本方案介绍了一种基于阻抗的实时检测方法，用于量化CAR T细胞在慢性抗原刺激下的连续杀伤能力和持久性，同时结合了平板洗涤方法，以实现检测板的经济高效重复使用。
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本方案介绍了一种基于阻抗的实时检测方法，用于量化CAR T细胞在慢性抗原刺激下的连续杀伤能力和持久性，同时结合了平板洗涤方法，以实现检测板的经济高效重复使用。
嵌合抗原受体（CAR）细胞疗法彻底改变了特定血液系统恶性肿瘤的治疗方式。然而，由于抗原丢失、抗原下调或T细胞耗竭，相当一部分患者会出现复发。这些挑战凸显了开发功能检测方法的必要性，以评估CAR T细胞在长期抗原刺激下的杀伤能力和持久性。连续杀伤实验通过检测CAR T细胞反复清除肿瘤靶细胞的能力，为CAR T细胞应答的持久性和效力提供了重要信息。
在此，我们介绍一种基于阻抗的检测方法，利用实时细胞分析（RTCA）系统定量CAR T细胞介导的连续杀伤效应 体外肿瘤细胞被反复接种并使其在特定检测用E-板上贴壁，随后按预定的效应细胞与靶细胞（E:T）比例加入CAR T细胞。该平台无需标记即可连续监测肿瘤细胞的存活力，以高时间分辨率捕捉动态细胞毒性变化。核心读数包括细胞指数（Cell Index, CI）动力学曲线、肿瘤细胞杀伤速率以及靶细胞清除时间。随着CAR T细胞与肿瘤靶细胞的反复接触，其杀伤能力呈进行性下降，这一现象可作为CAR T细胞功能失调（常称为T细胞耗竭）的标志。上述指标共同实现了在不同E:T比例下对CAR T细胞功能的精确评估，并可随时间对不同的CAR T细胞构建体或联合治疗方案进行直接比较。
为了提高成本效益，我们开发了一种平板清洗流程，可在不损害检测性能或数据完整性的前提下重复使用检测用E-板。该优化的工作流程在保持分析稳健性的同时降低了检测成本。这一方法使得CAR T细胞功能的临床前评估更加经济且可扩展，有助于推动细胞治疗设计的改进。
嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法在多种血液系统恶性肿瘤（如慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、大B细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤）的临床治疗中取得了显著成功，彻底改变了癌症免疫治疗的格局1,2,3,4,5。自首个产品获得监管批准以来，CAR T细胞产品的种类和接受治疗的患者数量持续增长6。根据具体产品和临床适应证的不同，通常的输注剂量范围为每名患者约 2 × 106 至 5 × 108 个CAR+ T细胞7。高剂量输注对于实现有效的肿瘤清除和长期疾病控制至关重要，但也带来了临床和实际操作方面的挑战。大量细胞输注可能增加严重不良反应的风险，例如细胞因子释放综合征（CRS）和免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS），二者均可能具有剂量依赖性8。此外，从经过大量预处理或淋巴细胞耗竭的患者体内制备足量的功能性CAR T细胞存在困难，且该过程对治疗中心而言在物流上要求高且成本昂贵
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注意：本方案已针对 E-Plate 96 进行优化，需使用 xCELLigence RTCA 系统。贴壁肿瘤细胞需提前一晚接种，以确保在加入 CAR T 细胞时处于对数生长期。根据肿瘤细胞系及接种密度的不同，该孵育时间可缩短至 6–9 小时，从而实现同日效应细胞的添加。若采用后一种操作流程，则本方案中所述的按日时间线将相应调整，用户应据此调整实验安排。共培养持续 48 小时后，将 CAR T 细胞转移至新接种的肿瘤细胞上，此过程需要 xCELLigence 仪器上的两个板位，并每隔一天交替进行肿瘤细胞接种和效应细胞添加。CAR T 细胞的制备应遵循机构标准操作程序（SOP）或已建立的方案。简要而言，在符合伦理审批的条件下分离外周血 T 细胞，在适当的生物安全条件下进行转导，并通过流式细胞术或等效的质量控制检测方法评估转导效率和细胞活力。当 CAR 转导效率低于 20% 时，不应进行 xCELLigence 检测，因为较低的转导效率可能导致未转导细胞产生较高的背景信号和非特异性杀伤，从而干扰肿瘤生长曲线的准确性。所有细胞操作均应在无菌条件下于超净工作台内进行。培养基可采用实验室常规使用类型，或按照供应商推荐使用。除非另有说明，细胞均在 37 °C、含 5% CO₂ 的湿润环境中培养。尽管本方法已针对 CAR T 细胞优化，但也可适用于其他悬浮型效应细胞与贴壁型靶细胞的组合。
1. 准备与空白对照（第1天）
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成功执行该方案可获得可重复的基于阻抗的读数，反映随时间变化的肿瘤细胞活力和CAR T细胞的细胞毒性。使用商用RTCA系统评估细胞生长和细胞毒性。数据以归一化细胞指数（NCI）表示，计算方法为将每个时间点的CI值除以选定归一化时间点的CI值。归一化时间设定在效应细胞加入前即刻。清除时间定义为效应细胞加入后NCI降至零所需的时间间隔。NCI由RTCA软件自动计算，并可导出用于进一步分析，包括杀伤速率和清除时间，可使用GraphPad Prism等统计软件进行分析。通过生成代表性NCI曲线以可视化细胞毒性的动力学过程。有关计算原理的更多细节可参见其他文献25。
在一项代表性实验中，经第二代嵌合抗原受体（CAR）和额外的嵌合细胞因子受体（CCR）工程改造的CAR T细胞，在与BxPC-3胰腺癌细胞共培养时，经过多轮肿瘤攻击后仍保持强大的裂解潜能；而未携带CCR的CAR T细胞在第2轮后即丧失杀伤能力（图1）。每48小时重新引入肿瘤细胞，每次刺激循环后自然杀伤细胞指数（NCI）的逐步下.......
