使用CUT&RUN技术对神经内分泌小细胞肺癌细胞系进行全基因组组蛋白修饰和转录因子结合位点作图

摘要

本文描述了一种针对神经内分泌型小细胞肺癌细胞系优化的靶点下方切割并利用核酸酶释放后接高通量测序（CUT&RUN-seq）实验方案。该方法可实现全基因组范围内多种组蛋白修饰及转录因子（如 E2F7）结合位点的定位，用于研究小细胞肺癌病理生物学中的表观遗传学及转录调控异常。

摘要

染色质重塑蛋白和转录因子（TFs）在小细胞肺癌（SCLC）的肿瘤生物学中发挥关键作用。全基因组水平上对组蛋白翻译后修饰（PTMs）和转录因子结合位点进行表征，对于识别调控性DNA元件和基因通路至关重要，有助于深入理解SCLC的分子机制，并筛选出可用于治疗干预的潜在靶点。靶点切割与核酸酶释放结合下一代测序技术（CUT&RUN-seq）是一种强大的方法，可用于绘制特异性组蛋白修饰图谱并确定多种蛋白质的DNA结合特征 原位 在细胞基因组中。在CUT&RUN，即与蛋白A/G融合的微球菌核酸酶（MNase）被招募 通过 抗体靶向染色质相关蛋白的基因组定位，其中在MNase激活和切割后，潜在的DNA片段从大量染色质中释放出来。这种局部消化产生适用于测序的小片段、位点特异性的DNA片段。

本文介绍了一种针对小细胞肺癌（SCLC）中组蛋白修饰H3K4me3（与活跃或开放的启动子相关）和H3K4me1（与活跃增强子相关）以及转录因子E2F7进行分析的详细实验方案。该方案已针对神经内分泌型（NE）SCLC细胞系模型进行了优化，这类细胞通常具有大核、胞质稀少，并以非贴壁聚集体的形式在悬浮培养中生长。

引言

组蛋白翻译后修饰（PTMs）和转录因子（TFs）是基因表达的核心调控因子。组蛋白PTMs主要发生在其N端尾部，如乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化，可影响染色质结构^1,2。在癌症中，组蛋白PTMs常出现失调，导致癌基因异常激活或抑癌基因沉默³。转录因子通过结合启动子或增强子区域的特定DNA序列来激活或抑制靶基因表达，通常招募组蛋白修饰酶以协同染色质重塑过程⁴。负责书写、擦除或识别组蛋白修饰标记的酶类，如组蛋白乙酰转移酶（HATs）、组蛋白去乙酰化酶（HDACs）和甲基转移酶（HMTs），在癌症中频繁发生突变或失调，因而成为有前景的治疗靶点⁵。

在小细胞肺癌（SCLC）中，表观遗传改变和谱系决定性转录因子（LDTFs）是肿瘤生物学的关键驱动因素⁶。与基因突变不同，表观遗传改变（包括DNA甲基化和组蛋白修饰）可在不改变DNA序列的情况下调控基因表达。这些修饰可导致抑癌基因沉默或癌基因激活，从而促进SCLC的侵袭性行为。例如，组蛋白甲基转移酶KMT2D在一项大规模真实世界SCLC患者队列中突变频率高达12.9%⁷，该酶负责组蛋白H3赖氨酸4单甲基化（H3K4me1），这是一种与基因组中活性增强子区域相关的表观遗传标记。SCLC是一种分子异质性疾病，根据四种LDTFs的差异表达，可将SCLC分为不同的分子亚型：achaete-scute同源物1（ASCL1）、神经源性分化因子1（NEUROD1）、YAP1以及POU类2同源框3（POU2F3）。其中神经内分泌（NE）亚型（包括ASCL1和NEUROD1）约占SCLC病例的70–80%⁸。因此，研究不同SCLC亚型中各类组蛋白翻译后修饰（PTMs）及转录因子结合位点的分布与特征，可能揭示对治疗干预敏感的亚型特异性基因调控程序。

在全基因组水平上鉴定组蛋白翻译后修饰以及序列特异性调控蛋白结合位点的传统方法是染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）⁹然而，ChIP-seq 需要大量的起始细胞，且通常在整个基因组范围内产生较高的背景信号。因此，为了从噪声中区分出真实信号，ChIP-seq 要求目标蛋白具有较高的富集度，并需要进行深度测序以实现有效的数据分析。此外，ChIP-seq 中使用的甲醛交联可能掩盖表位，并产生假阳性结合位点。¹⁰靶标位点切割与核酸酶释放结合下一代测序技术（CUT&RUN-seq）是一种用于绘制组蛋白PTMs和转录因子结合位点的高分辨率替代方法 原位 在完整细胞内。该方法中，先将透化的细胞与靶向目标染色质相关蛋白的抗体孵育，随后加入蛋白A(G)-微球菌核酸酶（MNase）融合蛋白进行结合。在高钙低盐条件下诱导目标蛋白邻近DNA的特异性消化，释放出特定的DNA片段并进行纯化。纯化的DNA片段用于构建带条形码的测序文库，可合并后进行高通量测序^11,12,13,14与ChIP-seq相比，CUT&RUN 所需输入细胞数量显著更少，背景噪音更低，可避免交联假象，且需要的测序读数更少，因此在成本效益方面特别适用于研究癌症中动态的染色质状态。

