细颗粒物（PM2.5）暴露后大鼠睾丸损伤的延迟性与进行性特征研究

摘要

PM2.5暴露通过持续的炎症反应、生精细胞凋亡增加、连接蛋白-43/闭合蛋白（Connexin-43/Occludin）表达下调以及JNK通路激活相关的信号传导，在大鼠模型中引发迟发性睾丸损伤，凸显其对男性生殖健康的长期威胁。

摘要

细颗粒物（PM2.5）在男性生殖功能障碍中的作用日益受到关注。然而，由于大多数研究仍集中于短期暴露效应，暴露后延迟出现、持续存在或进行性加重的睾丸损伤——这对长期风险评估至关重要——仍缺乏充分认识。我们建立了一个时间分辨的大鼠模型，以确定损伤在暴露结束后是否持续或加重。将72只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为九组（对照组；溶剂对照组在24小时、1个月、2个月和4个月；PM2.5处理组在相同时间点），以5 mg/kg/天的剂量经鼻腔给予PM2.5，连续7天。我们定量分析了精子质量及生殖器官指数，检查了睾丸组织学和超微结构，检测了血清睾酮、FSH、LH和E2水平，分析了炎症细胞因子mRNA表达谱（IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ），通过TUNEL法评估生精细胞凋亡，并检测了连接相关蛋白和应激相关蛋白（Connexin-43、Occludin、JNK）的表达。PM2.5暴露导致精子浓度和活力持续下降，畸形率升高，以及睾丸和附睾萎缩，这些损伤在暴露后4个月内未见恢复。组织学显示生精上皮进行性变薄，超微结构出现退行性改变。内分泌紊乱亦明显，表现为睾酮水平降低及促性腺激素异常。机制上，PM2.5暴露持续上调IL-1β和IL-6的表达，促进生精细胞凋亡，下调Connexin-43和Occludin表达，并呈现JNK通路激活的特征性模式。综上所述，这些结果表明PM2.5暴露结束后仍存在延迟性和进行性睾丸毒性，提示维持细胞连接完整性及靶向干预JNK通路可能有助于减轻长期生殖损害。

引言

PM2.5 是一种复杂的细颗粒物混合物，其空气动力学直径≤2.5µm，来源于工业排放、机动车尾气和生物质燃烧，已成为全球主要的环境污染物之一¹。流行病学研究显示，PM2.5 暴露与呼吸系统和心血管疾病²以及生殖系统功能障碍³密切相关。其中，男性生育力受影响尤为令人关注，因为已有证据表明空气污染可降低精子质量⁴。全球范围内，男性因素导致了超过一半的不孕不育病例，且多项研究报道近几十年来精子参数出现显著下降⁵。近期的全球分析进一步证实，多个地区的精子质量普遍存在下降趋势⁶。尽管吸烟、饮酒、辐射和化学物质暴露等因素已被确认为明确风险因素⁷，PM2.5 已被认定为一种新的靶向睾丸的生殖毒性物质⁸。

由于睾丸具有独特的生理结构和持续的生精活动，其对环境毒物极为敏感。既往研究表明，PM2.5暴露可通过多种途径诱导睾丸损伤，例如氧化应激、炎症反应以及血睾屏障的破坏⁹。这些急性效应表现为精子质量下降、睾丸组织学异常以及激素水平失衡¹⁰。然而，大多数研究集中于即时性损伤，对长期或延迟效应的特征描述仍较为匮乏。

目前的PM2.5暴露模型存在固有局限性：全身吸入暴露可模拟自然暴露过程，但需要专用设备且缺乏剂量精确性¹¹；而气管内滴注虽能确保剂量控制，但具有侵入性，且无法复制生理条件下的颗粒物沉积过程¹²。我们建立的时间分辨鼻内暴露模型克服了这些缺点——该模型采用非侵入性给药方式，符合上呼吸道颗粒物沉积规律，可实现精确的剂量控制，并支持长期、多时间点采样，从而捕捉延迟性损伤，其能力超越了传统以急性暴露为重点的模型¹³。

我们采用的5 mg/kg/天PM2.5剂量符合已证实可引发生殖反应的啮齿类动物亚急性暴露模型；通过体表面积换算，该剂量相当于人类等效剂量，约为环境水平的6倍，此倍数常用于加速长期毒性效应的显现¹⁴。需考虑物种差异：尽管大鼠的睾丸生理与人类具有保守性，但其较短的精子发生周期可能加快我们在观察时间点所见损伤的进展¹⁵；此外，经鼻给药与人类下呼吸道沉积方式不同，但毒素经全身循环到达睾丸的途径已有证实。