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本方案描述了一种利用xCELLigence RTCA平台，通过多轮抗原暴露来评估CAR T细胞介导的细胞毒性的方法。该方法通过阻抗检测对肿瘤细胞存活率进行长期动态测量，以无标记且连续的方式捕捉T细胞反复杀伤肿瘤细胞的效应——即所谓的连续杀伤（serial killing）。本方案旨在监测T细胞效应功能在连续多次肿瘤细胞再刺激下随时间发生的变化，从而深入了解功能持久性、早期耗竭以及整体杀伤动力学等关键参数（图1）。
确保可重复性和数据质量需要注意多个操作细节。首先，向孔中移液时必须小心操作，避免损坏孔底部的微电极表面。其次，空白校正步骤用于建立电学基线，并在加入细胞前识别任何无功能的孔。建议在空白校正过程中额外增加一些孔，因为若空白校正后出现阻抗信号不稳定或细胞指数（CI）值异常偏低或偏高（超出基线0 - 0.2 CI范围）等缺陷，可能提示电极受损，应将其排除在分析之外20。第三，常用肿瘤细胞系的生长特征可能存在显著差异，因此相应调整接种密度（例如5×10³–4×10⁴个细胞/.......
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SK 已从Plectonic、TCR2公司、Miltenyi、Galapagos、Cymab、诺华（Novartis）、Regeneron、百时美施贵宝（BMS）和葛兰素史克（GSK）获得酬金。SK 是肿瘤免疫学领域多项专利的发明人。SK已从TCR2公司和Carina Biotech获得专利许可费。SK 曾从TCR2公司、Tabby Therapeutics、Catalym GmbH、Plectonic GmbH和Arcus Bioscience获得研究资助，用于与本稿件无关的研究工作。其余所有作者声明无竞争利益。
TT、SM 和 NTTN 获得了 Else-Kröner Fresenius Stiftung（IOLIN）的资助。NTTN 还获得了 Friedrich-Baur-Stiftung 和德国癌症援助组织（German Cancer Aid，AvantCAR.de）的额外资助。MPT 得到了 Monika Kutzner 基金会和欧洲研究理事会（欧洲研究理事会 MSCA 学者项目 101106951）的支持。SK 得到了国际博士项目“i-Target：癌症免疫靶向治疗”（由巴伐利亚精英网络资助）、巴伐利亚癌症研究中心（BZKF）（TANGO 项目资助给 S.K.）、德国研究基金会（DFG，资助编号：KO5055-2-1 和 KO5055/3-1）、黑色素瘤研究联盟（资助编号 409510）、玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里癌症过继性 T 细胞治疗优化培训网络（由欧盟“地平线 2020”计划资助，资助编号 955575）、玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里治疗性免疫细胞在癌症中的追踪与调控培训网络（由欧盟“地平线计划”资助，资助编号 101168810）、Else Kröner-Fresenius-Stiftung（IOLIN）、德国癌症援助组织（AvantCAR.de）、Wilhelm-Sander 基金会、Ernst Jung 基金会、慕尼黑大学（LMU Munich）LMUexcellent 机构战略（德国卓越计划框架内）、Go-Bio 倡议、巴伐利亚州经济事务部 m4 奖、德国联邦教育与研究部、E....
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BxPC3 | ATCC | CRL-1687 | |
| 96孔E-Plate | Agilent | 300600910 | |
| RTCA软件Pro（基础版） | Agilent | 不适用 | 版本 2.6.1 |
| xCELLigence RTCA MP（多孔板系统） | Agilent | 不适用 |
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