上。使用前轻轻弹动并短暂旋转每根管子。在冰上PCR管中，每个反应结合以下组分：
   RT主混合（5倍）：4微升
   RNA样本：可变（总RNA最多1微克）
   无核酸酶水：总体积可达20微升
   注意：对于无模板对照（NTC），将RNA样本替换为无核酸酶水。
2. 轻轻搅拌并旋转管子，收集底部的内容物，然后运行热循环程序。
   引子退火：25°C，持续2分钟
   cDNA合成：55°C，持续10分钟
   热灭活：95°C，持续1分钟

5. 引物设计与验证

注意：RTddPCR引物设计通常遵循定量qPCR相同的原则，但需额外注意以确保正负滴的清晰分离。使用NEB、IDT或ThermoFisher的引子设计工具来促进这一过程。成功的RTddPCR检测以高特异性和强健扩增为特征，从而在扩增（阳性）和未扩增（阴性）滴之间产生明显的分离。以下 NCBI RefSeq 入场编号用于设计 PCR 引子：

行动加速度：NM_001127449.1
前进1：卡格特克塔卡格格特格
背面1：CCAACTCAAGGCAAGTAACAAC
扩容体长度：98
前进2：GTAGTGATCTGTGAGGAGGATT
背面2：GACTTTCCCCACCCTGTTAGAC
扩容长度：118

Gap43：NM_017195.3
前锋1：GGAAATTCTTGCACTGTACCC
背面1：GACTCCTCAGAGAGAGACAT
Amplicon长度：122
前进2：卡格特格
背面2：CATTGCACACACACACTTGG
扩增体长度：116

1. 设计一个推荐长度为18-30碱基对，气相气谱含量为40-60%的引物。确保熔点（Tm）在55-65°C之间，正向和反向引子相距在2-5°C以内。在3英尺末端的最后五个碱基中加入一到两个G或C碱基，以增强结合特异性，但避免长时间的G或C链。
2. 使用如国家生物技术信息中心（NCBI）基础局部比对搜索工具（BLAST）等比对工具验证引物特异性，确保引物仅结合目标序列。设计扩增子大小在50-200个碱基对之间，最优选择~100碱基对，因为较短的产物扩增效率更高，同时又能与引子-二聚体区分开来。
   注意：本研究中，短PCR产物通常在RT-ddPCR中被扩增效率高于较长产物。
3. 通过设计GC含量为50-60%的引物，避免二级结构和3'互补性，以减少引子二聚体。引物验证时，使用琼脂糖凝胶电泳，并始终使用无模板对照评估引物二聚体。
4. 避免在模板中高可能形成二级结构的区域设计引物，因为这会干扰扩增效率。

6. RTddPCR

注意：按照制造商说明及Das等人（2022）⁴³之前描述的RTddPCR进行RTddPCR作，只需做少量调整以提高检测复现性。

1. 使用ddPCR即用通用混合和靶标特异性引物，使用适当的cDNA，制备RTddPCR反应。
2. 用液滴发生器生成液滴。
3. 用液滴读取器读取终点荧光，并用内置软件分析数据。
4. 采用以下质量控制措施以确保精确定量和可重复的液滴形成：
   1. 将引子组固定在同一行或同一列，以减少板片效应。
   2. 准备主混合液以减少小体积的移液。
   3. 移液器采用低流量以防止气泡，并使用多通道移液器实现样品均匀分配。
   4. 液滴生成后应轻轻触摸板，并立即密封以防止蒸发。
   5. 所有反应都要在冰上准备，避免试剂反复冻融循环。
   6. 为每个引物组设置无模板控制以监测污染情况。
   7. 排除含有少于10,000个接受液滴的井进行分析。
   8. 对所有样本进行技术复查以确保可重复性。
5. 手动检查液滴荧光振幅图，以验证自动阈值检测的准确性。

Results

原胚胎啮齿动物皮层神经元、海马神经元和BFCNs在PLL涂层的1微米插入片上结合得很牢固，并在体 外 （DIV）内将神经元跨膜延伸5-7天。到了11 DIV，文化网络已密集。对于成年大鼠DRG，在PLL涂层的3微米插入件上加一层层粘连蛋白，有助于实现相当的轴突延伸5 DIV。这些观察确认插入片段能够支持长期神经元生长，并为下游RNA提取提供足够的轴突材料。如果需要扩展，我们会结合多个内衬材料，以提供足够的材料。

