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方法文章

人宫颈类器官的生成与遗传操作

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DOI：

10.3791/69617

⸱

2026年3月10日

 ,  ,  , 
1Department of New Biology, DGIST, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Kyungpook National University Chilgok Hospital, 3Clinical Omics Institute, Kyungpook National University, 4Department of Obstetrics and Gynecology, Kyungpook National University School of Medicine, 5New Biology Research Center, DGIST, 6Graduate Program in Biomedical Science & Engineering, DGIST

本文内容

摘要

我们提供了一种建立并进行遗传操作人宫颈类器官的详细方案。

摘要

宫颈癌是女性中第四常见的癌症，最常累及子宫颈外口。子宫颈外口被复层鳞状上皮覆盖，由基底细胞以及分化中的旁基底细胞和表层基底细胞组成。宫颈锥切术后观察到的再生现象提示存在强大的干细胞活性。然而，由于获取人宫颈组织受限，以及缺乏评估子宫颈外口干细胞活性的理想体系，目前对宫颈干细胞的身份、调控机制及其恶性转化过程的理解仍然有限。近期建立的人宫颈类器官模型有助于克服这些限制，为研究宫颈生理与病理提供了新的机会。然而，目前尚无标准化的方法用于分离和建立人宫颈类器官。本文中，我们描述了一种建立人宫颈外口类器官的方法。具体而言，我们提供了一项从人宫颈外口上皮中分离单个细胞的实验方案。通过将宫颈组织在优化的酶溶液中孵育，剥离宫颈上皮，以在最大程度提高细胞得率的同时，最小化成纤维细胞的污染。我们进一步阐述了使用优化培养基配方培养人宫颈类器官的条件。此外，我们详细说明了宫颈类器官的传代及遗传操作步骤。本方案为建立人宫颈类器官并用于研究宫颈干细胞及相关疾病提供了一种高效的方法。

引言

子宫外宫颈是宫颈癌最常见的发病部位1,2。尽管在发达国家引入人乳头瘤病毒（HPV）疫苗接种后，宫颈癌发病率有所下降，但全球范围内，它仍然是女性中第四常见的癌症3,4。此外，一些国家宫颈癌前病变的发病率仍在持续上升5,6。低级别鳞状上皮内病变（LSIL）通常可自行消退，而高级别鳞状上皮内病变（HSIL）则有发展为浸润性癌的风险，通常需要手术干预，例如切除或锥切术。这些手术可能导致外宫颈缩短，增加流产或早产的风险7,8。深入理解宫颈生物学特性，并结合再生治疗的发展，有望应对这些挑战，但需要建立稳健且具有生理相关性的模型系统。

动物模型极大地推动了我们对宫颈稳态、疾病机制及治疗策略的理解。然而，由于其在生物学和病理学上与人类存在固有差异，限制了其转化应用价值。作为替代方案，类器官已成为研究人类生物学和疾病的强大平台。类器官是由干细胞衍生的三维微结构，能够重现其来源组织的组织学特征和分子特征9,10,11。研究人员已利用类器官鉴定了多种人体组织中的组织干细胞，包括气管、食管和宫颈12,13,14。此外，类器官支持遗传操作，可用于模拟多种疾病（包括癌症和纤维化）的发病机制15,16,17。同时，类器官也是筛选药物或细胞疗法有效性和毒性的有效平台18,19,20,21。

最近，两个独立的研究团队建立了人类宫颈类器官系统22,23。在这些进展的基础上，我们显著提高了宫颈类器官培养的效率，并鉴定了人类宫颈干细胞13。此外，通过剥离宫颈上皮，我们最大限度地减少了宫颈上皮下成纤维细胞的混入。通过使用可进行遗传操作的宫颈类器官，我们揭示了微生物代谢物及其下游通路在维持宫颈稳态和防止癌前病变进展中的作用。因此，一种标准化且优化的宫颈类器官生成、维持及遗传修饰方案，将成为研究宫颈生物学与病理学的重要工具。

