该方法概述了一种新型的开发流程 体外 结合3D打印腔室与实验室自制硅胶膜的蜱虫吸血系统。该系统可实现蜱虫的人工饲喂，便于在不同吸血阶段进行简便取样，并仅需少量血液，为研究硬蜱科蜱虫提供了极为宝贵的工具。
本文内容
摘要
摘要
本研究展示了一种通过人工硅胶膜进行蜱虫饲喂的详细实验方案，该系统采用高分辨率光敏聚合物树脂3D打印制成的饲喂室。该方法包括饲喂室的设计、硅胶膜的制备、系统的组装以及优化的蜱虫饲喂条件。蜱虫是美国及全球范围内主要的疾病传播媒介之一，开展蜱虫研究对于制定有效策略以预防和降低蜱传疾病的发病率至关重要。作为专性吸血外寄生虫，蜱虫必须摄取血液才能存活，并在此过程中传播病原体，因此血液摄食是研究媒介-宿主相互作用、病原体传播以及蜱虫生物学、生理学和解剖形态学的基本环节。过去数十年间，基于硅胶膜的蜱虫饲喂系统已被广泛使用并不断优化。然而，许多现有系统仅适用于单一蜱种、特定发育阶段或特定实验条件。本方案所描述的蜱虫饲喂系统已成功应用于美国多种最重要的蜱传病媒介物种，获得部分吸血及完全饱血的蜱虫样本，包括 Amblyomma americanum, A. maculatum，Ixodes scapularis，以及 Rhipicephalus sanguineus 成年个体。该系统在启动摄食行为方面已显示出成效 Dermacentor variabilis 成虫和若虫 A. americanum，具有最高的摄食率（>85%）在成人中观察到 A. americanum因此，本研究开发的饲血装置可适用于低至100 µL的不同血液样本，这在病原体传播和毒理学研究中至关重要。该装置配备的透明盖板高度最小化，便于在整个蜱虫饲血过程中持续观察蜱虫状态。
引言
蜱虫是专性吸血的体外寄生虫，可携带并传播多种病原体，包括细菌、病毒和寄生虫，这些病原体在全球范围内导致人类和动物疾病1,2,3,4在美国，其作为头号疾病传播媒介，在世界其他地区仅次于蚊子2,3,5，多种蜱类可传播病原体相关疾病，而其他一些蜱种还被证实可引发非传染性疾病，例如α-半乳糖综合征（AGS，又称红肉过敏），近年来全球范围内关于该病的报道日益增多6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16研究旨在深入了解蜱虫的生物学、生理学、遗传学及传播病原体的能力，这对于制定策略以减轻蜱传传染病和非传染病所带来的经济与公共卫生负担至关重要。研究蜱虫与宿主相互作用通常需要部分吸血或完全饱血的蜱虫，以回答特定的科学问题。这可通过活体动物饲喂实现，使蜱虫完成其完整的生活史。17. 尽管使用活体动物进行蜱虫饲喂在建立和维持蜱虫种群方面非常有效18,19，其实施可能具有挑战性，并且由于宿主可获得性的限制和设施管理规定，可能并不适用于所有研究假设。最重要的是，该方法的成功实施需要 体外 蜱虫取食系统有助于减少活体动物的使用，这是“动物使用替代（3Rs）”框架（替代、减少、优化）下科研的重要目标20.
