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研究文章

蛇床子素通过miR-34a/Bcl-2轴改善大鼠关节炎

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DOI：

10.3791/69624

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2026年5月15日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Jiangsu Key Laboratory of New Drug Research and Clinical Pharmacy, and Public Experimental Research Center, Xuzhou Medical University, 2Department of Joint Surgery, Shuyang Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

奥斯托醇（OST）是一种具有广泛药理活性的天然化合物。本研究表明，OST可缓解膝骨关节炎（KOA）的影响 通过 miR-34a/Bcl-2 轴，如所示 体内 和 体外 在大鼠中的研究为其专利药物开发和临床应用提供了新思路与方向。

摘要

膝骨关节炎（KOA），亦称肥厚性或退行性关节炎，是一种常见的关节疾病。目前临床管理策略包括药物治疗、物理干预、手术治疗及辅助疗法。尽管这些方法在一定程度上可缓解KOA症状，但仍常存在局限性，如副作用、疗效有限或具有侵入性。蛇床子素（OST）是一种天然香豆素衍生物，因其药理特性而被广泛研究，尤其在缓解关节疼痛和改善关节功能方面。本研究采用CCK8实验、透射电子显微镜（TEM）、H&E 染色以及血清生化分析被用于证明OST对软骨细胞具有保护作用 体外 和 体内，未观察到显著毒性。随后通过透射电子显微镜（TEM）、吖啶橙染色、流式细胞术和蛋白质印迹实验发现，OST可促进软骨细胞自噬并抑制细胞凋亡。进一步通过qRT-PCR和荧光素酶报告基因实验开展的机制研究表明，OST通过下调miR-34a表达，从而上调Bcl-2表达，抑制细胞凋亡。 通过 miR-34a/Bcl-2 通路。综上所述，这些研究结果表明，OST 在细胞和动物模型中均对软骨细胞具有保护作用，可减轻 LPS 诱导的应激反应，降低 KOA 大鼠的炎症水平和细胞凋亡。miR-34a 的下调及其继发的 Bcl-2 表达上调是其发挥抗凋亡作用的重要机制。这些结果为基于 OST 的专利药物开发及其在 KOA 治疗中的潜在临床转化提供了理论依据。

引言

膝骨关节炎（KOA）是一种常见的关节疾病，也称为增生性、肥大性或老年性膝关节炎。该病由关节软骨退变及关节周围结构改变引起。根据流行病学研究，膝骨关节炎是一种常见疾病，尤其在老年人群中更为普遍1。其发病率与年龄、体重、遗传、关节损伤等因素密切相关。生理功能也可能受到影响，包括关节活动受限、肌肉力量下降以及步态异常。目前，在膝骨关节炎的治疗中，常用的方法包括药物治疗、物理治疗、手术治疗和辅助治疗2。药物治疗通常包括镇痛药、非甾体抗炎药以及慢性关节炎用药，以减轻疼痛并控制炎症。物理治疗包括热敷、冷敷、按摩以及特定的康复训练，以改善关节运动功能并缓解疼痛。手术治疗可包括关节镜手术、人工关节置换或关节骨形态修复，以恢复关节结构与功能。此外，针灸、理疗和中药等补充疗法也广泛应用。

然而，尽管这些治疗方法在一定程度上能够缓解膝骨关节炎的症状和病情，但仍存在局限性。药物治疗可能带来不良反应和依赖性问题；物理治疗需要持续的康复过程，且疗效因个体差异而有所不同；手术治疗具有风险，恢复周期较长，需谨慎考虑；而辅助疗法虽然受到广泛关注并得到广泛应用，但其疗效仍缺乏充分的科学证据支持，其调控机制尚需深入研究。在辅助治疗中，中药治疗膝骨关节炎已在多个地区广泛应用，并被证实具有一定的疗效。其中必然存在一些尚未被充分认识的中药成分，但已通过长期实践和随访研究得到验证。目前，多种中药在治疗膝骨关节炎方面已积累了丰富的经验，例如金毛狗脊3、川芎4、独活5等。这些草药具有镇痛和抗炎作用，可有效缓解疼痛并减轻炎症。

