柔性电磁线圈贴片增强大鼠全层皮肤伤口愈合

摘要

该方案展示了一种利用柔性铜线圈贴片在大鼠体内制造全层圆形皮肤伤口并增强其愈合的方法，该补片通过脉冲电磁场传递。

摘要

慢性和大型皮肤伤口因愈合延迟和高感染风险而带来重大临床挑战。脉冲电磁场（PEMF）疗法是一种非侵入性方法，可以促进组织修复。本研究描述了一种可重复的大鼠伤口模型方案，利用一个柔性印刷铜线圈贴片连接到定制PCB控制器，对全层背侧伤口提供局部PEMF刺激。对侧伤口作为未治疗的对照。通过定期摄影和伤口面积测量评估愈合进展情况。该方案提供了一个实用且可适应的系统，用于在 体内 评估和优化基于PEMF的治疗方法，适用于多种疾病，重点关注再生医学的局部应用和参数调整。参数选择基于正交CCK-8成纤维细胞增生筛查，测试值为0.25-1.3毫特斯拉，频率10-40赫兹，每天30-90分钟;主效应分析确定了1.3 mT、30 Hz和60分钟/天的最佳水平，并被采纳用于 体内 检测。

引言

慢性皮肤伤口（如糖尿病溃疡）成为日益严重的健康隐患，常导致愈合受损、感染^或截肢1。传统治疗可能较为漫长且费用高昂，因此人们对能够加快^{组织修复的}辅助疗法产生了兴趣。电磁场疗法就是其中一种方法，非侵入性，在临床前和临床环境中已展现出促进愈合效果（2,3,4,5）。极低频（~1-100 Hz）的脉冲电磁场（PEMFs）可以刺激修复所需的细胞过程，包括血管生成和生长因子释放^2,6,7。

例如，PEMF暴露显著加速糖尿病和健康啮齿动物的伤口闭合，通过上调成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）并增加血管生成⁸。同样，在愈合受损模型（如糖尿病大鼠）中，PEMF治疗已被证明能提高愈合速率并增强新^{形成组织的}拉伸强度9。临床上，PEMF疗法已被在慢性伤口患者中探索。一项针对糖尿病足部溃疡患者的随机试验报告了在PEMF暴露下微循环血流增强及伤口愈合加快的趋势¹⁰。总体而言，PEMF在其他伤口类型中也显示出有益效果，例如，在脉冲磁场治疗烧伤中愈合效果有所改善¹¹。这些研究共同强调了电磁刺激作为伤^{口护理辅助}疗法的潜力，8,9,10,11。

与传统有线刺激器相比，磁力驱动消除了经皮连接器的需求，并降低了硬件相关并发症的风险。无线磁系统在其他情境下实现了组织特异性刺激，例如，导电神经引导导管可以在交变磁场下产生诱发微电流，电流幅度间接由场参数¹²决定。磁性策略还可以支持血管形成——这是皮肤愈合中的关键瓶颈——因为静态或动态磁场，单独或与磁反应生物材料结合，已被证明能调节内皮行为和血管生成信号¹³。这些先例促使我们开发了一种可穿戴方法：一种共形、可拆卸的线圈贴片，在保持非侵入性和外部可编程性的情况下集中PEMF于伤口床面^12,13。在以下方案中，我们将详细介绍在大鼠全层伤口模型中实施该PEMF疗法的步骤，包括设备应用、刺激方案和结果评估。

方案

所有动物作均由江南大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。编号2025-0630S0360-915[408]）。我们用雄性服务犬大鼠（6-8周大，体重约200-250克）实施了该方案。在实验开始之前，大鼠被单独饲养，并可自由获得食物和水，按照《实验动物护理与使用指南》维持12小时的明暗循环。