本文中，我们介绍了一种生成和传代人宫颈类器官的详细且优化的实验方案。同时，我们还描述了通过电穿孔技术对其进行遗传操作的实验方法。

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方案

使用人宫颈组织进行细胞分离和类器官培养的研究已获得韩国大邱庆北科学技术院（DGIST）和韩国庆尚北道启隆庆北国立大学医院伦理审查委员会的批准，并依照所有相关伦理法规进行（批准编号：DGIST-20210401-BR-112-01 和 KNUCH-2020-12-020-001）。人外宫颈组织由启隆庆北国立大学医院妇产科提供。健康宫颈组织来源于因良性子宫疾病接受全腹腔镜下子宫切除术的患者。所有患者均签署了知情同意书。

1. 从宫颈外组织中分离单细胞

注意：本方案从一个约 5 mm × 5 mm × 5 mm 大小的人类外宫颈活检样本开始（图 1）。

  1. 将活检组织置于一个10 cm的培养皿中，用冰冷的DPBS（不含钙和镁）清洗一次，以去除血液和碎片。
    注意：人宫颈组织在手术后3小时内置于冰冷的Advanced DMEM/F12中运送至实验室，并在到达后立即处理。
  2. 将组织转移至含有1 mL Dispase溶液（2.4 U/mL）的1.5 mL离心管中，在37 °C下以轻柔振荡（20 rpm）孵育1小时。
    注意：Dispase溶液（2.4 U/mL）为使用前立即用冰冷的DPBS将Dispase粉末溶解至工作浓度新鲜配制而成。
  3. 将样品转移至一个新的10 cm培养皿中。使用镊子小心地将白色上皮层与其余组织分离。
  4. 用尖头镊子轻轻将上皮表面完整剥离成片状。立即将分离出的上皮层转移至一个置于冰上的50 mL锥形管中。
    注意：如果表面上皮不易剥离，可用钝头镊子刮取表面。
  5. 向剥离或刮取的样品中加入1 mL基于重组胰蛋白酶的解离溶液，并将整个混合物转移至一个50 mL锥形管中。
  6. 将上一步剩余的组织保留在另一个50 mL锥形管中。
  7. 将含有宫颈上皮的50 mL锥形管在37 °C下孵育5分钟，同时在管式旋转仪上轻柔振荡（20 rpm）。
  8. 向细胞悬液中加入10 mL新鲜配制的冰冷阻断缓冲液（含2%小牛血清（BCS）的PBS），以终止酶反应。
  9. 在4 °C下以450 × g 离心5分钟。小心移除并弃去上清液。
    注意：若在解离组织中肉眼观察到血液，或组织呈现黏稠状态，则继续进行下一步操作；否则，跳至步骤1.13。
  10. 向沉淀中加入1 mL 1X红细胞裂解缓冲液和20 µL DNase（10 U/µL储备液），室温孵育5分钟，以裂解红细胞并降解黏性DNA。
  11. 向细胞悬液中加入10 mL冰冷的阻断缓冲液（含2%小牛血清（BCS）的PBS），以终止酶反应。
  12. 在4 °C下以450 × g 离心5分钟。小心移除并弃去上清液。
  13. 用冰冷的阻断缓冲液（含2%小牛血清（BCS）的PBS）洗涤细胞沉淀。
  14. 在4 °C下以450 × g 离心5分钟。小心移除并弃去上清液。
  15. 将细胞沉淀重悬于200–500 µL类器官培养基中。
  16. 使用台盼蓝溶液和血细胞计数板计数细胞数量。每份活检样本预期获得的细胞数为50,000至500,000个。

