人宫颈类器官的生成与遗传操作

摘要

我们提供了一种建立并进行遗传操作人宫颈类器官的详细方案。

摘要

宫颈癌是女性中第四常见的癌症，最常累及子宫颈外口。子宫颈外口被复层鳞状上皮覆盖，由基底细胞以及分化中的旁基底细胞和表层基底细胞组成。宫颈锥切术后观察到的再生现象提示存在强大的干细胞活性。然而，由于获取人宫颈组织受限，以及缺乏评估子宫颈外口干细胞活性的理想体系，目前对宫颈干细胞的身份、调控机制及其恶性转化过程的理解仍然有限。近期建立的人宫颈类器官模型有助于克服这些限制，为研究宫颈生理与病理提供了新的机会。然而，目前尚无标准化的方法用于分离和建立人宫颈类器官。本文中，我们描述了一种建立人宫颈外口类器官的方法。具体而言，我们提供了一项从人宫颈外口上皮中分离单个细胞的实验方案。通过将宫颈组织在优化的酶溶液中孵育，剥离宫颈上皮，以在最大程度提高细胞得率的同时，最小化成纤维细胞的污染。我们进一步阐述了使用优化培养基配方培养人宫颈类器官的条件。此外，我们详细说明了宫颈类器官的传代及遗传操作步骤。本方案为建立人宫颈类器官并用于研究宫颈干细胞及相关疾病提供了一种高效的方法。

引言

子宫外宫颈是宫颈癌最常见的发病部位^1,2。尽管在发达国家引入人乳头瘤病毒（HPV）疫苗接种后，宫颈癌发病率有所下降，但全球范围内，它仍然是女性中第四常见的癌症^3,4。此外，一些国家宫颈癌前病变的发病率仍在持续上升^5,6。低级别鳞状上皮内病变（LSIL）通常可自行消退，而高级别鳞状上皮内病变（HSIL）则有发展为浸润性癌的风险，通常需要手术干预，例如切除或锥切术。这些手术可能导致外宫颈缩短，增加流产或早产的风险^7,8。深入理解宫颈生物学特性，并结合再生治疗的发展，有望应对这些挑战，但需要建立稳健且具有生理相关性的模型系统。

动物模型极大地推动了我们对宫颈稳态、疾病机制及治疗策略的理解。然而，由于其在生物学和病理学上与人类存在固有差异，限制了其转化应用价值。作为替代方案，类器官已成为研究人类生物学和疾病的强大平台。类器官是由干细胞衍生的三维微结构，能够重现其来源组织的组织学特征和分子特征

方案

使用人宫颈组织进行细胞分离和类器官培养的研究已获得韩国大邱庆北科学技术院（DGIST）和韩国庆尚北道启隆庆北国立大学医院伦理审查委员会的批准，并依照所有相关伦理法规进行（批准编号：DGIST-20210401-BR-112-01 和 KNUCH-2020-12-020-001）。人外宫颈组织由启隆庆北国立大学医院妇产科提供。健康宫颈组织来源于因良性子宫疾病接受全腹腔镜下子宫切除术的患者。所有患者均签署了知情同意书。

1. 从宫颈外组织中分离单细胞

注意：本方案从一个约 5 mm × 5 mm × 5 mm 大小的人类外宫颈活检样本开始（图 1）。

1. 将活检组织置于一个10 cm的培养皿中，用冰冷的DPBS（不含钙和镁）清洗一次，以去除血液和碎片。
   注意：人宫颈组织在手术后3小时内置于冰冷的Advanced DMEM/F12中运送至实验室，并在到达后立即处理。
2. 将组织转移至含有1 mL Dispase溶液（2.4 U/mL）的1.5 mL离心管中，在37 °C下以轻柔振荡（20 rpm）孵育1小时。
   注意：Dispase溶液（2.4 U/mL）为使用前立即用冰冷的DPBS将Dispase粉末溶解至工作浓度新鲜配制而成。
3. 将样品转移至一个新的10 cm培养皿中。使用镊子小心地将....