1. 全层切除伤的建立

1. 准备动物和手术场。
   1. 在诱导腔内用3-4%异氟醚诱导麻醉。失去复位反射后，通过鼻锥保持麻醉在~2%。
   2. 将老鼠放在无菌手术表面上俯卧。用电动理发器刮除背侧胸椎区域（肩胛骨到腰部中部，包括侧腹）。
   3. 注意：在中线两侧至少5×5厘米的区域去除毛发，以便手术手术和线圈放置。
   4. 用70%乙醇消毒剃净部位，然后用碘含水消毒。重复乙醇/碘擦洗三次，最后用碘。
   5. 用无菌纱布覆盖手术场，只暴露计划的伤口部位。
2. 形成双侧全层切除伤口。
   1. 用无菌手术标记在背侧描绘两个直径2厘米的圆圈，分别位于前肢后方中线两侧。
      注意：确保两个圆圈大小相等且位置对称，以便动物内部比较^14,15。
   2. 用无菌剪刀或手术刀切除有标记的圆形皮肤区域。去除表皮、真皮和肉面囊，形成全层伤口（~3.14平方厘米）。
   3. 通过用无菌纱布轻柔施压实现止血。用同样的技术在对侧侧腹侧做一个相同的2厘米伤口。
      注意：伤口床应由裸露的筋膜或肌肉组成，且无残留真皮。
   4. 伤口形成后立即施用术后镇痛药（例如，皮下注射利多卡因4毫克/公斤）。
3. 分配实验组。
   1. 采用受试者内设计，其中一处伤口接受PEMF治疗，对侧伤口作为对照。
   2. 包括一个单独的队列接收一个假设备（相同的无电源线圈），以控制设备的存在。
   3. 保持未处理或假处理的控制，以区分电磁效应与处理或处理效果。

2. PEMF设备的应用

1. 包扎伤口并放置线圈。
   1. 将无菌薄纱布或半透膜直接覆盖PEMF治疗的伤口。确保伤口床得到完全覆盖。
   2. 将柔性铜线圈贴片覆盖在包扎好的伤口上（见图1）。将线圈置中，使伤口位于线圈中部下方。
      注意：线圈直径（~5厘米）可能超出伤口边缘;确保伤口保持在有效磁场区内。
2. 固定线圈。
   1. 用医用级胶带轻轻缠绕在躯干上固定线圈。保持线圈与敷料的紧密接触，但不要压迫胸部。
   2. 如果需要，可以在线圈上放置一条柔性铝条以稳定定位。避免限制呼吸或局部血流。
   3. 将引线从车身方向（例如朝向头部）拉开，以防止缠绕。
3. 进行PEMF刺激。
   1. 将线圈连接到PCB控制器（图2），并激活设备。将刺激参数设置为30赫兹频率和~1.3毫特斯拉磁场强度，持续60分钟/天。
   2. 每天同一时间进行刺激训练（±1小时），以保持间隔一致。
      注：这些参数基于正交CCK-8筛查（0.25-1.3 mT，10-40 Hz，30-90分钟/天， 见表1），确定1.3 mT、30 Hz和60分钟/天为最佳（见表2）。
   3. 在控制伤口上放置一个相同的非激活线圈1小时，以提供假治疗效果。清晰标记假线圈以避免混淆。
4. 取出装置检查伤口。
   1. 60分钟后关闭手柄。小心拆除线圈和粘合材料。
   2. 检查伤口是否有出血、水肿或不良反应。如有必要，更换无菌纱布。
      注意：线圈表面温度在1小时刺激期间保持接近环境温度;未观察到显著的加热。
5. 提供治疗后护理。
   1. 戴上伊丽莎白时代的项圈以防止自我创伤。确保合适，同时不影响呼吸和进食。
   2. 轻轻用纱布包裹后肢，减少背部伤口的抓挠。
   3. 观察大鼠直到麻醉完全恢复。继续镇痛（例如，利多卡因4毫克/公斤，每12小时服用2-3天，或按照机构方案服用）。
   4. 在研究期间（例如14天）每天重复PEMF治疗。