在研究中使用人工膜蜱饲血系统具有诸多优势，为广泛科学问题的探究提供了广阔机会。这些优势大致可归纳为三类：（1）利用不同血液来源评估宿主血液变异及媒介-宿主相互作用的影响，例如在饲血过程中研究蜱产生α-半乳糖（alpha-gal）的情况21；（2）通过在血液中添加化合物评估杀螨剂的毒性22，以及在吸血过程中回收蜱分泌的化合物23；（3）通过在自然吸血过程中传递病原体来评估媒介传播能力24,25,26,27等。此外，人工膜饲血系统的特性使其能够在小规模和小体积条件下进行多种处理和浓度的大规模测试，避免引入与宿主相关的变异，从而减少对活体动物的需求。
通过人工膜进行蜱虫饲喂的系统已广泛应用于研究及支持蜱虫种群的饲养19,28,29在某些情况下，可完成蜱虫漫长的生命周期30,31. 已有多种针对不同蜱虫物种的蜱虫饲喂系统及其材料优化方案被报道32,33,34然而，众所周知 体外 蜱虫的吸血行为可能因系统条件、所用材料以及最重要的蜱虫种类和发育阶段而表现出高度差异34此外，许多系统依赖大量血液，例如连续流系统27，虽然效果显著，但由于需要大量血液而成本较高。本方案详细介绍了一种人工膜蜱虫饲喂系统，该系统已在美国五种不同蜱传病媒介蜱类的成虫阶段成功应用。包括 美洲钝眼蜱、孤星蜱、肩突硬蜱、血红扇头蜱和 Dermacentor variabilis
方案
蜱虫饲喂实验使用市售的去纤维蛋白牛血（Hemostat Laboratories，CA，USA）和去纤维蛋白人血（Bioivt，CA，USA）进行，这些血液的采集和处理均遵循机构动物护理和使用委员会（IACUC）以及机构审查委员会（IRB）批准的方案和指南。本研究中未使用任何活体脊椎动物进行蜱虫饲喂。本方案中使用的所有蜱虫均购自俄克拉荷马州立大学蜱虫饲养设施。所用试剂和设备列于材料表中。
1. 蜱虫取食室
- 使用免费的3D设计软件设计腔室，使其适配35 mm × 10 mm的培养皿。打印部件（图1A）的尺寸如下：腔体主体（部件 i）25 mm（内径）× 20 mm（高），底部壁厚3 mm，顶部盖环（部件 ii）30 mm（内径）× 5 mm（高），壁厚3.5 mm，外环（部件 iii）31 mm（内径）× 5 mm（高），壁厚3 mm。
注意：盖环顶部包含四个圆形开口，尺寸为3 mm（直径）× 2 mm（高），用于放置磁铁。腔室顶部也有相同尺寸的开口，用于固定磁铁（图1B）。3D模型设计应保存为.stl文件格式，这是最常见的3D打印文件格式。本方案所用3D设计文件可根据请求提供。 - 使用10" 14K LCD 3D打印机，采用灰色或白色光敏树脂（图1A）打印腔室，或使用其他可基于.stl文件打印三维模型的高分辨率3D打印机或打印服务。
注意：本方案使用了亚利桑那大学的打印服务和树脂。使用高分辨率树脂可确保制造出细节清晰且耐用的腔室。 - 佩戴手套，组装前通过清洗并视需要使用细砂纸（180至200目）轻轻打磨，确保各部件表面无树脂残留。确保部件 i（图1A）的平底面光滑，以保证硅胶膜能够良好粘附，降低泄漏风险。
- 将所有干燥部件暴露于紫外光下照射10分钟，以确保树脂完全聚合。
注意：大多数使用有毒树脂进行3D打印的服务会采用紫外光固化树脂（使模型硬化并消除树脂毒性）；但有时仍可能存在“未完全固化”的情况。未完全固化的模型触感仍略带黏性，并可能残留未聚合的树脂，接触时可能具有毒性或引起刺激。额外的紫外光照射可确保树脂完全硬化。 - 使用透明环氧树脂胶将3 mm × 2 mm的圆形磁铁粘接到腔室顶部和盖环的狭缝中。在室温（20–25 °C）下静置过夜干燥（至少16小时）。确保磁铁的磁极方向一致，以便与盖环上部磁铁的磁极相互吸引（图1A，部件 ii）。
- 按图1A–C所示，组装所有部件，以确认各组件配合良好。
2. 膜制备
- 将一块 30 cm × 30 cm 的塑料保鲜膜平铺在干净的表面上，并通过在平坦表面上拉伸并用胶带固定边缘，确保其无皱褶（图 2Ai）。