OST 是一种香豆素类化合物，作为天然草本提取物在医学中被广泛应用6它具有多种药理活性，并得到大量研究的支持。研究表明，蛇床子具有抗肿瘤、抗炎、降血糖、抗血小板聚集和神经保护等多种药理作用，并对多种其他疾病具有潜在的治疗作用。7已有报道称，OST可通过调节自噬促进癌细胞凋亡，而OST通过LC3介导的自噬和GSDME依赖性焦亡抑制卵巢癌细胞的凋亡8；OST 诱导 HT-29 细胞凋亡 通过 内质网应激与细胞自噬9；OST促进结直肠癌细胞的凋亡 通过 抑制AMPK/Akt信号通路，诱导细胞自噬、活性氧（ROS）产生及铁死亡10; OST 可能通过调控自噬及线粒体介导的信号转导抑制结直肠癌的生长11同时，OST在缓解关节疼痛和改善关节功能方面具有重要意义，主要通过减轻炎症反应和缓解关节疼痛发挥作用。其活性成分能够减少炎症物质的释放，并抑制关节炎引起的关节软骨退变。与常见的西药相比，OST更安全、毒性低，长期使用不会产生耐药性。已有报道指出，蛇床子素通过上调转录因子osterix促进成骨细胞的成骨作用。 通过 cAMP/CREB 信号通路 体外 和 体内12; OST 通过增强自噬激活抑制膝骨关节炎的发展 通过 AMPK/ULK1 通路13；藁本内酯通过p38 MAPK、PI3K-Akt及c-Fos/NFATc1信号通路抑制破骨细胞分化14；藁本内酯通过雌激素-α/BMP-2/Smad信号通路在卵巢切除大鼠模型中预防骨丢失15; OST 通过增强间充质干细胞的自噬改善骨质疏松症16然而，观察与分析表明，大多数研究仍停留在表型层面，或未能揭示药物在分子水平上对信号通路的调控机制，这也是中药提取物难以被广泛接受的原因之一。因此，进一步探究蛇床子素在分子水平上的生物学调控机制，对其专利药物开发及临床应用具有重要意义。

miRNA 是一种通过抑制靶基因表达来调控生物功能的小分子 RNA。许多传统中药已知可通过调控 miRNA 发挥其生物学效应。类似地，有研究报道 OST 也可影响 miRNA 的表达。首先，OST 通过 miRNA 发挥抗肿瘤的生物学作用。已有报道指出，OST 通过降低 CPEB2 表达来抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡。 通过 上调子宫内膜癌中的miR-42417; OST 抑制人胶质瘤细胞的增殖并促进其凋亡 通过 miR-16 的上调和 MMP-9 的下调18; OST 通过抑制 PI3K/AKT/mTOR 通路并调控 hsa_circ_0007534/miR-214-3p 轴在视网膜母细胞瘤中发挥抗肿瘤作用19其次，OST 还可通过调控 miRNA 影响机体器官的生理过程，例如通过调节 miR-22–3p 介导的脂质代谢重编程来缓解肺血管重塑20；OST 对大鼠心肌缺血/再灌注损伤具有保护作用 通过 下调 miR-30a 并促进自噬21; OST通过p38MAPK/mTOR信号通路增强自噬，保护H9c2心肌细胞免受曲妥珠单抗诱导的损伤22第三，OST 可通过 miRNA 发挥神经保护作用，即在阿尔茨海默病细胞模型中促进神经干细胞向神经元分化。 通过 上调miR-9并挽救了APP/PS1转基因小鼠海马神经元的功能损伤23; OST通过上调阿尔茨海默病中miR-107的表达降低β-淀粉样蛋白水平 24然而，目前尚未见报道表明miRNA可通过OST调控来治疗膝骨关节炎。文献显示，miR-34a通过靶向DLL1并调控PI3K/AKT通路，可增强软骨细胞凋亡，促进骨关节炎的发展。25长链非编码RNA MEG3通过调控miR-34a/Klotho轴调节骨关节炎的进展26下调miR-34a通过激活PI3K/Akt通路促进大鼠骨关节炎软骨细胞增殖并抑制其凋亡27因此，骨关节炎能否用OST治疗 通过 miR-34a的调控作用？因此，推测OST可能通过调控miRNA来治疗膝骨关节炎。