3. 伤口监测与数据收集

1. 拍摄伤口图像。
   1. 拍摄伤口照片，时间为受伤后0、3、7、10和14天。如有必要，应轻度麻醉以防止动物活动。
   2. 每张图像中包含测量刻度，并将相机垂直于伤口，固定距离^14,15。
2. 测量伤口面积。
   1. 使用参考尺在 ImageJ 中校准图像比例。描绘伤口边缘以计算面积（毫米²）。
   2. 记录每个时间点的伤口面积，并计算相对于基线的伤口闭合百分比。
   3. 定量比较PEMF治疗和控制伤口的情况。
3. 组织采集（可选）。
   1. 按照IACUC批准的程序，在实验终点处安乐死动物。
   2. 切除伤口组织样本，并固定在福马林中进行组织学处理。
   3. 进行石蜡嵌合和染色（如H&E、Masson三色染色）以评估胶原沉积、再上皮化和血管生成^13,16。

4. 数据分析与解读

1. 生成伤口闭合曲线。
   1. 绘制每个组伤口闭合百分比随时间变化。
   2. 计算愈合速率和预定闭合阈值所需的时间。
2. 进行统计分析。
   1. 汇总所有动物的伤口面积数据，计算每个时间点的平均标准±差。
   2. 确认正态性（Shapiro-Wilk检验）和方差均匀性（Levene检验）。
   3. 利用“治疗”和“时间”两个因素进行双因子方差分析差异。如果检测到显著相互作用，进行Tukey事后检测。
   4. 统计显著性定义为*p < 0.05，**p < 0.01。

结果

在该全层大鼠伤口模型中，通过柔性线圈贴片每日PEMF治疗，使伤口闭合速度显著加快，相较对照组更快。为严格评估效果，根据方案部分的实验设计，将大鼠分为三组：受试者内对照组（每只大鼠有一个PEMF处理伤口和一个对侧未处理伤口，数据合并分析）、假对照组（PATCH：伤口覆盖无动力线圈）和未治疗对照组（CTRL： 仅限标准伤口护理）。 图1、 图2和 图3 展示了这些组14天内的伤口愈合进展。0天时，两组对应伤口大小相等，证实初始状况一致。3天后，对照组和PEMF组均显示伤口面积减少。然而，统计分析（双向方异化分析）显示，PEMF组与对照组在早期时间点的伤口面积差异未达到统计学显著性（p > 0.05）。然而，从第7天起，PEMF治疗的伤口闭合明显快于对照组。到第7天，PEMF组的伤口明显比对照组小。这一趋势在第10天变得更加明显，当时PEMF治疗的伤口几乎愈合，而对照组的伤口仍然显著较大。到14天时...

讨论

关键步骤包括创建对称的全层伤口，确保线圈贴片平放在无菌屏障上无间隙，并保持每日持续暴露;偏离会减少田间投递，增加愈合结果的变异性。

该研究存在若干局限性，在解读发现和评估转化潜力时应加以考虑。首先，该方案在健康雄性SD大鼠（6-8周龄，体重200-250克）中表现出急性切除伤口，因此未能完全捕捉临床上受损的愈合环境，如糖尿病、缺血、感染、衰老或免疫抑制。此外，仅在 体内评估了一组PEMF参数（1.3 mT，30 Hz，60分钟/天），该方案基于 体外 成纤维细胞增殖筛查选择;最佳剂量可能因物种、伤口类型和深度、敷料或屏障厚度以及所针对的生物过程（如炎症、血管生成或重塑）而异。尽管模拟和设备设计支持局部给药，但伤口表面的有效磁场仍可能因线圈与组织间距、屏障厚度和补片排列而变化，可能导致每日剂量波动。

