利用换肤、清除和基于人工智能的图像分析表征气孔和表皮特征

摘要

本方案提出了一种比较方法，利用表皮换肤、清除技术和人工智能辅助图像分析，评估两种不同物种的气孔和表皮特征。其目标是实现高通量、可重复的气孔功能基础细胞结构定量化，应用于农业应用和广泛的植物研究。

摘要

准确描述气孔形态及周围表皮特征对于理解气孔功能至关重要。采用两种互补技术——表皮剥皮和叶片清理——对比方案，评估两种生态上不同的双子叶植物 Fraxinus excelsior 和 Taraxacum officinale的气孔和表皮细胞大小、形状和密度。该方案包含了样本准备、成像和性状定量的详细步骤，采用成本效益和人工高效的手工测量（组织清除和剥离），以及AI辅助图像分析，有望实现高通量应用。评估了三种分割工具——基于YOLOv8的气孔检测模型、一种通用的细胞分割深度学习工具和基于像素的分类器——其准确性和适用性在各方法间的适用性。在人工和人工分析中，剥皮和清理技术在气孔和表皮特征上均有显著差异。人工智能工具实现了可重复的定量化，基于YOLOv8的气孔检测模型（StoManager1）在气孔特征方面表现最佳，而表皮分段则采用了通用的深度学习细胞分段工具（Cellpose）。基于AI的性状检测在 T. offiinale 中高度一致，但在 F. excelsior中较为有限，结果仍与人工测量存在差异，说明物种特异性解剖结构和图像质量如何影响方法适用性。这些发现表明，虽然AI辅助分析为气孔和表皮特征量化提供了有用框架，但在更广泛或高通量应用之前，专家验证和试点测试仍是必不可少的。

引言

气孔是表皮中的微小孔隙，在调节植物气体交换和蒸腾中起着关键作用。因此，理解气孔功能的形态基础是提升^{作物表现的关键}。虽然大多数关于气孔结构和功能的研究仅关注气孔形态学，但要全面理解气孔响应性，也需要对周围表皮细胞的大小和形状进行表征。准确量化这些性状对于理解气体交换和作物改良背后的结构-功能关系至关重要。

随着作物改良日益依赖先进的基因编辑方法，理解影响光合作用、内在用水效率和碳获取的关键形态特征（如气孔）至关重要。在持续的环境变化下，这一需求尤为紧迫，因为在干旱和热浪日益频繁的情况下，对既能保持光合作用能力又高产的韧性作物的需求不断增长，^2,3。因此，对标准化的影像和分析协议需求非常迫切。使用清漆/指甲油剥离气孔是获取叶面印迹以测量气孔和表皮大小、形状及密度的最简单方法，^4,5,6。其程序快速、无损，能够快速处理样本。组织清除法是一种替代方法，可以同时表征脉络网络，并可能实现更全面的叶片水力特性表征。

化学清除使组织变得柔和并具有光学透明性，从而实现气孔和表皮细胞的原位成像，且不会受到机械干扰。清除广泛适用于多种组织类型，包括干燥或精致标本，不仅可用于气孔成像，还可用于静脉网络的可视化、荧光成像以及内部解剖^{结构的可视化} 7,8,9,10,11,12 从而使气孔特征能够与其他功能性状一同分析。存在多种清除方法，包括有机溶剂、水溶液、过水化或水凝胶嵌入13,14,15。这些测试在持续时间、成像兼容性和试剂可用性上有所不同。这里使用的方案简单、经济，且不需要任何专业技能。与需要化学固定、嵌入和切片的更为费工的光学显微镜或扫描电子显微镜相比，这两种技术成本低廉且速度快。

传统分析气孔和表皮特征的方法通常依赖于手工分割显微镜图像，这既劳动密集、耗时又容易受到观察者偏差影响，这限制了通量并降低了分析流程的效率¹⁶。此外，毛状体和不规则细胞壁等解剖特征也为一致性性状量化带来了额外挑战。虽然自动化图像分析工具在高通量数据提取方面前景巨大，但它们针对特定植物组织进行了优化，且不易跨叶片类型和制备方法迁移。例如，StoManager1（补充图1）采用基于YOLOv8的物体检测模型，提供高准确率的气孔检测，但专门针对气孔特征进行训练。细胞态（补充图2）是一种大型预训练的通用切割模型，当输入数据类似于其预训练模型（如cyto、cyto2）时表现良好，这些模型最初基于动物细胞和细胞器。Ilastik（补充图3）是一种基于像素的分类工具，依赖用户自定义的注释。Cellpose和Ilastik都易于使用，但都可能需要重新训练或微调，以适应图像质量、背景伪影和组织特异特征的差异。

此外，气孔和表皮形态在物种间表现出较高的变^异性。气孔密度和大小等特征尤其多变，但它们通常呈反比关系，共同决定物种间气孔动力学的差异。较大的气孔部分可以弥补密度较低，但通常表现出较慢的^动力学5，这在日益频繁的热浪中可能不利，因为快速的气孔反应对维持碳同化和防止过度水分流失至关重要。总体而言，这种变异性使气孔特征的测量变得复杂，可能影响所选方案的有效性和基于AI结果的稳健性。