综上所述，牡荆素（OST）是一种具有广泛药理活性的天然化合物28。此前，研究团队已证实OST可改善大鼠膝骨关节炎，但其生物学效应所涉及的细胞信号转导及分子机制尚未完全阐明。本文拟通过进一步研究OST对miRNA、自噬及凋亡信号通路的影响，明确OST在治疗膝骨关节炎中的作用机制，为其专利药物开发及临床应用提供新的思路与方向。

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方案

所有研究均经徐州医科大学实验动物护理与使用委员会批准。所用试剂和设备列于材料表中。

1. 动物模型

成年雄性和雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠，体重250–300 g，购自徐州医科大学实验动物中心。大鼠饲养于特定病原体阴性环境中。动物实验操作包括处理、护理及终点选择均遵循“动物研究：体内实验报告”（Animal Research: Reporting In Vivo Experiments）指南。动物实验采用随机分组。SD大鼠分为四组（每组n = 8）：正常组（无手术，正常喂养）（Normal组）、假手术组（Sham组：仅行皮肤和肌肉切口，不切断前交叉韧带[ACLT]，随后给予生理盐水灌胃）、KOA/NC组（ACLT手术+生理盐水灌胃）、KOA/OST组（ACLT手术+OST灌胃）。大鼠膝骨关节炎（KOA）模型采用前交叉韧带切断（ACLT）法构建，方法如前所述。29生理盐水组给予生理盐水 通过 灌胃，OST组给予OST 通过 灌胃4周。OST剂量为50 mg/kg体重（溶于PEG 400并用生理盐水稀释），给药频率为每日一次，持续4周，在大鼠部分中进行。随后，根据机构批准的方案处死大鼠以进行分析。组织样本立即置于液氮中冷冻或用4%多聚甲醛固定。

2. 细胞培养

人软骨细胞系（C28/I2）购自美国模式培养物集存库（ATCC，美国马纳萨斯，弗吉尼亚州）。细胞按照ATCC的培养指南进行培养，并在6个月内使用。

培养条件：DMEM/F-12 培养基添加 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素，于 37 °C、5% CO2 的湿化培养箱中孵育。

处理方法：将细胞以每孔1 × 106个细胞的密度接种于6孔板中；贴壁24小时后，分别给予LPS（1 µg/mL）单独处理或联合OST（100 µM）处理，持续24小时。

3. 细胞活力检测

将软骨细胞与不同浓度的OST或LPS在96孔板中共同孵育。CCK8实验通过酶标仪检测吸光度（OD450 nm）来反映细胞活力，OD值越高表明活细胞数量越多。

OST浓度梯度：0、25、50、100、200、400 µM（孵育24 h）。CCK8实验显示在所有浓度下细胞存活率均超过>90%，证实该化合物无细胞毒性。

LPS 浓度梯度：0、0.1、0.5、1、2 µg/mL（孵育 24 小时）。1 µg/mL LPS 组的细胞活力约为对照组（Ctrl 组）的 50%（vs. Ctrl 组），因此选择该浓度用于后续实验。

4. 苏木精-伊红（H&E）染色与固绿S染色

组织经石蜡包埋、脱蜡、再水化后，根据试剂生产商的说明，使用H&E以及番红O/固绿染色剂进行染色。 染色条件：AO工作浓度为1 µg/mL；细胞在37 °C避光孵育5分钟。

定量方法：使用ImageJ软件，对每个样本中5个随机视野（×400放大倍数）内含有橙色斑点的细胞进行计数，计算AVO阳性率。随后，在BX43显微镜下采集图像（放大倍数×400）。