2. 宫颈外口类器官的接种与培养

  1. 在1.5 mL微量离心管中，将500–2,000个活细胞重悬于50 µL类器官培养基（成分见材料列表）中。接种前通过台盼蓝染色排除法评估细胞活力。
  2. 向细胞悬液中加入50 µL基底膜基质（例如Matrigel）。在冰上轻轻混匀以避免产生气泡，并将100 µL混合液滴加至置于24孔板中的细胞培养小室内部。所有涉及基底膜基质的操作均需在冰上或4 °C下进行，除非另有说明，以防止提前凝胶化。
  3. 将培养板在37 °C孵育20–30分钟，直至基底膜基质-细胞混合物凝固。
  4. 待混合物凝固后，在培养小室下方的孔中加入400 µL类器官培养基。
  5. 培养类器官1–2周，直至其平均直径达到150–250 µm（最大直径约为500 µm）。
    注意：当类器官达到适当大小并呈现洋葱皮样同心层状微结构时，可根据需要进行传代。

3. 类器官解离与重新接种

  1. 在细胞培养小室上加入 1 mL Dispase 溶液（2.4 U/mL），并用移液器轻轻解离基底膜基质。
  2. 将 Dispase-基底膜基质混合物转移至 15 mL 离心管中，在 37 °C 下孵育 1 小时。
  3. 向细胞悬液中加入 10 mL 新鲜配制的冰上预冷的封闭缓冲液（含 2% 牛犊血清（BCS）的 PBS），以终止酶反应。
  4. 在 4 °C 下以 450 × g 离心 5 分钟。
  5. 弃去上清液，将沉淀重悬于 200 µL TrypLE Express 中。
  6. 在 37 °C 下孵育 5 分钟。
  7. 加入 1 mL 冰上预冷的封闭缓冲液（含 2% 牛犊血清（BCS）的 PBS），轻轻吹打以中和酶活性。
  8. 将悬液通过 40 µm 细胞滤网过滤，以获得单细胞悬液。
  9. 在 4 °C 下以 450 × g 离心 5 分钟。小心移除并弃去上清液。
  10. 将细胞沉淀重悬于 200–500 µL 类器官培养基中。
  11. 使用台盼蓝溶液和血细胞计数板计数细胞数量。预期每孔 24 孔细胞培养小室的细胞产量为 50,000 至 500,000 个细胞 。
  12. 随后将 500–2,000 个细胞重悬于 50 µL 类器官培养基中（成分见材料列表）。向细胞悬液中加入 50 µL 基底膜基质。轻轻混匀，避免 产生气泡，并将 100 µL 混合液滴加至置于 24 孔板中的细胞培养小室内部。
  13. 将培养板在 37 °C 下孵育 20–30 分钟，直至基底膜基质-细胞混合物凝固。
  14. 当混合物完全凝固后（通常在 37 °C 下孵育 20–30 分钟后），向小室下方的孔中加入 400 µL 类器官培养基。
  15. 采用三维细胞外基质包埋法，在类器官培养基（成分见材料列表）中培养类器官 1–2 周。将培养物置于 37 °C、5% CO₂ 的湿润培养箱中。每 2–3 天更换一次培养基，并监测生长情况，直至类器官平均直径达到 150–250 µm。
  16. 当类器官达到合适大小并呈现洋葱皮样同心层状微结构时，可根据需要进行传代，用于下一轮培养。

4. 通过电穿孔对人类宫颈类器官进行基因操作

注意：本实验方案基于使用 Lonza Amaxa 4D-Nucleofector 及 P4 Primary Cell 4D-Nucleofector X 试剂盒（#V4XP-4032）。