该方案整合了两种经典的表皮换肤和化学清除技术，结合现代人工智能（AI）和机器学习（ML）工具进行性状分割和测量。我们利用两种共同对光需求较高的双子叶植物（F. excelsior 和 T. officinale）进行对比，分析气孔和表皮性状的变异性，以评估三种方法的比较及潜在不准确性。评估了三种人工智能工具的性能：StoManager1（基于YOLOv8的气孔深度学习模型）、Cellpose（通用深度学习分割工具）和ilastik（基于表皮组织的像素分类器）。这种整合方法使气孔和表皮性状的可重复、高通量量化成为可能，为生态和农业研究中的表型分析提供了稳健且可扩展的框架。然而，如致密毛状体、厚硬的表皮或细胞边界对比度低等解剖特征可能降低切割准确性，在选择剥离与清除方法以及应用基于AI的定量时应予以考虑。

据我们所知，这是首个直接比较表皮剥离和化学清除方法，结合多种基于AI的分割工具，用于气孔和表皮特征量化的逐步方案。通过将经典显微技术与可访问的机器学习工作流程结合，该协议减少了用户偏见，提高了通量，并促进了跨物种的可重复表型分析。这使得该方法广泛适用于生态学、作物改良和气候变化研究，并为通过模型再培训或迁移学习持续扩展工具奠定了基础。

方案

注意：采集 T. officinale 和 F. excelsior 叶片无需特定许可或批准，因为这些非受保护物种均从公众可进入的花园区域采样。所有样本采集均符合机构和地方指南。

1. 植物材料采集

1. 选择健康的叶片进行比较分析。本次实验选取了两种气孔分布对比的双子叶植物的健康、日晒成熟叶片：仅在下叶面有气孔的下气孔树F . excelsior，以及两组性多年生草本 T. officinale。
2. 每个样品类型/地点取3-5片复制叶。
3. 用干净的剪刀或剃须刀片将叶子取下。切好的叶子应立即放入水中，以防止脱水。
4. 采集后，将叶柄完全浸入水中，保存温度为4°C。
5. 在48小时内完成第2或第3节的程序。

2. 准备和观察气孔印模剥皮

注意：清理过程中产生的所有化学废物均按照机构和地方安全法规处理。含戊二醛的溶液被单独收集并作为有害化学废物处置。在允许的情况下，在处理前会中和氢氧化钠（NaOH）溶液至pH 6-8。稀释的漂白剂和乙醇溶液被用大量冷水倒入下水道，地点在机构和市政规定允许的地方。 TBO溶液被收集并按照当地指南作为化学废料处置。用户应咨询其机构安全办公室以获取批准的处置程序。

1. 如有必要，用水轻轻冲洗选定的叶面以去除灰尘或杂物。立即用滤纸或软纸巾吸干叶面，去除多余水分。不要自然风干，因为这可能导致组织收缩，导致气孔和表皮细胞的大小测量不准确。
2. 用永久性记号笔在显微镜载玻片上标注样本详情（如物种、叶面和制备日期），以确保每个样本在成像、分析和数据解读过程中的可追溯性，并便于样本的妥善保存以备未来使用。
3. 对于具有非腺体（毛状）毛状体的物种，在剥皮准备前用剃刀片将毛状体从叶面上移除，因为它们的存在会遮蔽细胞边界并降低图像质量（见图1）。
4. 用小刷子在目标区域涂抹一层薄薄均匀的透明、不可伸缩指甲油（避免使用“拉伸”或“剥离”配方）。切皮时务必选择叶片中央部分，避免叶尖和基部。
5. 让指甲油完全干燥（通常在室温下2-5分钟）。长时间暴露可能导致组织变色（例如较软叶片出现红色调），这在最终剥皮时可能被发现，并干扰需要均匀着色的下游分析。
6. 干燥后，在涂层区域贴上一条透明胶带。从指甲油的一侧开始，逐渐将胶带铺在表面，轻轻按压以确保良好的附着力，避免气泡或折痕。戴丁腈手套以避免留下指纹。
7. 小心撕下胶带和指甲油膜（表皮印模）。
8. 将胶带（粘性面朝下）贴在干净的显微镜载玻片上，避免折叠或重叠。
9. 将准备好的玻片存放在室温下，避免灰尘和阳光直射。
10. 用复合光学显微镜以400倍放大镜检查幻灯片。按照软件指南保存图片，并附上相应比例。