环境毒物暴露的延迟效应对于评估长期生殖风险至关重要，因为这些效应可能揭示出在短期观察中不明显的不可逆损伤¹⁶。例如，某些毒物可对睾丸造成潜伏性损伤，即使在暴露停止后，这些损伤仍可能随时间推移逐渐显现或加重，进而可能导致慢性生殖功能障碍¹⁷。鉴于PM2.5的普遍性和持久性，明确其生殖毒性在暴露后是否持续或加重显得尤为关键¹⁸。

持续的炎症、氧化应激以及修复机制受损可能是延迟效应的合理驱动因素。PM2.5诱导的IL-1β、IL-6和TNF-α上调可维持慢性炎症，破坏精子发生过程，并促进生殖细胞凋亡¹⁹。关键连接蛋白（如Connexin-43和Occludin）的损伤会破坏血睾屏障，可能阻碍功能恢复²⁰。c-Jun氨基末端激酶（JNK）通路的激活也已被认为与此相关，该通路是应激和凋亡信号传导的中介分子²¹。

尽管PM2.5的生殖毒性日益受到关注，但在暴露停止后睾丸损伤的时间动态变化方面仍存在显著的知识空白。具体而言，睾丸损伤持续多长时间、是否会随时间推移而加重，以及驱动这些延迟效应的分子通路是什么，目前尚不明确²²。解答这些问题对于制定针对性的预防和治疗策略以减轻PM2.5引起的男性生殖损害至关重要。

关于PM2.5暴露停止后所致睾丸损伤的持续时间、进展过程及作用机制，目前仍存在显著的研究空白。本研究通过在暴露后多个时间点评估生殖终点指标、组织病理学变化、激素谱（特别是卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）和雌二醇（E2））、炎症反应、细胞凋亡以及屏障蛋白的表达，填补了这些空白。研究结果揭示了PM2.5对男性生殖健康的长期风险，为保护男性生育力的公共卫生策略提供了科学依据。

方案

所有动物实验均按照机构规定进行，并经福建卫生职业技术学院动物伦理委员会批准（项目批准号：DW2024-01）。

安全与危险废物处理
甲醛、四氧化锇和氯仿等有毒试剂均在经认证的通风橱中操作，并佩戴适当个人防护装备。含卤有机废物及含锇溶液收集至指定容器中，并根据机构规定进行处置。戊巴比妥钠作为管制药品进行登记管理，研究过程中对锐器均采取安全处理措施。

PM2.5 材料与处理
使用一种 PM2.5 标准参考物质进行给药。按照既定的颗粒物制备流程，在使用前立即将干燥粉末悬浮于无菌 PBS 中，达到所需浓度后，在水浴中超声处理 10–15 分钟，不添加表面活性剂。工作悬浮液每日新鲜配制。通过鲎试剂变形细胞溶解物检测法测定内毒素水平，结果未检出。必要时，设置多粘菌素 B 对照，以排除脂多糖（LPS）介导的效应。

动物模型的构建 体内实验
将72只SPF级雄性Sprague-Dawley大鼠（2月龄，体重190 ± 10 g）在标准条件下饲养，并随机分为9组（每组n = 8），包括对照组、溶剂对照组（分别在24小时、1个月、2个月和4个月采样）以及PM2.5暴露组（在相同时间点采样）。在轻度异氟烷麻醉下，每日一次经鼻给予PM2.5，剂量为5 mg∙kg^-1∙day^-1，每侧鼻孔10–20 µL，连续给药7天。给药后，将大鼠置于仰卧位1–2分钟，以促进吸入。动物饲养至预定的暴露后时间点实施安乐死，并记录体重用于器官系数计算。检测终点包括器官系数、精子质量、组织学与超微结构、血清生殖激素水平以及分子检测。

生殖器官形态学及精子质量评估
在深度戊巴比妥麻醉下解剖取出睾丸和附睾，吸干后称重，计算器官系数。将尾部附睾剪碎于预热至37 °C的缓冲液中，收集精子。使用血细胞计数板测定精子浓度。在预热载玻片上选取五个或以上无重叠视野，每个视野至少观察200个精子，以评估精子活力。精子形态学评估前需进行固定、涂片，并用伊红-亚甲蓝或Diff-Quik染色，每只大鼠至少分析200个精子。所有评估均采用盲法进行，技术重复样本的结果取平均值，每只动物获得一个最终数值。