- 在一块延展的塑料/保鲜膜上，间隔 5 cm 放置 4–5 张单层镜头清洁纸（图 2Aii）。
- 使用以下提供的组分和用量制备硅胶膜。
注意：该用量足以制备 4–5 片（7 cm × 12 cm）的膜，每片可容纳 5–6 个饲喂腔室，总计 20–30 个腔室。 - 将 15 g 硅胶透明密封胶（20–25 Shore A 硬度）与 4.5 g 硅油（占总硅胶量的 30%）和 2.9 g 正己烷（占总硅胶量的 19.3%）混合，制备硅胶混合物。将各组分放入塑料称量皿中，用刮刀轻轻搅拌混合（图 2Aiii）。
注意：为尽量减少气泡产生，请轻柔混合各组分。 - 沿镜头纸较短的一边涂抹 2–3 g 硅胶混合物，以将其固定在保鲜膜上。静置 5–10 秒，使硅胶渗透过镜头纸（图 2Aiv）。
- 使用直边工具（如培养皿盖、直尺或刮刀）沿镜头纸表面均匀涂布硅胶混合物。确保所用工具覆盖镜头纸的整个区域（图 2Av）。此举可在单次操作中完成硅胶覆盖，避免膜表面出现褶皱和波纹。
- 为确保膜中使用全部硅胶混合物，将涂布工具返回起始位置再次涂布。由于部分硅胶会残留在涂布工具上，返回收集残留物可确保所有硅胶被充分利用，避免出现空隙（图 2Avi）。
注意：膜应呈现均匀半透明状，无波纹（图 2B）。 - 通过增加或减少硅胶混合物的用量，初步制备不同厚度的膜，因为膜的厚度需待其干燥后方可测量。
- 将膜在室温（20–25 °C）下静置过夜自然干燥（至少 16 小时）。
- 使用数字外径千分尺测量膜的厚度。不同厚度的膜适用于不同成年蜱种，膜厚度范围从适用于短口器蜱种的 70 µm 至适用于长口器蜱种的 200 µm。
- 拆下先前组装的腔室各部件，并在腔室底缘涂抹硅胶粘合剂。为精确施加胶水，使用 1 ml 注射器吸取硅胶粘合剂（图 2Ci）。
- 在注射器前端安装一个 200 µL 移液枪头（代替针头）用于施胶（图 2Cii），并像安装针头一样将其旋紧在注射器末端（图 2Ciii）。此方法可实现对每个腔室底缘的精细施胶（图 2Civ）。
- 将腔室置于膜上（图 1，部件 i），并放置配重物体以确保其稳固贴合。在室温（20–25 °C）下静置过夜（至少 16 小时）（图 2D、E）。
注意：可使用任何平整的配重物体。本方案使用了一块 2.5 kg 的亚克力板（图 2E）。 - 使用弯头剪刀修剪腔室周围多余的膜（图 3A）。
- 在将腔室用于蜱饲喂前，去除膜制备区域（步骤 2.1）残留的塑料保鲜膜（图 3B）。
- 将腔室各部件重新组装，底部放置一个 35 mm × 10 mm 的培养皿，并将皿盖倒置后置于磁铁之间，作为腔室的盖子（图 3C、D）。
注意：应倒置使用皿盖，因为倒置后盖子与盖环完全匹配（参见 图 3C、D 中的部件说明）。 - 使用 35 mm × 10 mm 培养皿的底部部分盛装蒸馏水，浸泡腔室膜。在室温（20–25 °C）下浸泡过夜（至少 16 小时）。由于膜初始具有疏水性，饲血前预先浸泡可有效减少气泡滞留。
注意：若无气泡产生，表明疏水性已被消除。
3. 蜱虫吸血与血液制备
- 在第2.16步中提到的每个腔室（来自35 mm × 10 mm培养皿）的盖子上（图1A中的部分iv）制作2–3个小呼吸孔（图3E）。使用加热的金属解剖刀或细金属刮勺在盖子上穿孔以形成呼吸孔。
注意：呼吸孔可使湿度在腔室内部保持稳定。 - 向血液中添加硫酸庆大霉素，使其终浓度为50 µg/mL。仅向计划在1周内使用的血液中添加抗生素，并于4 °C保存。添加抗生素前后，均应将牛血（或其他动物血液）保存在4 °C。
- 将2–3 mL血液置于洁净的35 mm × 10 mm培养皿中，然后将腔室放置其上。通过旋转调节环（图1A中的部分iii）调节腔室高度，以增加或减少每个腔室所用的血液量。调节腔室高度，使培养皿底部与膜之间保留1–2 mm的空间。参见图4A中的品红色箭头作为参考。