此外，虽然对侧受试者设计提高了效率并控制了动物间的变异，但结局可能受到对伤害和反复处理的系统性反应影响;一个包含无动力线圈（SH...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔细胞培养板	白帝	H908002	用于CCK-8检测
ADHDESION 显微镜载玻片	CITOTESTO	邮编/编号80312-3161	设备及nbsp;H&E/马森染色
镇痛药（盐酸利多卡因注射）	胡阿穆	70011657	阿片类止痛药，4 mg/kg（用于止痛）
麻醉机	后轮驱动生命科学（深圳，中国）	R520-等离子型;	带氧气供应的异氟醚蒸发器
自动免疫组化染色机	徕卡	21.2201	自动免疫组化染色
活检冲头（20毫米）	英特格拉·米尔特克斯	#33-37	圆形皮肤冲孔器，直径2厘米
数码相机	华为Mate 70 Pro	无	≥12 MP 用于创伤成像
CD31抗体	阿布卡姆	AB182981	IHC的内皮标志物（图4B）
CD34抗体	阿布卡姆	AB81289	IHC的内皮标志物（图4B）
细胞计数套件-8（CCK-8）	生物锐利	BS350B	用于体外PEMF参数筛查（OD450）
细胞培养皿（10厘米）	白帝	H802004	10厘米（100毫米）组织培养皿用于成纤维细胞培养
细胞培养基（例如DMEM+FBS）	白帝	L100-500	用于CCK-8筛查中的成纤维细胞培养
二氧化碳培养箱	热力学	BB150-2TCS-L	对于成纤维细胞培养
线圈，柔性铜	定制制造（内部制造）	无	螺旋打印线圈（直径5厘米，聚酰亚胺）
控制板（PEMF发生器）	定制（内部设计）	无	定制PCB，驱动线圈频率30 Hz，~1.3 mT
电动理发器	Wahl 或 Oster（宠物美容）	9160型及nbsp;	用于剃毛的动物美容剪
伊丽莎白时代的项圈（啮齿动物）	MukeBio	MK-EC-01	防止伤口干扰
嵌入站	Epredia HistoStar	A81000002	组织学处理（如已进行）
口罩	维登	V531596	保持麻醉
成纤维细胞（细胞系L929）	Procell	CL-0137	用于CCK-8增殖筛查的细胞
有限元仿真软件（例如，COMSOL Multiphysics）	COMSOL	CM010004	磁场仿真（图5B-C）
柔性铝条式夹板	亲爱的	1592	防止线圈位移的支撑
镊子	雄伟	01625	手术时处理皮肤和敷料
血液素与伊欧辛（H&E）自动染色和封层 uni	DRS-棱镜-P+薄膜	61770249	用于常规组织学染色的消耗品
图像分析软件	美国国立卫生研究院	版本 1.54	用于伤口面积测量（例如，ImageJ）
图像分析软件	美国国立卫生研究院	版本 1.54	用于伤口面积测量（例如，ImageJ）
感应室	后轮驱动生命科学（深圳，中国）	802-00132-00	异氟醚麻醉诱导
红外热成像相机	HIKMICRO	H11	监测线圈表面温度（图5A）
碘聚维酮消毒剂 10%	海诺特	无	皮肤消毒剂（碘素）
异氟醚	后轮驱动生命科学（深圳，中国）	20037015	吸入麻醉剂（USP级）
利多卡因注射 10%	桑马	无	术后止痛
马松的三色染色套件	巴索	C250202	用于胶原蛋白/ECM可视化的消耗品
医疗皮肤标记与尺	通道斯	无	伤口照片中包含比例
微板读器	热力学	A51119500C	用于CCK-8测定中的OD450测量
切片机	Epredia HM 340E	23900670	组织学/IHC切片（如果进行）
聚甲醛组织固定剂	分享简介	SB-C009	动物组织标本的固定
老鼠饲养笼	凤桥	CP-JM	标准的老鼠笼子用于单独饲养。
Rats，Sprague Dawley（雄性，6岁及ndash;8周）	魏景宇苏州	SCXK2024-0004	200–250克;单独住宿;IACUC批准的使用
手术刀	金环	35W0602	用于切除伤口的创立
半透膜涂料	ZD	Q20189	替代伤口屏障
统计分析软件（例如 GraphPad Prism 或 R）	软件马凯夫	10.6.9(890)	双因子方差分析及事后多重比较
无菌纱布	ZD	3141626	伤口敷料/保护屏障
无菌手术布	ZD	V271617	皮肤准备后为手术区域布置
外科剪刀	雄伟	01627	用于切除伤口的创立
注射器和针头	米南克	20193141643	用于皮下止痛
整片扫描仪	3DHISTECH	无	数字幻灯片扫描