  1. 从人宫颈细胞悬液中分离后，将100,000–200,000个细胞转移至每支1.5 mL离心管中。
  2. 在4 °C条件下以450 × g离心3分钟。小心移除并弃去上清液。
  3. 用P4原代细胞4D-Nucleofector X试剂盒中的Nucleofector溶液/添加剂混合液重悬细胞沉淀，每管加入20 µL。该混合液按每管16.4 µL Nucleofector溶液与3.6 µL添加剂混合配制。
  4. 向每管含有重悬细胞的样品中加入300 nM的对照或靶向siRNA寡核苷酸。通过移液轻轻混匀。
    注意：每管siRNA寡核苷酸的体积不应超过2 µL。
  5. 小心将转染混合液（20 µL重悬于Nucleofector溶液/添加剂混合液中的细胞 + 最多2 µL siRNA；总体积20–22 µL）转移至P4原代细胞4D-Nucleofector X试剂盒中的电穿孔比色皿（Nucleocuvette Vessels）中。
  6. 轻弹Nucleocuvette比色皿，确保样品覆盖比色皿底部。
  7. 盖上Nucleocuvette比色皿的盖子，并将其放入已通电的4D-Nucleofector装置的卡槽中。
    注意：确保Nucleocuvette比色皿在卡槽中的方向正确。
  8. 启动转染程序。为每个比色皿设置适用于P4原代细胞程序的EA-125脉冲代码。
  9. 程序完成后，小心将Nucleocuvette比色皿从卡槽中取出。
  10. 将Nucleocuvette比色皿在室温下孵育10分钟，使细胞稳定。
  11. 打开Nucleocuvette比色皿的盖子，向每个比色皿中加入180 µL预热至37 °C的类器官培养基，然后轻轻将细胞悬液转移至新的1.5 mL离心管中进行重悬。
  12. 取含有500–2,000个细胞的细胞悬液体积，用类器官培养基重悬至终体积50 µL。
    注意：不要丢弃步骤4.12中剩余的细胞，这些细胞将在步骤4.14中使用。
  13. 按照方法2“外宫颈类器官接种与培养”的协议进行类器官培养。通过评估所形成类器官的数量、大小和结构等不同指标，比较siRNA的作用效果。
  14. 将步骤4.12中剩余的细胞分装至96孔超低吸附板中，并在37 °C下孵育48小时。
  15. 48小时后，将细胞转移至1.5 mL离心管中，在450 × g下离心3分钟，弃去上清液。
  16. 使用所得细胞沉淀进行实时PCR实验，以确认目标基因的敲低效果，并评估基因表达的任何变化。
    注意：所有人宫颈组织和细胞悬液均应视为潜在感染性材料处理。所有涉及人原代样本的操作均应在经认证的生物安全柜内按照BSL-2级生物安全规范进行，并遵守机构的伦理与生物安全规定。穿戴适当的个人防护装备（实验服、手套和护目镜），使用经机构批准的消毒剂对工作台面和设备进行消毒。酶类试剂（如dispase和TrypLE Express等解离酶）可能引起皮肤和眼部刺激，并在移液过程中产生气溶胶；应避免产生气溶胶，尽可能保持管盖密闭，若发生接触应立即用水冲洗，并遵循机构暴露处理程序及制造商提供的安全数据表（SDS）指导。所有生物废弃物（包括含基质材料和受污染的塑料制品）应按照机构规定进行处置。进行siRNA电穿孔时，应遵循制造商的电气安全说明：确保比色皿正确安装、盖子完全闭合后再启动脉冲；避免戴湿手套操作或在液体泄漏附近使用设备；检查设备及配件是否有损坏；脉冲后避免直接接触比色皿电极。

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结果

3D 人类宫颈类器官培养

按照上述顺序，将 freshly isolated 的人外宫颈组织解离为单个细胞，随后接种于24孔细胞培养小室的上室中进行培养，以形成本方案所述的宫颈类器官（图1）。人宫颈类器官在2周内可从单个细胞生长至直径达500 µm（图2A）。在本方案中，类器官生成的成功率超过90%（来自11份不同活检组织中的10次成功），总体类器官形成效率约为40%。自培养第7至10天起，类器官开始呈现出类似洋葱皮样同心层状的显微结构。这些显微结构表明类器官中已生成复层鳞状上皮，其由内部的分化后上层细胞和外缘的基底干细胞组成。苏木精和伊红（H&E）染色清晰显示了类器官中复层鳞状上皮的形成（图2B）。免疫荧光染色还显示，基底层位于类器官的外缘，包围着上层细胞层（图2C）。