注意：腔室的调节环设计可控制所用血液体积。即，培养皿底部与膜之间的空间越大，填充该空间所需的血液体积也越大。 - 将未吸血的蜱虫以相等数量的雄性和雌性放入腔室中。确保腔室内始终包含两种性别，因为这可能影响取食率（图4B显示腔室内有4只雄性和4只雌性成虫A. americanum）。每个腔室最多使用10–15只蜱虫（成虫阶段），以便于操作。
注意：处理未成熟阶段蜱虫时，数量更高（每个腔室20–50只若虫，本方案未展示）。 - 将腔室置于带盖的干浴器中，在37 °C ± 1 °C条件下培养，并配备湿度源（例如，盛水杯），以维持相对湿度为63% ± 2%（图4C），并在12小时光照:12小时黑暗的光周期下进行。
注意：这些条件可能因蜱虫种类和实验室环境而异；必要时可尝试其他湿度设置，并评估适用于本实验室的最佳条件。
4. 更换血液和腔室
- 准备两个喷瓶，分别装入用于在更换血液之间冲洗膜的溶液。在第一个瓶中加入含0.005%制霉菌素的蒸馏水溶液；在第二个瓶中加入蒸馏水。
- 12–16小时后，准备新的培养皿并加入新鲜血液，在放置孵育室之前将其置于37 °C的干浴中。
- 当新鲜血液正在预热时，将孵育室从用过的血液中取出，用蒸馏水冲洗膜的下表面3–5秒，然后用0.005%制霉菌素溶液冲洗3–5秒，以防止真菌污染。再次用蒸馏水冲洗膜，以去除残留的制霉菌素。
注意：此过程耗时少于5分钟，不会影响附着在膜上表面的蜱虫摄食。 - 将所有用过的血液和冲洗液弃入含有0.5%次氯酸钠溶液（10%漂白剂）的容器中。血液废弃物应按照机构安全规程进行处理。
- 冲洗后，将孵育室放入含有新鲜血液的新培养皿中。
注意：若无污染且无泄漏，孵育室可在清洗前使用2–3个月。孵育室和膜使用超过3个月而不清洗会变脏，并增加污染风险，导致蜱虫摄食率下降。孵育室可重复使用至多1.5年（约10次清洗周期）。 - 通过将孵育室置于0.5%次氯酸钠溶液（10%漂白剂）中最多30分钟，然后用洗洁精清洗，以实现重复使用。请勿将孵育室长时间暴露于漂白剂中（>30分钟），因为其气味会降低蜱虫附着率，并可能随时间削弱树脂结构的完整性。
注意：长时间接触漂白剂会使孵育室在湿润时变软，在干燥后变脆，从而导致破裂。根据反复观察，这使得孵育室的使用寿命不超过4–5次清洗周期。连续使用未经清洗的同一孵育室（最长3个月）可使蜱虫更快附着（放入孵育室后1–3天），而刚清洗过的孵育室通常需要更长时间（常为>7天才附着）。这可能是由于先前在孵育室内摄食的蜱虫排泄物及其他聚集信息素的气味所刺激所致，从而促进蜱虫摄食35,36。
结果
每种蜱虫物种的膜厚度。
在以下成年蜱虫物种的膜厚度条件下观察到最高的蜱虫饲喂率：Amblyomma americanum 100–200 µm；A. maculatum 100–250 µm；Rhipicephalus sanguineus 70–100 µm；Ixodes scapularis <150 µm，Dermacentor variabilis <150 µm。所有蜱虫物种在饲喂期间均保持相同的温湿度条件（63% RH 和 37 °C）（表 1）。
本方案中使用的蜱虫与血源
所有蜱虫均来自俄克拉荷马州立大学蜱虫饲养设施，并在以下条件下维持培养： >20 °C下相对湿度为90%，光照周期为12小时光照/12小时黑暗。所有蜱虫均以去纤维蛋白牛血或人血饲喂，作为一项研究不同蜱种中α-半乳糖（αGal）水平的科研项目的一部分。本研究在该研究团队开展的更广泛的α-半乳糖综合征（AGS）项目框架内，比较了不同血液来源对蜱虫摄食的影响。本文描述的大多数蜱虫标本在完全吸血前即进行解剖，以对部分吸血的蜱虫（吸血2–5天）开展αGal定量分析。仅一部分 Amblyomma americanum 蜱虫（不用于αGal定量的个体）被允许吸血至完全饱食。尽管本文未提供牛血饲喂与人血饲喂蜱虫取食率的详细比较，但值得注意的是，完全饱食（即在允许延长吸血时间的蜱虫中（n = 35），有15只达到完全饱血，吸血成功率为42.8%。其中，9只吸食牛血，6只吸食人血（牛血组成功率为60%，人血组为40%）。