3. 准备和查看已通过的部分

1. 切成约1厘米²厘米的叶片。所有步骤均需戴丁腈手套，并在排气罩下工作。
2. 将样品转移到标记小瓶中，用固定液覆盖（4%戊二醛，0.1 M 磷酸缓冲液，pH = 6.9）（注意），并在4°C下保存24小时（见表1，固定液制备）。
3. 用移液器去除固定溶液，并用蒸馏水覆盖样本。离开30分钟。重复三次（图2A-C）。
4. 取出水，用1 M NaOH溶液覆盖样品（将20克NaOH溶解于0.5升蒸馏水中）。
5. 在清理叶片时，氢氧化钠溶液会变成绿色。每天用新的溶液替换一次NaOH溶液。持续3到4天，或直到样品变为淡黄色且NaOH溶液保持透明（见图2D-F）。
6. 去除氧化钠溶液，并用漂白剂（5% NaClO）覆盖样品。含有此浓度的商业家用漂白剂是合适的。
7. 将样本浸泡在漂白水中1-2分钟。样品会变白且半透明（见图2G-I）。
8. 去除之前的溶液，用蒸馏水覆盖样品2分钟。通过分级蒸馏水-乙醇系列进行脱水，顺序为：75：25、50：50、25：75，以及100%乙醇。
9. 去除乙醇，用3%含酒精的甲苯胺蓝O溶液覆盖样品（TBO，将3克TBO溶解于100毫升100%乙醇中）。过夜离开。
10. 去除染色溶液，用100%乙醇覆盖样品2分钟。使用分级蒸馏水-乙醇序列重复此步骤，顺序为：25：75、50：50、75：25，最后是蒸馏水（见图2J-L）。请参阅图3，了解清理过程中常见的错误和故障排除步骤。
11. 观察前将样品浸泡在4°C的蒸馏水中。
12. 将样本转移到玻片上，加入一滴蒸馏水，并用玻璃盖片覆盖显微镜观察和成像。
13. 用复合光学显微镜以400倍放大镜检查幻灯片。按照软件指南保存图片，并附上相应比例。更多信息请参见 材料表 。

4. 图像分析与测量

1. 使用Fiji²³（ImageJ发行版，版本1.54p）进行图像处理和分析。
2. 使用线条工具，在刻度条上画一条线，然后选择 “分析>设置比例尺”，将已知距离修改为刻度条的长度，并将长度单位改为μm。
3. 前往 分析>一组测量数据。确保勾选区域 和费雷特直径 选项。
4. 使用 多边形选择 工具勾勒出感兴趣的对象轮廓。按下 M 键记录测量结果。
5. 测量斐济的以下气孔和表皮特征，并计算清除样本和气孔剥皮（见图3）。
6. 计算气孔的数量（Ns）。
   1. 确定平均气孔面积（As）。
   2. 计算平均气孔宽度（Ws）：使用费雷特最小直径。
   3. 按以下公式计算气孔密度（SD）：
      
      ;每单位 Ia（用于测量的叶片面积，mm²）。
   4. 确定平均表皮细胞面积（Ae）。
   5. 用以下公式确定表皮细胞密度（ECD）：
      

5. 统计

1. 使用方差分析（ANOVA）和Tukey的HSD事后检验来检验样本组之间的差异。
2. 在R²¹中进行所有统计分析。
3. 每个物种分析3片复制叶片，观察每片叶片的3片果皮。