5. 流式细胞术

收集细胞并重悬于Annexin-V FITC/PI溶液中，用于凋亡分析。孵育条件：将细胞以1 × 106 个细胞/mL的浓度重悬于Annexin-V FITC/PI溶液（KeyGEN）中，室温避光孵育15分钟。

设门策略：采用前向散射光（FSC）与侧向散射光（SSC）设门以排除细胞碎片；Annexin-V FITC⁺/PI⁻ 细胞定义为早期凋亡细胞，Annexin-V FITC⁺/PI⁺ 细胞定义为晚期凋亡细胞。设门图示见补充文件1（原始流式细胞术数据）。细胞由流式细胞仪收集，数据采用 Flow Jo 软件进行分析。

6. 质粒和模拟物的转染

miR-34a 模拟物（34a-mimic）和非特异性对照模拟物（NC）购自商业来源。根据制造商的说明，使用 LipofectamineTM 3000 将质粒转染至细胞中。

7. 吖啶橙染色

通常通过吖啶橙染色在细胞中评估自噬。细胞经特定浓度的LPS或OST处理24小时后，在避光条件下于37 °C用AO（1 µg/mL）孵育5分钟。使用激光共聚焦显微镜采集图像。使用ImageJ软件，通过计数每样本5个随机视野（×400放大倍数）中含橙色斑点的细胞，计算酸性囊泡细胞器（AVO）阳性率。数据以三次独立实验的均值±标准差表示。

8. 透射电子显微镜观察

样品用2.5%戊二醛和1%四氧化锇固定，然后进行脱水、漂洗和浸透处理。聚合后，使用超薄切片机将样品切成70 nm厚的切片。通过透射电子显微镜观察细胞的超微结构。

9. 免疫印迹

抗Bcl-2的小鼠单克隆抗体（#68103），抗LC3的兔多克隆抗体（#14600-1-AP） IL-6（21865-1-AP）和抗β-Actin的小鼠单克隆抗体（#66009-1-lg）购自Proteintech。IRDye 800CW标记的山羊抗兔IgG（H+L）（多克隆）和IRDye 800CW标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）（多克隆）二抗为商业获取。细胞采用全细胞裂解液裂解，裂解产物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。蛋白质通过一抗和相应的二抗进行检测。每泳道上样量为30 µg；一抗稀释比例分别为：Bcl-2（1:1000）、LC3（1:1500）、β-tubulin（1:5000）、IL-6（1:800）；二抗（IRDye 800CW）稀释比例为1:10,000。随后使用增强型化学发光激光成像扫描系统捕获蛋白条带。蛋白条带信号强度通过ImageJ软件进行定量分析。

10. 定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）

使用Trizol试剂从细胞中提取总RNA。以总RNA为模板，利用cDNA试剂盒合成cDNA，并采用SYBR Green法进行分析。miRNA的cDNA合成采用miRcute plus miRNA第一链cDNA合成试剂盒，并使用miRcute plus miRNA qPCR检测试剂盒进行分析。所有操作均按照制造商提供的说明书进行。目标转录本的表达量通过2-△△CT法计算。GADPH和U6分别作为mRNA和miRNA的上样内参。引物序列见表1。

11. 萤光素酶报告基因检测

野生型 psiCHECK2-Bcl-2-3′UTR 报告质粒（WT）和在 miR-34a 结合位点处含有突变的 psiCHECK2-Bcl-2-3′UTR 报告质粒（Mut）。将报告质粒与 miR-34a 模拟物使用 LipofectamineTM 3000 共转染至软骨细胞中。转染 24 h 后收集细胞并裂解。随后根据制造商说明书，使用 Dual-LumiTM 荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性。

12. 步态分析测试

采用MGT-PR系统观察各组大鼠跑动时的肢体运动。测试前，让大鼠适应跑道路面环境。记录自由行走过程中的步态数据，每只大鼠采集三次连续的有效行走试验。分析的参数包括步长、摆动时程以及左右后肢之间的协调性。

