使用基于MLV的假病毒鉴定SARS-CoV-2进入抑制剂作为潜在抗病毒药物的实验方案

摘要

本文介绍了利用荧光素酶报告系统制备SARS-CoV-2假病毒颗粒的方法及其在筛选病毒进入抑制剂中的应用。本方案以两种不同的进入抑制剂为例进行演示：重组人ACE2-Fc融合蛋白和小分子化合物阿比多尔。

摘要

SARS-CoV-2 病毒是一种新出现的动物源性病原体，自2019年出现以来，在全球范围内造成了巨大的疾病负担和死亡率。安全且易于获取的平台对于评估病毒进入机制及潜在抗病毒化合物至关重要，有助于持续针对新出现的变异株开展药物研发。本文介绍了一种高度优化的实验方案，用于制备表达 SARS-CoV-2 刺突蛋白并携带荧光素酶报告基因的鼠类白血病病毒（MLV）基础的假病毒颗粒，从而可在生物安全二级（BSL-2）条件下研究病毒进入过程。文中详述了优化细胞系的使用、利用低成本试剂实现高效转染、高效假病毒的生产，以及通过滴定感染性以确定筛选实验所需的最低病毒输入量。代表性结果表明，与未感染对照组相比，感染细胞中可检测到显著的荧光素酶活性；而无刺突蛋白对照组及 VSV-G 假病毒对照组则验证了该实验的特异性。此外，该系统支持化合物筛选，可通过量化其对病毒进入的抑制作用，并结合 MTT 活性检测评估细胞毒性，实现综合评价。总体而言，该可重复且可扩展的实验方案为中高通量筛选新型病毒进入抑制剂提供了一个可靠的平台，有助于发现抗病毒候选分子，并推动对 SARS-CoV-2 病毒进入机制的研究。

引言

2019年末，严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的出现引发了一场全球大流行，导致全球数百万人死亡，且随着传染性更强、免疫逃逸潜力更高的新变异株不断出现，该病毒仍持续构成威胁¹。作为一种冠状病毒科的有包膜RNA病毒，SARS-CoV-2通过其三聚体刺突（S）糖蛋白与宿主细胞的血管紧张素转换酶2（ACE2）受体结合，并经由TMPRSS2及其他宿主蛋白酶进行蛋白水解激活，从而介导病毒进入宿主细胞^2,3。尽管目前已开发出多种治疗手段以缓解COVID-19症状，但病毒持续进化及新变异株的快速出现，凸显了建立安全且可扩展的研究系统以探索病毒进入机制并评估靶向感染早期阶段的新型抗病毒化合物的迫切需求⁴。

由于SARS-CoV-2病毒具有较高的传播潜力，在一些地区仍被归类为生物安全等级3级（biosafety level 3）的病原体⁵。因此，任何涉及病毒复制的实验操作都必须在高等级防护的BSL-3实验室中进行，这限制了大多数研究机构开展相关科学研究的能力。基于假病毒（pseudotyped virus）的系统，也称为伪病毒（PVs），提供了一种实用的替代方案，可在生物安全等级2级（BSL-2）实验室中进行病毒入侵研....

方案

1. 使用支化聚乙烯亚胺（PEI）高效转染衍生自HEK293T的细胞

注意：所有步骤均须在生物安全柜中进行，并采用标准无菌技术和 BSL-2 操作规程。使用 HEK293T 衍生细胞进行转染及假病毒的制备。本方法中，细胞转染在经细胞培养处理的 6 孔板中进行。PEI 储存液的配制方法参照 Yang 及其同事（2017）先前所述¹²。在进行三质粒共转染以生成假病毒之前，建议优化 PEI 与质粒 DNA 的最佳比例，以确保高转染效率（超过 70–80%）。该优化可通过转染表达绿色荧光蛋白（GFP）的质粒，随后使用荧光显微镜观察荧光细胞的比例来完成。在优化过程中，每孔质粒 DNA 保持恒定为 2.5 µg，测试不同体积的 PEI（范围为 1–20 µL）。以下为本批次细胞和 PEI 的最佳条件：每孔加入 5 µL PEI 储存液（1 mg/mL）和 2.5 µg GFP 表达质粒，使用 6 孔板进行转染。

1. 转染前24小时，在6孔组织培养板中每孔接种7.5 × 10⁵个HEK293来源的细胞，每孔总体积为2 mL完全培养基（DMEM-C：添加10%热灭活胎牛血清（FBS）、20 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）、100 IU/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的DMEM培养基）。
   注意：接种细胞时，避免以环形方式移动组织培养....