CUT&RUN 技术已开发用于研究染色质相互作用蛋白的基因组定位，包括组蛋白修饰、转录因子结合位点以及染色质相关复合物，从而揭示表观遗传调控图谱^11,12该技术使得在发育和疾病进展过程中对增强子-启动子结构、转录网络调控以及染色质状态动态进行详细分析成为可能¹⁵在癌症研究中，CUT&RUN 可实现组蛋白修饰的精确定位^16,17 以及致癌转录因子的占据情况，有助于识别谱系特异性的调控程序和潜在治疗靶点^15,16此外，CUT&RUN 可以执行 原位 包括CD8+ T细胞在内的细胞¹⁷以及组织样本^18,19.

为了检测SCLC亚型中PTM的基因组定位以及转录因子E2F7的结合位点，我们对四种SCLC神经内分泌（NE）细胞系模型应用了CUT&RUN-seq技术：H146和DMS79（ASCL1亚型），以及H446和H82（NEUROD1亚型），这些细胞系带有或不带有KMT2D突变。我们分析了组蛋白修饰H3K4me1，这是一种主要由KMT2D催化的与增强子相关的修饰，以及E2F7，已有研究表明E2F7是ASCL1的共因子²⁰。与活性启动子相关的组蛋白标记H3K4me3作为阳性对照，而IgG作为阴性对照。

本文基于以下内容，介绍了一种针对小细胞肺癌神经内分泌（SCLC NE）细胞系的详细CUT&RUN-seq实验方案：商用CUT&RUN试剂盒（见材料表）、Skene和Henikoff的原始研究工作^11,12,13，以及我们实验室自身的优化条件。

方案

注意：本方案（图1）提供了在小细胞肺癌神经内分泌（SCLC NE）细胞系中进行CUT&RUN-seq实验的逐步操作指南，这类细胞通常以非贴壁聚集体或悬浮细胞团的形式生长。

1. 细胞培养

1. 维持 DMS79（ASCL1 亚型）、H146（ASCL1 亚型）、H82（NEUROD1 亚型）和 H446（NEUROD1 亚型）细胞系，使用含 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素的 13 mL RPMI-1640 培养基培养（参见 材料表) 置于75 mL培养瓶中。将细胞置于37 °C、5% CO₂的培养箱中培养。₂.
   注意：本研究中使用的所有细胞均购自 ATCC，并已通过短串联重复序列分析进行鉴定。

2. 细胞透化

注意：适当的细胞透化对于抗体、pAG-MNase以及消化后的蛋白质-DNA片段自由进出细胞至关重要。在新的细胞系上启动CUT&RUN实验前，应进行优化实验以确定实现有效透化的理想皂苷素（digitonin）浓度。应选用能够达到超过95%透化率（即95%的细胞呈"死亡"状态）的最低浓度用于后续CUT&RUN实验。