结果

3D 人类宫颈类器官培养

按照上述顺序，将 freshly isolated 的人外宫颈组织解离为单个细胞，随后接种于24孔细胞培养小室的上室中进行培养，以形成本方案所述的宫颈类器官（图1）。人宫颈类器官在2周内可从单个细胞生长至直径达500 µm（图2A）。在本方案中，类器官生成的成功率超过90%（来自11份不同活检组织中的10次成功），总体类器官形成效率约为40%。自培养第7至10天起，类器官开始呈现出类似洋葱皮样同心层状的显微结构。这些显微结构表明类器官中已生成复层鳞状上皮，其由内部的分化后上层细胞和外缘的基底干细胞组成。苏木精和伊红（H&E）染色清晰显示了类器官中复层鳞状上皮的形成（图2B）。免疫荧光染色还显示，基底层位于类器官的外缘，包围着上层细胞层（图2C）。

讨论

本文中，我们描述了建立和传代人宫颈类器官的实验方案，并提供了对其进行遗传操作的方法，这将显著推动宫颈生物学与病理学的研究。尽管本方案专门针对人子宫宫颈类器官进行了优化，但经过轻微修改后，也可应用于其他类器官系统。

建立和优化类器官培养所需的关键信息包括高效且成分最少的详细培养基配方，以及采用最佳酶和机械破碎方法的单细胞解离方案。对于单细胞解离，我们将人宫颈样本在Dispase溶液中孵育1小时，随后将宫颈上皮作为一个完整的片层剥离下来，这与我们处理食管和气管组织的方法相同（图1）^12,27。相比之下，其他研究则使用剪刀将宫颈组织剪碎，并在胶原酶溶液中孵育30-45分钟^23,28。我们推测，这些在消化酶和机械破碎方法上的差异导致了成纤维细胞混入程度的不同。通过单细胞RNA测序鉴定，我们的单细胞悬.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
P4 原代细胞 4D-核转染 X 试剂盒	Lonza	V4XP-4032
96 孔超低吸附板	SPL	39796
40 µm 细胞筛	SPL	93040
50 mL 锥形管，500/盒	SLP	SPL50050
15 mL 锥形管	Sarstedt	62.554.502
CryoPure 1.8 mL 冻存管 - 白色	Sarstedt	72.379P
37 °C、5% CO2 培养箱	Eppendorf	9734IQ905476
细胞培养小室	SPL	37024
Amaxa 4D-核转染仪	Lonza	AAF-1003X
封闭缓冲液（DPBS 中含 2% BCS）	Gibco / Welgene	BCS: 26010074; DPBS: LB001-02
Dispase II 粉末	Gibco	17105041
DNase I	Enzynomics	M059L
Matrigel	Corning	356231
红细胞裂解缓冲液	Biosesang	R2015
TrypLE Express	Gibco	12605
洗涤缓冲液（HBSS）	JBI	BL003-1
高级 DMEM/F12 培养基	Gibco	12634028
GlutaMAX 补充剂	Gibco	35050-061
青霉素–链霉素	Biowest	L0022-100
HEPES	Gibco	15630-080
B27 补充剂	Gibco	17504044
Noggin	PeproTech	118214
N-乙酰-L-半胱氨酸	Sigma	A9165
Y-27632	STEMCELL Technologies	72307
FGF2	PeproTech	100-18B-50UG
FGF7	PeproTech	AF-100-19-250UG
A83-01	Selleckchem	S7692
Forskolin	Sigma	F6886
Neuregulin 1	PeproTech	100-03-50UG
NGF	PeproTech	AF-450-01-100UG
R-spondin	Sinobiological	11083-HNAS
HGF	Peprotech	100-39H-250ug
FGF10	Peprotech	100-26
35 mm 培养皿	SPL	10035
类器官培养基配方
名称	公司	货号	浓度
高级 DMEM/F12 培养基	Gibco	12634028
GlutaMAX 补充剂	Gibco	35050-061	1x
青霉素–链霉素	Biowest	L0022-100	1x
HEPES	Gibco	15630-080	10 mM
B27 补充剂	Gibco	17504044	1x 不含维生素 A
Noggin	PeproTech	118214	100 ng/ml
N-乙酰-L-半胱氨酸	Sigma	A9165	1 mM
Y-27632	STEMCELL Technologies	72307	10 μM
FGF2	PeproTech	100-18B-50UG	50 ng/ml
FGF7	PeproTech	AF-100-19-250UG	25 ng/ml
FGF10	Peprotech	100-26	100 ng/ml
A83-01	Selleckchem	S7692	500 nM
Forskolin	Sigma	F6886	10 μM
Neuregulin 1	PeproTech	100-03-50UG	50 ng/ml
NGF	PeproTech	AF-450-01-100UG	20 ng/ml
R-spondin	Sinobiological	11083-HNAS	100 ng/ml
HGF	Peprotech	100-39H-250ug	25 ng/ml