结果

已有多种转染方法被报道可用于生成假型病毒（PVs），包括磷酸钙法¹⁵、基于脂质的方法¹⁶以及线性和支化聚乙烯亚胺（PEI）法。本文表明，使用支化PEI转染HEK293T来源的细胞可实现高效转染（图1），其效率通常与使用商业化的脂质体转染试剂的方法相当（数据未显示）。此处展示的是在本实验条件下确定的PEI最优用量的代表性结果，即在第1节所述条件下，每2.5 µg表达GFP的质粒使用5 µL PEI储存液。然而，建议在每次使用新的质粒批次或PEI时，在此步骤中进行优化实验，测试多种表达GFP的质粒与PEI的比例，保持质粒用量恒定，而PEI用量则在1至20 µL之间梯度变化（PEI储存液浓度为1 mg/mL）。随后选择最佳比例，再进行假型病毒的制备。

需要注意的是，转染效率高达70-80%以上对于获得高滴度病毒至关重要。该效率可通过其他方法（如流式细胞术）进行更严格的定量；然而，荧光显微镜可作为一种快速、定性且便捷的方法，在转染48小.......

讨论

已有文献报道，MLV系统在构建其他病毒假型方面的多功能性，适用于多种重要病毒，例如埃博拉病毒¹⁸、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）⁸、严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）¹⁹、拉克罗斯病毒（La Crosse virus）²⁰、汉坦病毒（Hantavirus）²⁰、维斯na病毒（Visna virus）²¹、沙粒病毒（Arenavirus）²²、流感病毒（Influenza virus）²³等。这些假型病毒在多种应用中具有重要价值，包括研究病毒嗜性¹⁹、在基因治疗中的潜在应用²⁴、中和抗体的检测与定量²⁵

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.2 µm 低蛋白吸附注射器滤器	Thermo Scientific	720-1320	注射器滤器（0.2 μm，13 mm，PES，无菌）
0.25% 胰蛋白酶-EDTA 1X 溶液	Gibco	25200-056	胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红
0.45 µm PVDF 瓶顶过滤装置	Avantor	514-1045	真空瓶顶过滤系统（PVDF，250 ml，50 mm，0.45 µm）
1.5 mL 无菌微量离心管	Eppendorf	30123611	安全锁 管
100 X 青霉素-链霉素溶液	Corning	30-002-CI	青霉素-链霉素溶液，100倍浓缩
5 X 荧光素酶检测裂解缓冲液	Promega	E2650	属于 Promega Bright-Glo 荧光素酶检测试剂盒的一部分
50 mL 无菌锥形离心管	Corning	352070	50 mL 高透明度聚丙烯离心管，锥底，无菌
6 孔组织培养板	Thermo Scientific	140675	细胞培养处理多孔板
96 孔组织培养板	Thermo Scientific	168055	Nunc™ MicroWell™ 96 孔，Nunclon Delta 处理，平底微孔板
盐酸阿比朵尔	Sigma-Aldrich	SML0860
支化聚乙烯亚胺，25 kDa	Sigma-Aldrich	408727
共聚焦激光扫描显微镜 （FV 3000）	Olympus Co.	SKU: FV3000
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich	D8418
DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基），含：高糖、L-谷氨酰胺、酚红、丙酮酸钠	Gibco	11995-065
胎牛血清（FBS）	Gibco	26140-079	经热灭活处理（56°C，30 分钟）
HEK293T 来源细胞（Lenti-X 293T 细胞系）	Takara Bio	632180	高转染效率的 HEK293 细胞亚克隆，支持高水平病毒蛋白表达
HEPES 缓冲液	Gibco	15630-080
高易感性感染细胞（293T-ACE2.TMPRSS2 (mCherry) 细胞系）	BEI Resources	NR-55293	经基因改造稳定表达 ACE2 和 TMPRSS2 的 HEK293T 细胞系
盐酸	Sigma-Aldrich	H1758-500ML
倒置相差显微镜	Olympus Co.	SKU: 2404040005
异丙醇	Sigma-Aldrich	I9516-500ML
荧光素酶底物	Promega	E2650	属于 Bright-Glo 荧光素酶检测试剂盒的一部分
带发光检测功能的微孔板读数仪	Agilent BioTek	BTH1MG
MTT [3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐]	Sigma-Aldrich	M2128
不透明白色 96 孔板	Corning	3917	96 孔实心白色平底聚苯乙烯组织培养处理微孔板
Parafilm 封口膜	Bemis	PM999
pcDNA3-EGFP 质粒	Addgene	13031	pcDNA3-EGFP 由 Doug Golenbock 惠赠（Addgene 质粒 # 13031；http://n2t.net/addgene:13031；RRID:Addgene_13031）
pCMV-MLVgagpol 质粒	-	-	由 Gary Whittaker 博士惠赠
不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的磷酸盐缓冲液（PBS）	Corning	21-040-CV	磷酸盐缓冲液，1X，不含钙和镁
Promega PureYield 质粒大提系统	Promega	A2393
pTG-Luc 质粒	-	-	由 Gary Whittaker 博士惠赠
pUNO1-SARS-CoV-2 刺突蛋白（武汉株）质粒	Invivogen	p1-spike
pVSV-G 质粒	Addgene	138479	pVSV-G 由 Akitsu Hotta 惠赠（Addgene 质粒 # 138479；http://n2t.net/addgene:138479；RRID:Addgene_138479）
重组人 ACE2-Fc 融合蛋白	Invivogen	fc-hace2
低血清培养基（Opti-MEM）	Gibco	31985-070	Opti-MEM 低血清培养基