6. 人工智能辅助分析

1. 选择机器学习工具进行细分。
   1. 根据目标结构（气孔或表皮细胞）、图像质量和分析目标，选择合适的机器学习分割工具。
   2. 使用气孔特异的深度学习模型进行气孔特征的自动检测和测量，并使用通用深度学习或基于像素的分割工具进行表皮细胞分割。
   3. 具体软件实现请参见机器学习工具与软件部分（补充文件）。
   4. 在大规模分析前对部分图像进行初步测试，以评估分割性能并识别潜在的误报来源。
2. 准备计算环境。
   1. 使用配备8-12核处理器、至少32GB内存和支持NVIDIA CUDA的GPU和至少24GB显存的工作站。
   2. 使用高分辨率显示器（最好4K）以便注释和目视检查。
   3. 按照开发者的说明安装所有选定的软件工具，并记录软件版本以确保可重复性。
3. 准备图像以进行机器学习分析。
   1. 导入显微镜图像，格式为TIFF或PNG格式，尽量使用8位或16位灰度图像。
   2. 确保每张图像都包含可见的比例条，或在分析前已经过空间校准。
   3. 选择碎片、褶皱或气泡最少、光照充足且细胞边界清晰的感兴趣区域。
   4. 排除边缘模糊、阴影强烈或对比度低的图像，因为这些会降低分割准确性。
4. 进行气孔分节。
   1. 将图像加载到气孔专用深度学习模型（补充文件第1节）。
   2. 根据物种和图像分辨率配置检测参数，包括物体尺寸限制和置信阈值。
   3. 运行自动检测以切割气孔复合体，提取气孔数量、面积和费雷特直径等输出指标。
   4. 导出分段掩模和测量表以供下游分析。目视检查分段叠加层，必要时手动排除错误检测的对象。
5. 进行表皮细胞分段。
   1. 将图像加载到通用深度学习切割工具或基于像素的分类器中（补充文件第2-4节）。
   2. 使用代表性图像，配合表皮细胞、细胞边界和背景的手动注释示例，进行训练或微调模型。
   3. 运行分割生成物体遮罩，并将遮罩导出用于后期处理到 ImageJ/Fiji 或等效图像分析软件中。
   4. 应用基于大小或分位数的过滤，去除小型假阳性物体，并通过目视检查验证分割准确性，然后提取表皮细胞指标如细胞面积和密度。
6. 记录参数并进行质量控制。
   1. 记录分析过程中使用的所有软件版本、参数设置、过滤阈值和硬件规格。
   2. 保留代表性的细分叠加以记录细分质量。
   3. 在统计分析或数据报告之前，直观验证自动细分输出。
7. 所有机器学习处理的图像准备
   1. 样品成像
      注意：由于基于机器学习的分割依赖于强度梯度、边缘连续性和一致的物体几何形状，而非生物背景，图像预处理和区域选择对模型性能和误差结构至关重要。
      1. 用比例条拍摄清除或剥落叶面的高分辨率图像。为了实现良好的机器学习工作流程，确保可测量物体在图像中清晰、连续且高对比度。
   2. 区域选择与图像质量
      注意：在第6.7.1节进行图像采集后，图像会被目视检查，并在图像尺度允许的情况下，手动选择无伪影的感兴趣区域进行后续分割。选择一些伪影极少的关注区域（如碎片、褶皱、气泡、照明不均匀）。对于气孔模型（例如StoManager1），优先考虑孔隙清晰可见性和清晰的护细胞轮廓。对于表皮模型（如Cellpose、Ilastik），确保细胞轮廓上的强度梯度稳定;不连续或低对比度边缘会显著降低分割性能。边界模糊的图像应在分割前排除或重新处理。
   3. 文件格式
      保存文件为TIFF或PNG格式（建议8位或16位灰度用于分割）。
   4. 可选图像增强
      1. 如果边界较弱，可以增强对比度或在ImageJ/Fiji中减少背景。
      2. 重点关注边缘几何体，因为这可能导致误差，被解读为单元边界。
      3. 在数据集中的所有图像中，持续地应用此类调整。
         注意：应特别注意边缘几何，因为阴影、光晕或不均匀的背景渐变可能造成人为强度过渡，机器学习模型可能会误将其误解为单元边界。
8. StoManager1 （v1.0.0 GUI 版本）
   注：StoManager1 利用卷积神经网络（YOLOv8-seg-x）实现植物叶片气孔的自动化高通量检测、测量和分析。该工具量化了来自各种图像类型的关键气孔指标（面积、密度、孔隙/护细胞比、聚合指数等），减少人工工作和偏见，促进大规模生态和生理学研究。提供用户友好的 Windows 应用，除了可选的后期处理外，无需任何编码技能（补充文件第 1 节）²³。
   1. 运行 StoManager1：安装和配置
      1. 访问方式可通过GitHub（https://github.com/JiaxinWang123/StoManager1）或独立Windows应用程序（（补充文件第1节）（https://zenodo.org/doi/10.5281/zenodo.7686022）²³访问。
      2. 确保库版本兼容（Python依赖）;如果安装了其他机器学习/映像软件，可能会发生冲突。
   2. 通过图形用户界面或命令行界面启动 StoManager1。
   3. 选择包含叶子图像的输入目录。
   4. 模型选择;查看YOLOv8-seg-x模型，获取基于细分的更详细指标。在边界框模型（YOLOv3）中保持不勾选，减少指标。
   5. 参数调优;根据你的成像模式/物种，调整检测阈值、图像分辨率、掩膜膨胀和物体尺寸限制。请使用默认参数，当某些气孔物体仍未被检测到时，主要（1）降低检测置信阈值以恢复更多真实气孔，同时检查假阳性检测;以及（2）提高图像分辨率，因为更高的数值可以提高小气孔的检测效果，但计算需求会增加。
   6. 跑步分段：
      1. 点击“ 开始过程”以检测、分割并测量气孔及整个气孔。
      2. 点击“ 统计分析”以处理组级统计数据。
   7. 收集结果。输出被保存到 YOUR_OUTPUT_PATH/预测输出/Output_csv/ （分割模式）或直接保存到YOUR_OUTPUT_PATH（边界框模式）。CSV 文件包含每个对象和摘要的指标;还会生成遮罩和结果图像。
   8. 启动批量处理。
   9. 完成后，收集输出：分割掩码和每张图片的CSV结果文件。每张图像的结果包括：气孔数和气孔面积、Feret直径（最大/最小）、护细胞指标、聚合/均匀度/散度指数以及孔隙/护细胞比值。
   10. 用Excel、R或Python复习输出，以获得更多统计和可视化。
   11. 质量控制;目视检查遮罩和叠加层。如有需要，按大小、形状或人工管理方式移除异常对象（见下文）。
       注意：Cellpose和ilastik的详细协议和后处理步骤见 补充文件。为了在处理大量数据集和复杂图像时获得最佳性能，我们建议配备8-12核处理器、至少32GB内存，以及支持NVIDIA CUDA的GPU，显存至少24GB。强烈建议使用大型高分辨率显示器（最好是4K），以实现高效的注释和可视化。

结果

剥皮与清除结果的比较

T . officinale 和 F. excelsior 在气孔和表皮性状上因样本是清除还是剥离而存在变异（见图4）。清除样本通常能更清晰地标明细胞边界，并更清晰地显示守护细胞形状和孔口，尽管重叠的组织层偶尔会遮挡较小的气孔，导致大小估计偏上。在 F. excelsior中，清除样本的平均气孔面积和气孔宽度显著高于换肤样本，而 T. officinale 则无显著差异。剥皮的 F. excelsior气孔密度显著较高，而T . officinale未检测到方法效应。两种方法的表皮细胞面积无差异，但剥皮的 F. excelsior样本表皮细胞密度略高。