蜱虫摄食速率与蜱虫摄食成功率
本研究中蜱虫的摄食率是根据部分摄食蜱（摄食2–5天）的获取情况确定的，而摄食成功则定义为完全饱血，通常以雌蜱盾板颜色变化为标志（相关数据仅适用于 Amblyomma americanum）。雄性蜱的取食率定义为持续取食超过2天（2–5天）。总体取食率通过整合蜱在牛血和人血上取食的数据，计算在装置中放置的蜱中完成2–5天取食或完全饱血的百分比得出。未附着或在放置后死亡的蜱 <计算摄食率时考虑了2天的附着时间。尽管未提供关于血液来源对蜱虫摄食率影响的定量数据，但这一观察证据表明，在2至5天的摄食期间，大多数蜱虫种类在牛血与人血之间的附着率和摄食率并无显著差异。例外情况出现在 Rhipicephalus sanguineus，其在第3至第5天对人血的摄食率低于牛血。所有蜱种利用该方法实现部分摄食和完全饱血的摄食率 体外 蜱虫饲喂系统的总结见于 表1.
Amblyomma americanum 雌蜱体重及吸血阶段分类
部分吸血的雌性 A. americanum 根据吸血天数分为以下阶段：(1) 未吸血，(2) 吸血 2–3 天，(3) 吸血 4–5 天，以及 (4) 饱血（图 5）。饱血阶段包括处于快速吸血期初期的蜱（体重范围为 48.9 mg 至 109 mg）和完全饱血的蜱（体重范围为 272.7 mg 至 348.7 mg）。
图 1：蜱虫取食室——3D 模型及带膜的打印组件。分解式 3D 模型与最终组装完成的取食室，展示各独立组件：(i) 室体（蜱虫容纳部分），(ii) 盖子固定环，(iii) 高度调节环，(iv) 40 mm × 10 mm 培养皿盖，以及 (v) 含血液的 40 mm × 10 mm 培养皿底部（A）。3D 打印模型的组装结构及各部件尺寸（单位：mm）（B）。使用灰色 8K 分辨率树脂打印的组装完成的取食室（C）。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：硅胶膜及腔室组件的制备。（i）用胶带固定一张 30 cm × 30 cm 的塑料薄膜，确保无可见褶皱；（ii）将若干张镜头清洁纸平铺于薄膜上，彼此间距约 5 cm；（iii）使用刮刀以环形动作轻柔混合硅胶组分；（iv）沿每张镜头纸边缘涂抹 1–2 g 硅胶混合物以固定纸张；（v）使用大于纸张的直边工具将硅胶混合物均匀涂布于镜头纸上（图中显示为玻璃盖边缘）；（vi）注意涂布过程中硅胶混合物量的减少，应将残留在工具上的硅胶回收并重新分布，以确保覆盖均匀（A）。正确涂布的膜应无气泡或缝隙（B）。注射器的准备以用于胶水涂布：（i）将硅胶胶水装入 1 mL 注射器中；（ii）将 200 µL 移液枪头插入注射器前端；（iii）旋紧移液枪头以确保密封不漏；（iv）将胶水涂于部件 i 的底面边缘处（C）。将腔室置于干燥后的膜上（D），并在其上方放置一个重物（一块重 2.5 kg 的厚丙烯酸块；品红色箭头所示），以确保牢固粘合（E）。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：使用前腔室和膜制备的最后步骤。使用弯曲的小剪刀修剪腔室周围膜的边缘（A），在使用腔室前去除塑料包裹膜（B），最终模型组装（C），将腔室置于含有水的40 mm × 10 cm培养皿中，并使用培养皿盖作为腔室盖（D）（编号i-v表示如图1A中所指定的部件），以及显示有呼吸孔的腔室盖（由品红色箭头指示）（E）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：血液饲喂装置与蜱虫放置方法。