13. 统计分析

实验均设置三个重复，并独立重复至少三次。统计分析使用 GraphPad Prism 9 软件进行。数据以均值 ± 标准差表示。多组间比较采用单因素方差分析（Tukey 事后检验），两组间比较采用双尾 Student t 检验。当 p < 0.05 时，认为差异具有统计学显著性。

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结果

OST保护 软骨细胞 体外 和 体内
作为一种天然产物，OST的安全性需要进行深入研究。本研究首先采用CCK8法在体外评估了OST对软骨细胞的细胞毒性。结果显示，即使在400 µM浓度下，OST对软骨细胞也未表现出毒性图1A）。为了检测OST对软骨细胞的抗炎和抗凋亡作用，在LPS和OST处理后，采用CCK8法评估细胞死亡情况。结果显示，LPS可增加软骨细胞死亡，而OST处理对细胞死亡具有一定程度的保护作用（图1B此外，采用透射电子显微镜观察软骨细胞的超微结构。

结果显示，软骨细胞经LPS处理后，内质网、线粒体及其他细胞器出现肿胀和破裂，胞质中空泡数量增多。然而，OST处理减轻了LPS诱导的细胞应激反应（图1C）。

同时，OST的保护作用 在体内

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讨论

最重要的是，OST 保护软骨细胞免受 LPS 诱导的应激损伤 体外 并减轻了骨关节炎大鼠的炎症和细胞凋亡 体内这些保护作用与miR-34a的下调以及随之而来的Bcl-2表达增加相关，符合miR-34a/Bcl-2轴在介导OST作用中的假设功能。

在本研究中，OST被发现可促进软骨细胞的自噬并减少细胞凋亡 体外 和 体内相关研究的分子机制被详细分析了在 图8首先，OST 毒性较低，可在体外缓解脂多糖（LPS）诱导的细胞应激反应，并在通过前交叉韧带切断术（ACLT）构建的膝骨关节炎（KOA）模型中表现出对炎症和细胞凋亡的保护作用。图1, 图2，以及 图3）。随后研究发现，OST可增加软骨细胞中的自噬体，同时缓解脂多糖（LPS）诱导的细胞应激（图4），并通过上调Bcl-2和IL-6...

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披露

作者无经济利益冲突。

致谢

本研究由江苏大学新药与临床医学重点实验室（项目编号：XZSYSKF2021037）资助。本文的部分实验在徐州医科大学公共实验研究中心和实验动物中心完成。谨向董福兴、张克佳、蒯金霞和张敏提供的热心帮助表示感谢。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1% 四氧化锇Ruixin Technology
2.5% 戊二醛Zhongjingkeyi Technology
吖啶橙SigmaAmresco 0360
Annexin-V FITC/PI 溶液KeyGENKGA107
Bcl-2Proteintech#68103
细胞计数试剂盒-8VICMED39.VC5001L
化学发光Odyssey CLX
共聚焦显微镜LeicaSTELLARIS 5
DMEM/F-12HyClone12.SH30023-01
Dual-LumiTM 荧光素酶报告基因检测试剂盒BeyotimeRG088
FastKing cDNA 反转录试剂盒TIANGENKR116-03
流式细胞仪BDFACS Canto II
人软骨细胞系American Type Culture CollectionYTLK280144
LC3Proteintech#14600-1-AP
LipofectamineTM 3000InvitrogenL3000015
脂多糖Sigma29.L2880
裂解检测KeyGENKGP704-100
酶标仪BioTekSynergy 2
miRcute plus miRNA 第一链 cDNA 合成试剂盒TIANGENKR211-02‌
miRcute plus miRNA qPCR 检测试剂盒TIANGENFP411-02
蛇床子素MedchemexpressO815127-25g
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳NCM BiotechP2012
血清Clark BioscienceFB15015
SYBR GreenTIANGENFP217-01‌
透射电子显微镜FEITecnai G2
超薄切片机LeciaUC7
正置荧光显微镜OlympusBX43
β-ActinProteintech#66009-1-lg

参考文献

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