总体而言，方法依赖的差异具有性状和物种特异性，表明剥皮是气孔测量的可靠选择，尤其是在气孔大小不一（如发育中叶片中）时，而表皮性状基本未受影响（见图5）。

AI结果及其与剥皮和清理方法的契合

气孔专用模型StoManager1在剥离图像上更可靠地检测气孔（见图6），而清除样本表现显著下降（见图7）。为进一步评估StoManager1在不同制备方法上的表现，我们比较了T . officinale 和 F. excelsior 的气孔性状检测，使用换肤和透明图像（见图8）。在T . officinale中，模型可靠地检测到各制备方法的气孔存在和密度。然而，所得数值与人工测量有显著差异（见表2 及 图5 和 图8）。大多数气孔性状在剥皮样本和清除样本之间差异显著（p < 0.05）（图8），表明AI检测流程对制备方法高度敏感，且在大规模应用前需要仔细验证。相比之下， 在F. excelsior中，由于缺乏轴向气孔，检测仅限于腹面，且在清除样本中检测不一致，且频繁出现假阳性（见图8）。这些结果凸显了物种特异性解剖特征和图像质量对基于人工智能分析效果的强烈影响。通用机器学习工具如Cellpose（图9A）和Ilastik（图9B）在剥皮后比清晰图像上更有效地分割表皮细胞。然而，这两种工具在两种制备技术（剥离和清除）下都产生了大量假阳性，尤其是在低对比度条件下或细胞轮廓模糊时。在这种情况下，模糊的气孔或表皮轮廓常常被过度分段成多个微小物体，误判为单个表皮细胞（见 图10）。因此，后处理不仅是离群值去除，还包括通过上分位数过滤，以保留可靠识别的细胞。

图1：使用剃刀片去除毛毛前后的F . carica 叶片气孔剥皮。 大型毛状体会在果皮上留下印记，形成气泡，导致表面不平整，阻碍对焦（可见大灰点）。F . carica 被纳入为例外种，以将该方案扩展到有毛叶。（A）在200倍放大时，毛体切除前的图像部分被毛状体印记遮挡。（B）去除三毛体后图像质量有所提升。（C）在切除毛体前的400倍放大图像中，毛状体压痕在很大程度上被阻挡。（D）剃刀切除毛状体后影像中阻塞较少。比例杆尺寸为100微米（A，B）和50微米（C，D）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：清算协议的连续步骤。代表性的T. officinale、F. excelsior和F. carica的图像展示了清除方案的连续阶段。（A-C）新鲜的叶子。（D-F）和NaOH清理完后离开。（G-I）漂白了NaClo后离开了。（J-L）在用甲苯胺蓝O染色后离开。该视觉辅助工具展示了预期的样本外观，并在进入下一步前突出了不同物种间的方案差异。F. carica被列为例外物种，以展示该协议在更广泛叶片和脉络形态上的适用性。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：气孔和表皮特征的示例测量。 测量的性状在图片中如出示： As = 气孔面积; Ls = 气孔长度; Ws = 气孔宽度; Ae = 表皮细胞面积。在标记区域内计算了气孔密度和表皮细胞密度，具体描述在方案中。图像400倍放大。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4：使用清除协议和剥离协议获得的图像比较。 T . officinale 和 F. excelsior 代表性图像，比较清理和气孔剥皮图像，显示气孔和表皮细胞的可见性及变异性，细胞大小和密度。比例尺为50微米，图像以400倍放大率拍摄。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5：清除与剥离方案手工性状测量结果差异。 箱形图显示 T. officinale 和 F. excelsior在清理法与表皮换肤法间气孔和表皮性状的差异。（A）平均气孔面积，（B）平均气孔宽度，（C）气孔密度，（D）平均表皮细胞面积，（E）表皮细胞密度。星号表示统计显著性水平（P < 0.05;*P < 0.01;**P < 0.001）。统计显著性通过单向方差分析评估，随后采用Tukey's HSD事后检测。每组样本量： n = 3-5。缩写： As = 气孔面积; Ws = 气孔宽度;SD = 气孔密度; Ae = 表皮细胞面积;ECD = 表皮细胞密度。 请点击此处查看该图的放大版本。

图6：使用气孔检测模型在剥皮样本上的分段结果示例。 StoManager1对剥皮的 T. officinale （成熟遮荫叶片下侧）的剖分结果显示出良好的检测精度。 请点击此处查看该图的放大版本。

图7：使用气孔检测模型对清除样本进行分割结果的示例。 StoManager1对清除的 T. officinale 样本（成熟遮荫叶片下侧）的分段结果显示，检测准确率低于剥皮样本。 请点击此处查看该图的放大版本。

图8：清除和剥皮协议在AI辅助性状测量结果上的差异。 箱型图显示了由StoManager1处理的图，基于T . officinale 和 F. excelsior图像，基于AI推导出的气孔解剖特征测量结果。性状包括气孔面积（As）、气孔宽度（Ws）、气孔长度（Ls）和气孔密度（Ds）。单位如 图5所示。统计显著性通过单向方差分析评估，随后采用Tukey's HSD事后检测。星号表示统计显著性水平（P < 0.05;*P < 0.01;**P < 0.001）。每组样本量： n = 3-5。缩写： As = 气孔面积; Ws = 气孔宽度; Ls = 气孔长度; Ds = 气孔密度。 请点击此处查看该图的放大版本。