从单个插入片段中提取TRIzol可获得足够的RNA，用于逆转录和后续的ddPCR。RiboGreen定量确认了整神经元组分的RNA产率稳定（212.85 ng/插入片），而神经突起组分的RNA产率较低（42.75 ng/插入片）（见图2）。我们通常从整个神经元组分获得约5-7倍的RNA，而神经突富集组则是RNA。

所有引物在RTddPCR实验前均经过验证。对于每个目标转录本，至少会订购两组引物，并利用传统PCR检测同一神经元样本生成的cDNA检测。选择产生最强且特异性条带的引物对进行RTddPCR（见图3A）。例如，我们为 Gap43选择了引子集1。对于结果不明确的情况，如 Actγ所得，我们会进行梯度PCR以优化退火温度（见图3B）。这确保了仅使用经过充分验证的引子进行绝对定量，从而降低了液滴分离过程中出现伪影的可能性。

刮除和拭子程序能可靠地分离体细胞和神经神经腔室。从整个神经元组分分离出的RNA表现出转录本富集，如Actγ 46,47,48,49（见图4）。相比之下，轴突/神经突片段产生的总RNA显著较低，符合其体积受限，但显示出已知定位于远端突起的转录本富集，如Gap43（见图4）。在插入片段被小心处理并以最佳密度进行板化时，对体细胞限制转录本的交叉检测极少表明区室纯度很高。

积极结果的特征包括：（1）神经元形态完整且轴突延伸清晰，（2）区室干净分离且无膜破裂，（3）经验证的引物能明显区分正负液滴，以及（4）轴突转录本的强RTddPCR信号。次优实验会导致RNA产率低、神经突组分中体球斑标记的交叉污染，或RTddPCR伪影，如引子二聚化导致的液滴“降雨”增加。这些问题通常与膜状结构损坏、刮除压力过大或底火退火温度优化不足有关。

图1：利用膜插入物进行区室特异性RNA分离概述。 啮齿动物神经元在孔径1-3微米的半透插入件上培养，允许神经突伸展同时限制体细胞。在整神经元制备中，使用无菌刮刀刮除上部细胞，沉淀后浸入TRIzol中进行RNA分离、cDNA合成和RTddPCR的溶解。插入膜上残留的细胞残渣则用无菌棉签清除。在神经突体制备中，插入膜仅含神经元体时被倒置并用手术刀切割，直接浸入TRIzol，随后进行RNA分离、cDNA合成和RTddPCR。 请点击此处查看该图的更大版本。

图2：使用RiboGreen测定法绘制的标准RNA浓度曲线。 （A） 通过RiboGreen RNA定量测定法在稀释系列RNA标准中测量了荧光强度。线性回归分析显示RNA浓度与荧光信号之间存在强相关性（R² = 0.9956）。R²值接近1，显示出RiboGreen检测在RNA定量上的优异线性和可靠性。（B） 利用方程（y=19.738x + 14.905）计算每个组分的总RNA。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3：通过PCR和琼脂糖凝胶电泳进行引物验证。 （A） 利用cDNA进行 Actγ 和 Gap43 的PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶上分辨，以评估引物特异性。对每个基因，测试了两组独立引子组（组1和组2）。DNA尺寸标记（梯形图）显示在相邻的通道中，标有分子量（10 kb、0.5 kb、0.1 kb）。预期大小的不同单条带确认了所选引物组的成功扩增和特异性。（B） 使用 Actγ 引物组2，在温度梯度（55-65°C）上进行PCR扩增，以确定最佳退火温度。扩增产物在2%琼脂糖凝胶上与DNA梯（2号通道，尺寸标示）上分辨。在测试范围内观察到预期大小的稳定单条带，最强的放大出现在55°C，表明这是该引物组的最佳温度。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4：选定转录本的RTddPCR分析及mRNA拷贝的定量。（A，B）代表性的一维振幅图，显示（A）Actγ和（B）Gap43的滴滴分离情况。每个点代表一个液滴，蓝色水滴表示正放大，灰色水滴表示负信号放大。Y轴表示振幅，X轴表示ddPCR板上的孔位。阳（蓝色）和负（灰色）滴滴的清晰分离，确认了用指示引物组检测目标转录本的稳健性。（C）总结Actγ和Gap43转录本在全神经元和神经突组分中，每μL和每ng的拷贝数。通过使用ddPCR滴滴计数绝对定量（见面板A、B）估算拷贝数。请点击此处查看该图的放大版本。

