标准化的不稳性诱导动物模型用于骨关节炎的临床前研究

摘要

本方案旨在建立适用于骨关节炎研究的合适动物模型。

摘要

膝骨关节炎（OA）是全球最常见的关节疾病，给全球公共卫生带来重大负担，因此推动了针对其发病机制和治疗策略的广泛研究。尽管已有大量研究，但在模型建立方面仍缺乏标准化的方法。为此，我们提供了完整的、可重复的实验方案，用于建立不稳定性诱导的骨关节炎动物模型，具体包括小鼠内侧半月板失稳（DMM）模型和大鼠内侧半月板撕裂（MMT）模型。此外，我们还描述了一种简单且易于实施的术后疼痛阈值和空间步态稳定性评估方法，旨在促进骨关节炎临床前研究中的方法学一致性。组织学和行为学验证结果证实了两种模型的成功建立：与对照组相比，DMM和MMT组的国际骨关节炎研究学会（OARSI）评分显著升高，步长发生明显改变，机械性疼痛阈值显著降低，表明关节退变和痛觉过敏程度显著。这些验证结果凸显了两种模型的可重复性和转化应用价值。通过提供详细的视频记录，本研究推动了实验操作的标准化，有助于实现不同实验室间的一致性，从而提高骨关节炎研究结果的可靠性和可比性。

引言

骨关节炎（OA）是一种高度常见的退行性关节疾病，也是全球范围内导致残疾的主要原因之一^1,2。尽管已有大量研究，但有效的骨关节炎疾病修饰药物（DMOADs）的开发进展仍相对缓慢³。目前普遍认为，OA 是一种多因素疾病，涉及包括关节软骨、软骨下骨、肌腱和滑膜在内的多种关节周围组织的复杂病理变化^4,5。要对 OA 的多种病理过程开展有效的临床前研究，必须使用定义明确且合适的动物模型。尽管已有多种 OA 动物模型被建立并报道^{6,7,8,9,10,11}，但许多研究仍在使用不合适的动物模型，限制了其研究结果的转化价值。为解决这一问题，我们以视频形式展示了标准化的不稳定性诱导型 OA 模型，包括可重复的内侧半月板失稳（DMM）和内侧半月板撕裂（MMT）操作流程，旨在为骨关节炎的临床前研究和模型标准化提供实用参考。

如先前研究报道，半月板不稳定是临床病例中导致膝关节退变的主要因素。因此，在小鼠和大鼠中通过手术诱导半月板不稳定，是实验性诱导骨关节炎（OA）的有效方法。在此，我们介绍两种典型的由不稳定诱导的OA模型，包括小鼠的DMM模型和大鼠的MMT模型。其中，小鼠DMM模型在研究OA的分子机制方面具有重要价值，因为小鼠易于进行转基因操作，且该模型表现出渐进且持久的疾病进程，能较好地模拟人类OA的病理特征。然而需要注意的是，DMM模型在研究软骨下骨病理改变方面适用性较低，此类研究可能采用其他模型更具转化意义。

此外，我们建立了大鼠MMT模型，以补充小鼠DMM模型。MMT手术可诱导更广泛的结构损伤，累及关节软骨和软骨下骨，从而更好地反映临床中观察到的骨关节炎（OA）晚期病理特征。这使得大鼠MMT模型特别适用于生物工程和转化研究，包括生物材料、再生疗法以及靶向关节修复的药物递送系统的评估。尽管既往研究已对MMT和DMM手术技术进行了描述，但目前仍缺乏一套全面、分步的可视化操作流程，以确保各研究实验室之间的标准化、可重复性和技术精确性。因此，为弥补这一空白，我们开发了基于视频的详细演示，展示了从动物准备到术后护理的模型建立过程中每一个关键步骤。此外，我们介绍了两种常用的行为学评估方法，一种用于评估疼痛阈值，另一种用于分析空间步态稳定性，为OA造模后的功能评估提供一致的框架。因此，通过整合手术与行为学操作流程，本文旨在促进临床前OA研究的方法学标准化，从而提高不同研究间数据的可比性和转化相关性。