图9：展示使用通用深度学习工具和基于像素的分类器进行分割的截图。利用（A）通用深度学习工具（Cellpose，cyto2）和（B）基于像素的分类器（ilastik）进行剥离的F. excelsior样本（叶片背面）切割。请点击此处查看该图的放大版本。

图10：去除皮 的F. excelsior 样本（叶片背面）的Ilastik分段掩膜，显示多处假阳性。 微小的点被误归为不同的表皮细胞。在后处理过程中，需要人工（目视）检查，以设置基于尺寸的阈值，以有效过滤假阳性。 请点击此处查看该图的放大版本。

解决方案	准备	最终卷
缓冲区1的底座	200毫升深置中，浓度为7.12克（Na2HPO4 × 2H2O）。H2O	200毫升
缓冲区2的底座	200毫升深置中，7.12克Na-2HPO 4 *2H2O）。H2O	200毫升
磷酸盐缓冲剂	混合36毫升碱1、14毫升碱2+50毫升离子。H2O	100毫升
固定液	将9.25毫升5%戊二醛与12.5毫升磷酸缓冲液和28.25毫升二酸液混合。H2O	50毫升

表1：固定溶液配方²⁴。 本研究所用解的组成。

物种	侧面	方法	人（阿斯）	人工智能（AS）	男（Ws）	AI（Ws）	男（L）	AI（Ls）
弗拉克西努斯	背轴	皮尔	177.43	9.32	12.71	2.85	17.58	3.58
塔拉克萨姆	背轴	清理完毕	408.09	18.84	20.1	4.19	26.14	5.39
塔拉克萨姆	背轴	皮尔	262.54	13.93	15.18	3.47	22.2	4.68
塔拉克萨姆	轴向	清理完毕	414.48	14.91	20.11	3.44	26.09	5.71
塔拉克萨姆	轴向	皮尔	258.72	11.37	15.72	3.3	21.15	4.08

表2： 关于手动测量与人工智能的指示性比较。机器学习（StoManager1）缩放结果。人与人工智能相应地表示手工和人工智能（StoManager1）结果。单位如 图5所示。手动测量和AI测量差异显著。由于多种原因，部分对比无法进行，包括缺失气孔（如偏向 F. excelsior）或检测失败（例如，由于细胞轮廓较模糊，清除样本中气孔更难检测）。

补充图1：在清理叶片过程中常见的错误示例，这些错误会影响结果。 为排查时展示的图像：（A）由于第3.10节样品未完全再水化导致染色不均匀;（B）因化学处理极其脆弱的样品处理不当导致的机械损伤;（C）由于第3.5节叶绿素未完全去除，样品中心出现绿色调。 请点击此处下载此图表。

补充图2：StoManager1用户界面示例。 StoManager1用户界面截图，显示输入设置和结果表（左），以及带有原始图像的显微照片视图（右上角）和气孔检测叠加层（右下角， T. officinale 剥离样本的轴面）。请点击此处下载此图表。

补充图3：Cellpose用户界面示例。 通过图形界面进行的细胞位分割截图，参数可调（例如，模型选择——推荐预训练的cyto2模型或定制训练模型、阈值和细胞直径校准）。对表皮细胞进行监督手动标注，以独特颜色突出每个细胞，以指导模型校准。叠加图显示了 F. excelsior 腹侧表皮换肤的分段。 请点击此处下载此图表。

补充图4：Ilastik分割过程。 叠加图展示了基于像素的F . excelsior 背侧表皮换肤图像分类。（A） 正在进行的Ilastik分割截图，显示了在人工标记类别的监督训练：表皮细胞（黄色）、细胞轮廓（蓝色）以及非表皮背景如毛状体（红色）。（B）仅显示表皮类别（黄色）的截图，说明分类器如何分离单个表皮细胞。注意在低对比度或照明不均的区域，存在多次假阳性“微小”检测。（C） 仅显示等高线类（蓝色）的截图，展示了分类器如何将细胞边界与周围表皮组织隔离开来。注意，有些轮廓是不连续的，尤其是在低对比度或照明不均的区域，会出现多次假阳性“微小”检测。（D） 显示背景类的截图。面罩突出气孔复合体、腺体毛状体及杂质（红色），但排除表皮细胞体。在表皮区域中可以看到大量小的假阳性“微小”检测，这些检测源于灰度伪影和基于纹理的误分类。 请点击此处下载此图表。

补充图5：细胞态训练设置。 清除后 T. officinale 样本（两片叶面）的Cellpose训练设置（GUI）示例，显示调整前的默认模型参数。选择预训练的 cyto2 模型，学习率为 0.1 和 100 训练历时（默认值），分别决定模型权重的更新速度和训练次数。这些默认值通常会被修改（例如，学习率=0.15;纪元=12），以减少训练时间并适应植物表皮形态;然而，较低的 epoch 数可能会降低检测性能并增加误报。 请点击此处下载此图表。