Discussion

可重复性有几个关键步骤。嵌件涂层必须均匀，以促进神经元的粘附;涂层不完整会导致神经元/轴突生长不良。细胞板密度同样重要，因为密度过高会增加树突交叉，而稀疏的板状结构则产生的轴突RNA不足。刮擦-拭子过程必须非常精确：压力过低会导致体细胞污染，压力过大则可能损坏插入件。

引物验证是另一个关键步骤。为每个转录本运行两组独立引物可以选择最可靠的引物组合，而梯度PCR则可以进一步优化退火温度。这种做法减少引物-二聚体的形成，提高液滴的清晰度，并确保在生物复制体间实现可重复的定量。虽然这种方法实现了高区室纯度，但体细胞材料中的痕迹污染仍无法完全排除。轴突RNA产率本质上较低，限制了需要大量输入的分析范围，如全转录组测序。该方法的一个关键局限是无法处理远端轴突与近端轴突的转录本定位问题。尽管在某些条件下曾报道胶质或内皮通过膜孔的延伸，但我们的培养系统将这一可能性降至最低。在成人DRG培养中，添加胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃苷（Ara-C）^5,7以及在其他神经元培养物（皮层、海马和BFCNs）中使用无血清培养基^5,45有效限制胶质和内皮细胞的增殖。此外，这里使用的刚性聚碳酸酯或聚对苯二甲酸乙二甲酸乙二酯（PC/PET）膜不具弹性，且不允许细胞主动迁移。此外，我们在DRG培养中使用3微米孔径插入物，以允许大直径轴突通过。相比之下，对于皮层或BFCN培养，我们使用1微米孔径的插入物，这进一步限制了胶质细胞的迁移。这些特性使我们的设备区别于基于PDMS的微器件，后者支持通过柔性孔隙实现内皮迁移。与之前的报告^{34、35、36、40}一致，本研究的分子验证证实轴突转录本（如Gap43）富集强烈，体细胞标记（如Actγ）检测极少，支持穿过膜的物质的神经元特异性。由于物理限制并不能完全消除胶质细胞迁移，研究人员也应将Gfap作为负性标记。

与微流控设备相比，插入系统更简单、更具可扩展性，并兼容常规培养工作流程。它避免了专用设备，同时实现了可重复的轴突-体体分离。通过将插入片段与RTddPCR结合，该方法既可接近性又高灵敏度，能够绝对定量通常低于qPCR检测阈值的转录本。该方案非常适合探测轴突转录本定位的变化，评估对发育性、神经毒性或损伤刺激的局部翻译，以及研究与神经退行性疾病或神经发育障碍相关的RNA运输缺陷。未来的改进可能包括多重RTddPCR技术以同时定量多个mRNA，或与低输入RNA测序方法整合以扩大转录组覆盖范围。此外，将该系统适应人类iPSC衍生神经元，可能将其应用于疾病建模和再生研究。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
6孔板细胞培养插入件，1.0 μm 孔径，无菌	科宁	353102	消耗品
6孔板细胞培养插入片，3.0 μm 孔径，无菌	细胞治疗	230603	消耗品
带窄刃的细胞升降机	VWR	76036-006	消耗品
CELLSTAR 6孔组织培养板	VWR	82050-842	消耗品
ddPCR 96-井板及nbsp;	生物辐射	12001925	消耗品
ddPCR滴读器油及nbsp;	生物辐射	1863004	试剂
QX200/QX100 液滴发生器的 DG8 墨盒	生物辐射	1864008	消耗品
层叠蛋白	Gibco/Fisher 科学	23017-015	试剂
LunaScript RT 超级混音套件	NEB	E3010L	试剂
用于荧光的96孔黑板微板	赛莫飞舍尔	M33089	消耗品
PCR板热封，锡箔，可穿透	生物辐射	1814040	消耗品
聚赖氨酸	西格玛	P1274	试剂
PTC Tempo 96 热循环器	生物辐射	12015382	装备
QuantaSoft 软件	生物辐射		PCR数据分析软件
Quant-it RiboGreen 试剂和 RNA 检测套件	赛莫飞舍尔	R11490	试剂
QX200 ddPCR EvaGreen 超级混合	生物辐射	1864034	试剂
QX200 液滴生成油，适用于 EvaGreen	生物辐射	1864005	试剂
QX200 液滴发生器	生物辐射	17005227	装备
QX200 液滴读取器	生物辐射	17005228	装备
三硫试剂	Invitrogen	15-596-026	试剂