方案

所有实验操作均遵循浙江中医药大学动物伦理与福利委员会的指导原则，并在协议编号 IACUC-20251020-11 下获得批准。DMM 手术采用 10–12 周龄的雄性 C57BL/6 小鼠，而 MMT 手术则选用体重为 200–225 g 的雄性 Sprague-Dawley 大鼠。所有动物均饲养于特定病原体阴性（SPF）环境中，在实验开始前给予一周的适应期。维持标准饲养条件，每周至少更换两次食物、水和垫料，以确保动物福利和实验的一致性。

1. 动物准备

1. 根据机构指南，在手术前给予适当的镇痛药物（例如，丁丙诺啡）。使用吸入性麻醉剂（例如，在诱导室中以0.4 L/min的流速输送2%异氟烷，新鲜气体流速为4 L/min）对动物进行麻醉，并通过鼻罩在整个手术过程中维持麻醉。通过确认不存在足底回缩反射来验证麻醉深度。
2. 将2-3 mm宽的润滑性眼用软膏涂抹于下眼睑结膜囊内，并轻柔按摩眼睑，以确保软膏在眼球表面均匀分布。
3. 剃除右膝关节周围毛发，并使用聚维酮碘和70%乙醇进行三步消毒清洁。将动物置于无菌手术台上。

2. 小鼠DMM手术

注意：该操作通过横断内侧半月板胫骨韧带（MMTL）来诱导关节失稳，该韧带在图1中以红色标出，正常情况下将内侧半月板固定于胫骨平台。

1. 将麻醉后的小鼠置于仰卧位，在右膝髌骨内侧做一微小的皮肤切口（约3-5 mm）。
2. 仔细分离覆盖的软组织以暴露关节囊。在髌腱内侧做切口，并轻柔地将髌骨向外侧移位，以显露膝关节。确认内侧半月板胫骨韧带（MMTL）呈一条细薄的韧带结构，连接内侧半月板前角与胫骨平台。使用体视显微镜以增强视野，尽量减少对关节软骨的损伤风险。
3. 使用显微剪刀、#11手术刀片或弯头注射针头小心切断MMTL的胫骨附着点。当使用弯头注射针头时，其钝缘有助于保护下方的关节软骨。通过观察内侧半月板是否出现不稳定现象，确认切断是否成功。
4. 使用8-0可吸收缝线缝合切开的关节囊，随后用伤口夹或6-0缝线闭合皮肤切口。
   注意：缝合时应避免穿刺或损伤关节软骨，并确保在关闭切口时适当维持关节的紧密性。
5. 将动物置于加热垫上使其恢复，并密切观察直至其完全恢复活动能力。

大鼠的 MMT 手术

注意：该操作通过横断内侧副韧带（MCL）后造成内侧半月板完全撕裂，从而诱发关节不稳和进行性软骨退变，以建立骨关节炎模型。

1. 将麻醉后的大鼠适当固定，在右膝髌骨内侧做一长约6-8 mm的纵行切口。
2. 进行钝性分离，逐层分开肌肉组织，充分暴露内侧副韧带（MCL）（图2）。
3. 使用手术剪在内侧副韧带中点处完全横断该韧带。
4. 轻柔地牵开横断后的内侧副韧带，暴露其下方的内侧半月板。用精细镊子夹住半月板，在其最狭窄区域进行全层横断，以造成完全撕裂。
5. 复位软组织，分层缝合切口：肌肉和筋膜层使用5-0可吸收缝线缝合，皮肤层则使用伤口钉或5-0不可吸收缝线闭合。
6. 按照步骤2.5中所述相同程序让动物恢复。