补充图6： 细胞姿态“标记”面罩。 对剥离的 F. excelsior 样本（背面叶面）应用Cellpose“标签”掩码，显示监督训练结果，每个分段对象被分配唯一标识符。表皮细胞（标记为e）占优势，同时也检测到气孔保护细胞对（标记g）。当毛状体被误归为表皮细胞（左上）或气孔（中下）时，假阳性表现可见;假阴性则是表皮细胞在图像部分区域未标记。这种掩码类型用于监督模型的下游量化和细化。 请点击此处下载此图表。

补充图7： ImageJ/斐济中分节表皮细胞的定量。截图显示了剥皮后Ilastik像素分类后剥皮 F. excelsior 样本（背侧叶面）分段表皮细胞定量。（A） 在导出的遮罩中，每个检测到的像素簇对应一个单独的粒子，从而实现自动提取对象级指标（如面积、周长、费雷特直径）。结果窗口（底部）显示数千个物体的原始测量数据;注意“微小”点噪声和碎片轮廓产生的异常多小粒子，表明存在大量假阳性。这些伪影需要后续的生物知情过滤，以分离出真正的表皮细胞，然后再进行下游统计分析。（B） ImageJ/Fiji 中 Ilastik 分段表皮物体的区域过滤。通过施加150-350微平方米的最小面积阈值，排除了小碎片和噪声，相较于面板A中未滤波掩膜，检测到的颗粒数量约减少了一个数量级（十倍）。尽管这一过滤步骤大幅去除了微小的假阳性，但分类不完美依然存在：残留的轮廓和残留的非表皮元素，需要进一步细化，如循环阈值或生物知情的筛选后检测。 请点击此处下载此图表。

补充图8：ImageJ/Fiji中Cellpose“标记”掩码的后处理。 通过使用“标签到ROIs”插件，针对剥离的 F. excelsior 样本（背面叶面），口罩中的每个分段物体被转换为关注区域（ROI），从而实现对表皮细胞和气孔护细胞复合体的单独检查和测量。ROI叠加在原始显微照片（左侧），而结果窗口（右下角）显示细胞级指标（如面积、费雷特直径、周长）。这一步实现了生物学知情的整理，使用户能够验证每个ROI是否对应真正的表皮细胞，并剔除阈值过滤后仍存在的三毛体或错节气孔等伪影，从而为后续分析步骤提供参考。 请点击此处下载此图表。

讨论

为实现气孔测量一致，应从中央层取皮以获得标准化结果，同时避免主要静脉，因为气孔密度在叶内变化明显，向叶基、叶尖和边缘递减，^25,26。新鲜叶片的果皮最可靠，前提是使用不缩水的透明指甲油和高品质透明胶带，以避免变形或瑕疵。超过~12小时的延迟会因脱水而降低轮廓清晰度。由于换肤是临时安装的，可能会困住空气，建议早期成像，但一个月后质量仍可接受。

针对特定组织类型、成像目标和安全性考虑，存在多种清除方法，^13、14、15。化学清除采用水性NaOH协议进行，因其易及性、低毒性及广泛适用于叶片类型。由于不同物种的组织反应不同，因此需要进行测试和优化。硬叶叶可能需要≥2周，残留的绿色组织可能干扰染色和模糊解剖特征（补充图1C）。为了加快清除速度，可将NaOH浓度提高至2.5米或5米。软叶在漂白后变得脆弱（第3.7节;补充图1B），以及过量暴露于次氯酸钠（NaClO）可能降解组织或导致表皮层分离。大多数软叶需要30秒到2分钟的漂白，但较坚韧的品种可能需要长达1小时²⁷分钟。虽然清理速度比剥皮准备慢，需要~5天且无需专门训练，但可以根据不同物种进行调整。清除和染色后的样品可在4°C的蒸馏水中储存，建议永久安装以实现长期保存^15,27。

针对气孔的StoManager1可靠地检测到大多数图像类型的气孔复合体（补充图2），检测结果通常与基于换皮方法的人工注释一致。然而，气孔面积测量与人工测量有系统性差异（见表2），因此在大规模分析前，需基于一小部分人工测量（例如每个物种10-20个气孔）进行校准。StoManager1大幅提升吞吐量，非标准情况下需手动验证。

同时进行气孔-表皮分节具有挑战性，因为最佳锐度不同，形态和膜清晰度的异质性会引入分节误差。同样地，在大型图像集上训练（例如，轴向/轴面，剥离/清除）会失去特异性。目前尚无植物表皮的预训练细胞姿态模型;标准的“CYTO”和“CYTO2”模型主要在动物细胞上训练，但在表皮图像上表现不佳。因此，可靠性需要定制培训（补充第2节）。即使经过训练，过度分割和假阳性仍然常见，尤其是在低对比度或未清晰图像中（补充图3）。