将实验腔室置于盛有血液的培养皿中，图中高亮显示高度调节环（品红色箭头）（A）。腔室内部视图，其中包含数量相等的雄性和雌性蜱虫（B）。将蜱虫腔室置于干燥浴槽中，并配有湿度源，以维持相对湿度为63% ± 2%，温度为37 °C ± 1 °C（C）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5：Amblyomma americanum 取食过程中的体型与体重变化。图中显示了未取食蜱虫的体型以及部分取食蜱虫的平均体重。图像代表了在各取食时间点记录的平均体重所对应的典型样本。附表列出了每个取食时间点的平均体重、标准差、分析蜱虫数量、中位数以及第一和第三四分位数。取食2–3天的蜱虫体重范围为7.4 mg（最小值）至19.2 mg（最大值）。取食4–5天的蜱虫体重范围为20.6 mg至44.8 mg。处于快速饱血期初期及完全饱血的蜱虫体重介于48.9 mg至348.7 mg之间。图像显示附着的A. americanum雌性蜱虫：取食4–5天的雌性（黄色箭头），以及完全饱血的雌性（品红色箭头）。请点击此处查看该图的放大版本。
| 蜱虫种类及性别 | 吸血蜱数 / 放入 chambers 的总蜱数（死亡蜱数） | 吸血率（第2–5天附着的蜱） | 平均重量（mg）（标准差） | 使用的膜厚度（μm） |
| A. americanum 雌性 | 85/97 (12) | 87.60% | 37.3 (54.40)* | 100 - 200 |
| A. americanum 雄性 | 19/22 (2) | 86.30% | 未记录 | 100 - 200 |
| A. maculatum 雌性 | 45/66 (21) | 68.20% | 122.4 (141.65) | 100 - 250 |
| A. maculatum 雄性 | 36/47 (11) | 76.60% | 未记录 | 未记录 |
| R. sanguineus 雌性 | 34/60 (26) | 56.60% | 未记录 | 70 - 100 |
| I. scapularis 雌性 | 15/23 (8) | 65.20% | 未记录 | <150 |
| *对部分以牛血饲喂的 Aa 成年雌性蜱（n=35）评估的吸血成功率是 42.8% | ||||
表1：蜱虫摄食率与平均体重。
补充图1：对已附着在3D培养室特定位置的单个蜱虫进行小体积（100 µL）喂食。将一个小型PCR管用硅胶粘附在人工膜底部，并加入100 µL血液。请点击此处下载该文件。
讨论
蜱虫人工膜饲血系统是蜱虫研究中极为有效的工具，已在许多研究实验室中被广泛用作活体动物饲喂的可行替代方法28,29。这些系统的主要价值在于能够通过血液餐传递或回收多种物质，包括病原体、杀蜱剂、蜱源性化合物以及其他调节性分子22,23,25,27。优化人工膜饲血系统有助于建立可持续的蜱虫种群繁育体系，从而减少对活体动物的依赖。
的 体外 本方案中所述的蜱虫饲喂系统在成虫阶段尤为成功 Amblyomma americanum 和 Ixodes scapularis蜱虫取食成功率定义为成功完成取食并充分吸血膨胀的蜱虫所占的比例（或百分比）。然而，对于大多数研究蜱虫生物学或生理学的实验室而言，部分取食的蜱虫（通常在开始取食后3–4天）通常已足以满足特定的实验假设。在本人工膜饲喂系统方案中，为实现α-半乳糖（αGal）项目中的特定研究目标，“蜱虫取食率”指获得部分取食的蜱虫（取食2–5天），“蜱虫取食成功”则指完全吸血膨胀。 A. americanum. 最高摄食率出现在 A. americanum 女性（87.6%），其次为 A. americanum 雄性（86.3%） A. maculatum 女性（68.2%） A. maculatum 男性（76.6%） I. scapularis 女性（65.2%），以及 R. sanguineus 女性（56.6%），而 A. americanum 取食成功率为42.8%（表1）。