睾丸组织的组织学与超微结构分析
睾丸组织用10%中性缓冲甲醛固定，经梯度乙醇和二甲苯处理后，包埋于石蜡中，并切成5 µm厚切片用于HE染色。染色切片采用系统随机取样法进行评估，排除斜切、人为假象或固定不良的切片。管腔直径根据正交轴计算，上皮厚度在等间距点位测量。分析过程采用盲法，每只大鼠至少评估10个生精小管。

用于透射电镜观察时，将小块组织用戊二醛固定，四氧化锇后固定，脱水，树脂浸透并聚合。超薄切片用醋酸铀和柠檬酸铅染色，在60-120 kV电压下以一致的参数进行成像。质量控制包括评估膜结构和线粒体完整性，并避免提取假象。

酶联免疫吸附测定（ELISA）
在固定早晨时间段内，于麻醉状态下经腹主动脉采集血液，以控制昼夜节律变异。血液凝固后经离心分离，血清被分装并储存于−80 °C。采用经过验证的免疫分析平台对睾酮、卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）和雌二醇（E2）进行定量检测。样本均设复孔并包含适当的对照，检测精密度符合该平台的技术规范。溶血或脂血样本予以剔除。

实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）
采用苯酚-氯仿法从睾丸组织中提取总RNA，并通过异丙醇沉淀和乙醇洗涤进行纯化。RNA质量通过分光光度法测定验证。合成cDNA后，在标准循环条件下使用染料法化学试剂进行RT-qPCR扩增，并进行熔解曲线分析。基因表达水平采用2^−ΔΔCq法以GAPDH为内参进行归一化处理。

Western blot 分析
使用含蛋白酶抑制剂的 RIPA 缓冲液制备蛋白裂解物，通过 BCA 法定量，并在上样缓冲液中变性。在受控条件下进行 SDS-PAGE 电泳和 PVDF 转膜。膜经封闭后，依次与 Connexin-43、Occludin、JNK 和 GAPDH 的一抗孵育，随后与 HRP 标记的二抗孵育。通过化学发光法检测条带，采用背景扣除、以 GAPDH 为内参进行归一化，并相对于对照组进行标准化处理进行密度测定。

统计分析
数据以均值 ± 标准差表示。采用单因素方差分析（One-way ANOVA）结合 Tukey's 事后检验或 Student's t在适当情况下采用检验，非参数数据通过Mann-Whitney分析 U 检验。P 值 < 0.05 被视为具有显著性。

完成与清理
所有危险化学废物均已登记并妥善处理。原始数据（包括仪器输出结果和分析文件）已连同相应记录一并归档，以确保可追溯性。

结果

暴露于PM2.5导致大鼠雄性生殖功能持续恶化，表现为精子质量下降和生殖器官发育受损

为研究PM2.5对雄性生殖功能的影响，检测了九组雄性大鼠的精子质量、生殖器官系数及相关指标，并以暴露后24小时为时间点进行分析。尽管未设置第7天的采样时间点，但在当前实验方案下，炎症反应和组织学损伤已明显出现，表明该暴露条件具有有效性。

暴露于PM2.5的大鼠表现出精子浓度和活力下降，同时精子畸形率升高，这些异常在暴露后4个月内未见恢复迹象（图1A）。睾丸和附睾重量及其器官指数同样显著降低，且在暴露后4个月内未见改善，提示存在持续性萎缩（图1B）。这些结果表明，PM2.5暴露可导致精子质量及生殖器官发育的长期损害。

7天PM2.5暴露后进行性加重的睾丸组织病理学损伤及激素失衡

讨论

短期PM2.5暴露后，男性生殖功能在暴露后1至4个月内呈进行性下降。这些发现支持PM2.5具有持续性的、与时间相关的生殖毒性，即使在暴露停止后仍持续存在，并进一步拓展了既往关于PM2.5相关生殖功能损伤的观察结果²³。

为了提高可重复性，我们对四个要素进行了标准化。首先，通过将剂量按体重进行归一化、控制鼻内给药体积和体位，并采用短暂麻醉结合仰卧位恢复，以维持暴露条件的一致性。其次，设定分阶段的暴露后观察时间点（24小时、1个月、2个月和4个月），以捕捉从急性反应向慢性进展的转变过程。第三，分子水平的质量控制包括RNA纯度阈值、限制逆转录定量PCR（RT-qPCR）的技术变异，以及采用泳道匹配的蛋白质印迹（Western blot）归一化方法。第四，形态学预处理遵循定时固定、后固定以及脱水/渗透步骤，以满足透射电子显微镜（TEM）的要求。