在 ilastik（补充部分 3，补充图 4）中，应为目标单元格类别生成对象掩码（例如表皮的类别 1），同时保留类别掩码用于审计和手动修正。批处理及后续的ImageJ/Fiji工作流程可以节省时间并减少人工错误。按面积、标准差或分位数进行一致的滤波对于抑制噪声和虚假检测至关重要。过滤后，中位单元面积和单元格数接近手动值。与人工测量及其他机器学习工具（如Weka、RootPainter）进行基准对比对于参数调整和评估细分质量依然至关重要。机器学习批处理非常耗费资源。稳定训练和大规模批量分段需要支持NVIDIA CUDA的GPU和≥32GB内存。在中端系统（例如带集成显卡的16 GB RAM）上，监督训练通常需要5-10分钟，处理<10张图像，且在使用多个注释类或异构图像类型时经常崩溃。CUDA 相较于 CPU 或集成 GPU 执行，将处理速度提升了 ~ 10-20 倍。

Cellpose、Ilastik 和 StoManager1 之间的性能差异源于它们不同的特征表示方式。Cellpose预测向天体中心的矢量流场，并对光学晕和突然的折射边界敏感，这些会扰乱流动并在清除的F. excelsior中产生假阳性簇。作为人类引导的像素分类器，Ilastik 会对高浮雕路面单元墙或光晕进行过度切割，除非明确标注为背景。StoManager1通过物体级形状图案（配对的护细胞与中央孔）检测气孔复合体，并在换皮制剂中表现良好，包括F. excelsior²⁸;然而，光晕引起的模糊会影响孔隙在清理时的可见性，从而产生假阴性而非误分类（补充文件第1和第3节）。因此，Cellpose和StoManager1作为自动分段器工作，而ilastik则作为人类引导的分类器（补充文件第1-3节）^28，。

物种特异性细胞架构调节人工智能表现。在 T. officinale中，平滑椭圆形的护卫细胞边缘与StoManager1训练分布相符，使得在剥离样本上检测得通（补充图2），而通用工具则常混淆护卫细胞和铺装细胞。在 卓越酵母中，凹陷的气孔和高浮雕路面细胞会导致清晰图像出现假阴性。这些差异反映了物种和制备物相关的成像几何结构。手动测量与AI测量之间的系统性差异源于两个原因：AI图像缺乏比例编码，以及准备过程中产生的光学伪影。缓解策略包括对组织准备产生的模糊和晕的目视分诊，在上述条件下优先使用换肤，手工校准并对一小部分气孔进行线性校正（手动 = a + b × AI）。其他策略包括针对分类单元的增强和辅助类设计用于训练（但自身训练的模型在大型多样数据集上可能仍低于预训练模型），以及后分割的上分位数过滤。

由于AI分割错误是系统性的非随机的，后处理至关重要。图像质量的诊断可以遵循简单的决策树。首先检查表皮对比和锐度：如果锐利，则转向假阳性;如果模糊，可以预期会出现小而高频的伪影，并调整滤波器。如果假阳性（如点、杂物）较少，通常只需±2-3个标准差异常值过滤即可。如果小伪影占主导，则使用基于分位数的滤波。然后将性状分布（如中位数 Ae）与生物学预期或人工数据进行比较。根据需要细化阈值——在富含人工物的数据集中，只保留上10%-50%的分位数，以确保输出有意义（补充图7 和 8）。由于表皮机器学习工具产生的高假阳性率，无法自动推导出可靠的气孔密度估计，而StoManager1在边界明确时可提供精确的气孔测量²⁸ （见 图6和图7）。对于表皮中位数，Ae 被证明很稳健，对小误报的敏感度低于平均值。

方法选择影响了性状检测。剥皮在气孔密度方面表现优于清除（见图3），而清除常常遮挡层状或色素组织中的较小气孔，尽管有时能更好地保存气孔形状²⁷。在人工智能工具中，StoManager1 持续提供极少的气孔测量，尤其是在换皮准备方面，²³ 以及剥皮通过增加正确识别细胞和图像覆盖率来提升表皮测量²。未来的收益最有可能来自于大型、分类学多样化的预训练模型，用于集成到生态生理学和作物改良的自动化成像流程中。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
消毒液清洁剂NaClO等;5%	多梅斯托斯，英国	H000023244	皮肤烧伤等;
磷酸氢二水合物（Na2HPO4. 2H2O）	彭塔，捷克	10028-24-7	匿名
乙醇，ABS，100% a.r.	内华达州化学实验室，英吉利安州	CL00.0505.1000	高度易燃性;
玻璃小瓶 2 毫升	VWR生命科学，美国	548-0045
戊二醛50%溶液	VWR生命科学，美国	23H2856331	吸入即致命。吞下去有毒。 请戴上防护手套，nbsp;服装，nbsp;眼镜。
显微镜载玻片	诺马克斯，PT	5470308A	匿名
指甲护理顶油快干	BK（伊内萨），中尉	LT-02244	匿名
尼康 Eclipse E600 和尼康 DS0Fi1 5 MP	尼康公司，日本	https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-e600	匿名
移液器和移液器头	热力科学，FI	KJ16047	匿名
单刃钢刀	牛津乐器	51-1625-0182	匿名
二氢磷酸钠二水合物（NaH2PO<>4 . 2H2O） 纯	彭塔，捷克	13472-35-0	匿名
纯氢氧化钠颗粒（NaOH）	默克KGaA，特拉华州	1310-73-2	严重烧伤。
文具透明胶带	福罗菲斯，LV	91231	匿名
甲苯胺蓝，通用级	ThermoFisher Scientific，英国	2045836	匿名