部分吸血的雌性 A. americanum 根据摄食天数分为4个类别（摄食阶段），分类方法经此前文献修改如下21：（1）未进食，（2）部分进食2–3天，（3）部分进食4–5天，以及（4）饱食图5）。饱血取食阶段包括进入快速饱血期初期的蜱虫（体重范围为48.9 mg至109 mg）和完全饱血的蜱虫（体重范围为272.7 mg至348.7 mg）（图5）。这种人工膜喂食系统使同一研究团队及其合作者得以开展多项研究，通过在牛血中使蜱部分吸血，随后用这些蜱感染小鼠，以验证α-半乳糖综合征（AGS）——一种由蜱叮咬引发的红肉过敏症——的传播假说，并用于N-糖组学研究。11,21,37个体化装置的便利性支持使用不同的血液来源，而透明盖子和较矮的腔室设计便于在解剖显微镜下观察蜱虫取食过程，且对工作距离要求较低。
湿度（从水浴90%相对湿度改为干浴63% ± 2%相对湿度）、温度（从37 °C降至35 °C再回升至37 °C）以及膜厚度的近期调整表1）已成功实现了多种蜱虫的喂养。尽管温度和相对湿度（RH）是需要控制的重要变量 体外 蜱虫取食过程中，膜的厚度和强度是确保不同蜱种成功取食的关键因素33,38必须考虑到，口器较短的蜱虫，例如 Rhipicephalus sanguineus 和 Dermacentor variabilis，将需要比具有长口器的物种更薄的膜39，例如 Amblyomma 属蜱虫 和 Ixodes spp. 最高的蜱虫取食率出现在 Amblyomma americanum 和 A. maculatum 在膜厚度为100–200 µm时； Rhipicephalus sanguineus 厚度为70–100 µm时； Ixodes scapularis 在厚度方面 <150 µm，以及 Dermacentor variabilis <150 µm (表1）。人工膜蜱饲血过程中一个需要注意的关键因素是，摄食率的波动仍然会发生。在此系统中，温度的微小变化 即， 从37 °C降至35 °C，并在数天后恢复至37 °C，通常可提高或恢复蜱虫的摄食率。此外，将干浴改为水浴也可获得类似效果 Amblyomma 种（spp.）和 Ixodes scapularis，然而，这一效应在……中未被观察到 Rhipicephalus sanguineus在干燥浴中，63% ± 2% 相对湿度条件下效果更佳。
其他人工蜱饲喂系统，例如基于Ueti, M.等人开发的五组分连续流动系统的改良系统. （美国农业部农业研究局）随后由Yamasaki, Y.等人针对其他蜱种进行了改进， 已表现出高效率，持续获得较高的蜱虫取食成功率27,40然而，对于需要频繁打开系统以解剖部分吸血蜱虫的研究而言，这些装置的适用性较差，因为反复开启和关闭蜱虫饲养室可能较为繁琐。本方案描述的3D打印饲养室配备磁性安全锁盖和独立的培养皿，可在不干扰整体设置的情况下方便地操作和观察蜱虫吸血情况。透明盖子可实现无干扰的可视化监测，并能牢固地固定在饲养室上 通过 嵌入式磁铁，与最常见的蜱虫饲喂系统（如 Kröber 和 Guerin 原始设计所优化的系统）不同22,29，其中若不将饲血装置从血液中取出便无法进行个体观察，因为所有饲血单元都集成在同一块板上，且用于防止蜱虫逃逸的方法也不允许进行观察。此外，这一 体外 蜱虫喂养系统可进一步优化，以递送更小且部位特异的血液体积。例如，当雌性蜱虫在特定取食位点附着后，可将底部培养皿替换为微型储液装置，如100 µL PCR管的上半部分，其中盛装少于100 µL的血液，并置于附着区域正下方补充图1）。这种低容量饲喂方法将有助于深入研究病原体的获取与传播机制，以及蜱虫毒物和宿主来源抗体对蜱虫的影响。本方案已成功用于获取多种成年蜱种的部分吸血个体。在本研究中，未评估产卵率和完全饱血率；然而，目前正在进行进一步优化，旨在获得蜱虫后代，这一目标有望通过以下方式实现 Amblyomma americanum 和 Ixodes scapularis 基于初步观察。该系统最具创新性的特点或许是其在小规模实验操作中的灵活性，既可实现对处理方式和环境条件的可控性调节，又可支持群体培养应用。