组织学和超微结构显示生精上皮变薄以及连接结构受损，提示在暴露停止后仍存在持续的不良微环境。内分泌谱在后期时间点表现出睾酮-促性腺激素模式的不协调...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1% 四氧化锇	TCI, 中国	O0308	用于睾丸组织透射电镜分析中的后固定
10% 中性缓冲福尔马林	Solarbio, 中国	PC0020	用于睾丸组织样本在苏木精-伊红染色中的固定
2.5% 戊二醛	Solarbio, 中国	G1102	用于睾丸组织样本在透射电镜分析中的固定
75% 乙醇	Acros Organics, 美国	61509-0040	用于RT-qPCR中沉淀RNA的纯化
全自动化学发光成像仪	Bio-Rad, 美国	ChemiDoc	用于Western blot中化学发光信号的自动成像
BCA蛋白检测试剂盒	Solarbio, 中国	PC0020	用于Western blot分析中总蛋白浓度的测定
封闭缓冲液	未指明	T7131A	用于Western blot分析中消除非特异性结合
氯仿	Acros Organics, 美国	327270010	用于RT-qPCR中RNA的分离
连接蛋白-43	Abcam, 美国	ab11370	检测关键血睾屏障蛋白的表达与分布，以评估屏障完整性
ECL试剂盒	Biosharp, 中国	BL520B	用于Western blot分析中蛋白条带的显影
ELISA试剂盒（用于睾酮、FSH、LH、E2）	Abcam, 英国	ab108666; ab1086702; ab108651; ab108667	用于检测血清生殖激素
伊红	Solarbio, 中国	G1002	用于睾丸组织的苏木精-伊红染色
环氧树脂	Solarbio, 中国	GP2001	用于透射电镜分析中睾丸组织样本的包埋
GAPDH	Abcam, 美国	ab128915	评估PM2.5诱导的睾丸细胞凋亡，并为研究其对睾丸细胞凋亡的影响提供形态学依据
苏木精	Solarbio, 中国	G1077	用于睾丸组织的苏木精-伊红染色
成像系统	Nikon, 日本	Nikon DS-U3	用于显微镜下样本的成像
异丙醇	Acros Organics, 美国	AC447080025	用于RT-qPCR中RNA的沉淀
JNK	Abcam, 美国	ab124956	探索PM2.5引起睾丸损伤的分子机制，并鉴定其激活的细胞类型
酶标仪	MOLECULAR DEVICES, 美国	SpectraMax iD3	用于微孔板信号的检测（如吸光度、荧光）
闭合蛋白	Abcam, 美国	ab31721	了解血睾屏障的损伤程度，并探索相关蛋白之间的相互作用
光学显微镜	重庆光电仪器有限公司, 中国	BDS200	用于常规光学显微观察
病理切片机	上海开域仪器有限公司, 中国	RM2016	用于病理组织切片的切割
戊巴比妥钠	Solarbio, 中国	G1102	用于大鼠采血前的腹腔注射
PM2.5标准参考物质	中国计量科学研究院	GBW13643	用于实验组PM2.5暴露
聚偏二氟乙烯（PVDF）膜	Thermo Fisher, 美国	88585	用于Western blot分析中的蛋白转印
PrimeScript RT试剂盒	TAKARA, 日本	RR037Q	用于RT-qPCR中的cDNA合成
实时PCR系统	Roche, 瑞士	LightCycler 480	用于基因表达分析的实时聚合酶链式反应
RIPA裂解缓冲液	TAKARA, 日本	RR9161	用于Western blot分析中的蛋白提取
摇床	Thermo, 美国	MAXQ-4000	用于实验中样品的振荡
SPSS	IBM, 美国	28	用于数据分析
无菌生理盐水	Solarbio, 中国	S8160	用于对照组处理
TB Green Premix Ex Taq II试剂盒	TAKARA, 日本	RR820S	用于RT-qPCR
透射电子显微镜（TEM）	日立, 日本	HT7800/HT7700	用于纳米尺度的超微结构观察
Trizol试剂	Ambion, 中国	15596018	用于RT-qPCR中总RNA的提取
超薄切片机	Leica, 德国	Leica UC7	用于制备透射电镜用的超薄切片
通用蛋白转印系统 / 蛋白转印印迹仪	Bio-Rad, 美国	Trans-Blot Turbo	用于Western blot中的蛋白转印
正置光学显微镜	Nikon, 日本	Nikon Eclipse E100	用于正置光学显微观察
醋酸铀	Merck, 德国	201030	用于睾丸组织透射电镜分析中超薄切片的染色