4. 行为学评估

1. 在手术前进行基线评估，并在指定的术后时间点（例如，2、4 和 8 周）重复评估。
   注意：为尽量减少操作者间的差异，行为学测试由同一名经过培训的操作者完成，该操作者对实验分组情况设盲。每只动物的每项测量重复三次，取平均值用于分析。
   1. 简化版机械缩足阈值测试
      1. 将小鼠分别置于抬高的金属丝网平台上的独立隔间内，测试前至少适应 30 分钟。随后使用电子 von Frey 麻醉计评估机械性疼痛敏感性。
      2. 使用 von Frey 纤维丝，将探针施加于小鼠右后足底面，并逐渐增加力度¹²。
      3. 记录反应，阳性反应表现为突然缩足、抽动或舔舐。通过评估是否存在一致性的反应，来判断敏感性随时间的变化情况。
   2. 步态分析
      1. 使用自动化步态分析系统进行评估。
      2. 让动物自愿穿过仪器的玻璃行走通道。有效试验定义为动物以稳定速度行进且未停顿的行走过程。等待系统软件自动识别足印并计算多个步态参数。分析右侧（手术侧）后肢的关键指标，包括站立相持续时间、摆动速度和足底压力，并与对侧肢体及假手术对照组进行比较。
         ​注意：所有动物在基线评估前均通过每日训练适应测试装置。每只动物在每个时间点记录三次运行数据，仅保留以恒定速度行进且无停顿的试验作为有效数据。所有测量均在双盲设计下由经过培训的操作者完成，以尽量减少操作者间差异，重复测量结果取平均值以确保数据可重复性。

结果

DMM骨关节炎小鼠模型的表征与验证
经过1周的适应期后，按照图1所示操作建立小鼠DMM诱导的骨关节炎（OA）模型。术后2周进行病理学和行为学评估。如图2A所示，最显著的退行性改变集中在内侧股胫关节。使用OARSI评分系统进一步量化软骨退变程度^13,14，结果显示DMM模型组的评分显著高于对照组（图2B）。所有OARSI评分均由对实验分组设盲的病理学家完成。每只动物均采集内侧间室的冠状切片，每隔三张切片分析一次，取评分最高的切片作为该膝关节的总体评分。OARSI评分经Shapiro-Wilk检验验证符合正态分布。独立样本t-检验分析证实两组间存在统计学显著差异（对照组：2.33 ± 2.08 vs. DMM组：15.33 ± 2.08；n = 3，p ...

讨论

本方案为两种广泛应用的手术诱导骨关节炎（OA）模型的建立与评估提供了标准化框架。这些模型具有重要价值，因为它们能够紧密模拟人类创伤后骨关节炎的病理生理特征，因而具备较强的转化研究意义。内侧半月板胫骨韧带横断（DMM）模型通过切断内侧半月板胫骨韧带实现，而内侧半月板切除（MMT）模型则涉及内侧半月板的直接撕裂。在我们的实验室中，DMM 手术通常在小鼠中进行，因为在该物种中准确识别内侧半月板较为困难，且完全的半月板撕裂可能导致过度的软骨损伤。此外，我们观察到 DMM 模型中的软骨下骨损伤明显轻于 MMT 模型。这表明，尽管 DMM 模型适用于研究软骨退变及机制通路，但在研究 OA 中软骨下骨重塑方面则较不适用。

DMM 和 MMT 手术成功的关键因素之一是精确切断目标韧带——在 DMM 模型中为内侧半月板胫骨韧带（MMTL），在 MMT 模型中为内侧副韧带（MCL），同时避免对关节软骨造成医源性损伤。此类意外的软骨损伤可能改变关节生物力学特性，并干扰组织病理学结果，尤其是用于评估疾病严重程度的 OARSI 评分。在 DMM 模型中，必须在体视显微镜下清晰观察到 MMTL，以确保准确切断...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
步态分析系统	上海新软信息技术有限公司	XR-FP202
Liposic			眼科软膏
小鼠	南京模式动物研究所	c57/bl6
疼痛检测系统	上海新软信息技术有限公司	XR-XZD	电子 von Frey 镇痛仪
大鼠	南京模式动物研究所	S/D