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讨论

本文中，我们描述了建立和传代人宫颈类器官的实验方案，并提供了对其进行遗传操作的方法，这将显著推动宫颈生物学与病理学的研究。尽管本方案专门针对人子宫宫颈类器官进行了优化，但经过轻微修改后，也可应用于其他类器官系统。

建立和优化类器官培养所需的关键信息包括高效且成分最少的详细培养基配方，以及采用最佳酶和机械破碎方法的单细胞解离方案。对于单细胞解离，我们将人宫颈样本在Dispase溶液中孵育1小时，随后将宫颈上皮作为一个完整的片层剥离下来，这与我们处理食管和气管组织的方法相同（图1）12,27。相比之下，其他研究则使用剪刀将宫颈组织剪碎，并在胶原酶溶液中孵育30-45分钟23,28。我们推测，这些在消化酶和机械破碎方法上的差异导致了成纤维细胞混入程度的不同。通过单细胞RNA测序鉴定，我们的单细胞悬...

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致谢

本工作由卫生和 福利部资助（Y. Jeong，项目编号 RS-2024-00439434）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
P4 原代细胞 4D-核转染 X 试剂盒LonzaV4XP-4032
96 孔超低吸附板SPL39796
40 µm 细胞筛SPL93040
50 mL 锥形管，500/盒SLPSPL50050
15 mL 锥形管Sarstedt62.554.502
CryoPure 1.8 mL 冻存管 - 白色Sarstedt72.379P
37 °C、5% CO2 培养箱Eppendorf9734IQ905476
细胞培养小室SPL37024
Amaxa 4D-核转染仪LonzaAAF-1003X
封闭缓冲液（DPBS 中含 2% BCS）Gibco / WelgeneBCS: 26010074; DPBS: LB001-02
Dispase II 粉末Gibco17105041
DNase IEnzynomicsM059L
MatrigelCorning356231
红细胞裂解缓冲液BiosesangR2015
TrypLE ExpressGibco12605
洗涤缓冲液（HBSS）JBIBL003-1
高级 DMEM/F12 培养基Gibco12634028
GlutaMAX 补充剂Gibco35050-061
青霉素–链霉素BiowestL0022-100
HEPESGibco15630-080
B27 补充剂Gibco17504044
NogginPeproTech118214
N-乙酰-L-半胱氨酸SigmaA9165
Y-27632STEMCELL Technologies72307
FGF2PeproTech100-18B-50UG
FGF7PeproTechAF-100-19-250UG
A83-01SelleckchemS7692 
ForskolinSigmaF6886
Neuregulin 1PeproTech100-03-50UG
NGFPeproTechAF-450-01-100UG
R-spondinSinobiological11083-HNAS
HGFPeprotech100-39H-250ug
FGF10Peprotech100-26
35 mm 培养皿 SPL10035
类器官培养基配方
名称公司货号浓度
高级 DMEM/F12 培养基Gibco12634028
GlutaMAX 补充剂Gibco35050-0611x
青霉素–链霉素BiowestL0022-1001x
HEPESGibco15630-08010 mM
B27 补充剂Gibco175040441x
不含维生素 A
NogginPeproTech118214100 ng/ml
N-乙酰-L-半胱氨酸SigmaA91651 mM
Y-27632STEMCELL Technologies7230710 μM
FGF2PeproTech100-18B-50UG50 ng/ml
FGF7PeproTechAF-100-19-250UG25 ng/ml
FGF10Peprotech100-26100 ng/ml
A83-01SelleckchemS7692 500 nM
ForskolinSigmaF688610 μM
Neuregulin 1PeproTech100-03-50UG50 ng/ml
NGFPeproTechAF-450-01-100UG20 ng/ml
R-spondinSinobiological11083-HNAS100 ng/ml
HGFPeprotech100-39H-250ug25 ng/ml

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