体外蜱虫饲喂是研究蜱虫生物学、生理学及传播能力的科研人员的重要工具。然而，人工膜饲喂蜱虫是一项耗时且费力的工作。本方案采用一种带有安全锁定系统的3D打印饲喂室和一种简易实验室自制的膜，一旦饲喂室打印完成且膜制备妥当， setup 过程将变得简单，并可长期重复使用。此外，通过调节膜的厚度，该系统可有效适用于不同蜱虫物种。进一步优化饲喂室尺寸和膜厚度后，该系统还可应用于蜱虫的不同发育阶段。
披露
作者声明不存在与本文所述研究相关的物质财务利益。
致谢
作者谨此感谢本科生及工作人员Kara Golden、Sydney Ingham和Omayma Jaddou Najma在蜱虫饲喂以及蜱虫饲养室和膜装置搭建过程中所付出的辛勤努力。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 鲁尔锁注射器 | BD | 309628 | 鲁尔锁接头尖端 |
| 高级透明硅胶 | 通用电气 | 2810435 | 透明硅酮密封胶。该密封胶在固化后可形成防水屏障。 |
| 透明环氧树脂胶 | JB Weld-透明 | B009EU5ZM0 | 亚马逊产品编号 |
| 透明食品保鲜膜（ cling seal ） | 格拉德 | CLO00020 | |
| 去纤维牛血 | 止血实验室 | DBB100 | |
| 去纤维蛋白人血 | BioIVT | ||
| 一次性刮勺 | LevGo, Inc. | 17211 | 亚马逊产品编号 |
| 干浴孵育器 | ONiLAB 科学 | HB120-S | 亚马逊产品编号。将加热块倒置以获得一个平坦的表面。 |
| 硫酸庆大霉素 | Millipore Sigma | G3632-5G | |
| 镜头清洁纸 | 蒂芬 | EK1546027T | |
| 200 微升移液器吸头 μL | Biotix uTIP | 63300057 | 用于注射器的硅胶密封胶涂敷器 |
| 腈类手套 | 激励 | COBALT-OG | 亚马逊产品编号 |
| 制霉菌素 | Fisher BioReagents | BP2949-5 | |
| 35 mm × 10 mm 培养皿 | Falcon | 351008 | |
| Phrozen Sonic MEGA 8K V2 树脂打印机 | Phrozen | B0F9NBXVVT | 构建体积为 320 x 175 x 300 mm。若优先选择内部打印，可通过亚马逊购买 |
| Pro 8K 光敏聚合物 树脂 水性 灰色 | Phrozen | 通过亚利桑那大学 | 低收缩性。高质量 &以及具有8K分辨率的极为复杂精细的3D模型。 |
| 3 mm × 2 mm 圆形磁铁 | Mealos | B08NZTN426 | 亚马逊产品编号 |
| RPG光敏树脂 烟白色 | Phrozen | 通过亚利桑那大学 | 高质量 &且具有极其复杂的三维模型，柔韧性极佳，弯曲性能出色。 |
| 硅油 | Millipore Sigma | 378321-250ml | |
| Tinkercad 免费 3D 软件设计 | Tinkercad | N/A | https://www.tinkercad.com |
| 称量舟（100 mL 容量） | 普拉蓬塔 | mdo-azoc-1030 |
参考文献
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