1. 将5%的皂苷（digitonin）储备液、蛋白酶抑制剂和亚精胺置于冰上，使其完全解冻。
2. 根据表1配制洗涤缓冲液，并将缓冲液置于冰上保存。
3. 通过将10 µL的5%储备液与990 µL洗涤缓冲液混合，制备0.05%的皂苷工作液。充分涡旋混匀后置于冰上备用。
4. 通过连续稀释前一溶液，依次制备终体积均为1 mL的皂苷梯度稀释液（0.05%、0.01%、0.001%和0.0001%）。每步稀释前均需涡旋混匀。同时，在洗涤缓冲液中配制0.05%的二甲基亚砜（DMSO）对照溶液（总体积100 µL；见表2）。
   注意：皂苷和DMSO为危险化学品，操作时应谨慎，并将所有废弃物丢弃至贴有明确标签、盖子密封的危险废物容器中。
5. 在使用前，将所有皂苷稀释液及DMSO对照液保持在冰上。
6. 根据通透处理条件的数量乘以每个测试所需的细胞数，确定所需细胞总数。额外增加20%以补偿移液误差（例如，若需进行五个条件、每个条件5×10⁵个细胞的实验，则需准备约1.2 × 5 × 5 × 10⁵ 个细胞）。
7. 通过在室温（RT）下以600 × g离心3分钟收集所需数量的培养细胞。将细胞沉淀重悬于600 µL的1× PBS中（每个条件100 µL，另加20%余量）。
8. 将PBS重悬的细胞液以每管100 µL分装至五支1.5 mL微量离心管中——每种皂苷浓度各一管，另设一管用于DMSO对照。
9. 在室温下以600 × g离心3分钟。
10. 小心吸除上清液，将每管沉淀分别重悬于50 µL对应浓度的皂苷溶液或DMSO对照缓冲液中。
11. 在室温下孵育10分钟。
12. 取10 µL处理后的细胞与10 µL台盼蓝（trypan blue）混合，取10 µL混合液加载至细胞计数板上。
13. 使用细胞计数仪定量活细胞（未染色）和死亡/通透阳性细胞（蓝色染色）的数量。
14. 确定能够产生最高比例台盼蓝阳性细胞的最低皂苷浓度，并将该浓度用于后续的CUT&RUN实验。同时确认DMSO对照组的细胞活力符合正常健康细胞培养的典型水平。

3. CUT&RUN 测序

注意：本实验方案中的试剂用量按5次反应配制，并额外增加以补偿移液过程中的损耗。有关材料和设备的列表，请参见材料表。每次CUT&RUN实验建议至少进行两次独立的生物学重复。

1. 第1天
   1. CUT&RUN 缓冲液配制
      1. 按照说明，通过混合预洗缓冲液、25倍蛋白酶抑制剂和1 M亚精胺来配制洗涤缓冲液 表3.
      2. 按照以下方法配制细胞通透缓冲液：将5%的皂苷加入洗涤缓冲液中 表3.
      3. 通过将 0.4 µL EDTA 加入 100 µL 含适当浓度皂苷（digitonin）的细胞通透缓冲液中，配制抗体缓冲液，具体操作如所述 表3将配制好的缓冲液置于冰上。
      4. 将剩余的细胞通透缓冲液于4 °C保存，用于第2天实验。
   2. 伴刀豆球蛋白A（ConA）珠活化
      1. 轻轻重悬ConA珠悬液，以确保其均匀分布。
      2. 将55 µL磁珠悬液（每份样品11 µL）转移至1.5 mL微量离心管中。
      3. 将离心管置于1.5 mL磁力架上，直至磁珠完全吸附，然后用移液器吸除上清液。
      4. 立即用500 µL冰冻的珠子活化缓冲液（每份样品100 µL）清洗珠子两次。每次清洗时通过轻柔吹打重悬珠子，并在清洗间隔使用磁力架去除上清液。
      5. 最后一次洗涤后，弃去上清液，将活化磁珠轻轻重悬于55 µL（每样本11 µL）预冷的磁珠活化缓冲液中。
      6. 将10 µL磁珠悬液分装至8联管的每管中，并将各管置于冰上。
   3. 收集细胞并将细胞与活化磁珠结合
      注意：细胞活力对于信号/背景比至关重要。然而，由于小细胞肺癌神经内分泌（SCLC NE）细胞系固有的高细胞更替率以及倾向于在悬浮培养中形成中到大的细胞聚集体，其细胞活力可能波动较大（70%–90%）。
      1. 从37 °C培养箱中取出细胞，在显微镜下观察以确保细胞质量。
      2. 将细胞悬液转移至50 mL锥形管中，以1,000–1,200 × g 室温下孵育5分钟。
      3. 吸弃锥形管中的培养基，用 20 mL 1× PBS 清洗细胞沉淀。
      4. 再次离心，吸除PBS，根据沉淀物的大小，加入Accutase在37°C消化3–5分钟。
      5. 通过加入5 mL PBS + 10% FBS终止消化。使用血清移液管轻轻吹打，获得单细胞悬液。
      6. 以 1,000–1,200 × g 5分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于5 mL PBS中。
      7. 计数起始细胞，确认细胞活力和完整性。
      8. 通过将反应数乘以每反应的细胞数（5×10⁵）来计算所需细胞的总数⁵）。为弥补移液误差，需额外增加20%的用量（例如，1.2 × 6 × 5 × 10⁵ 用于6个反应）。将计算好的细胞悬液转移至1.5 mL离心管中。在600 x g，室温下3分钟。
         注意：至少额外准备一个反应作为备用。
      9. 将细胞重悬于室温洗涤缓冲液中，密度为5×10⁵ 每反应使用100 µL，共六个反应，轻柔但充分吹打混匀，确保形成均匀的细胞悬液。以600 x g离心 g 室温下孵育3分钟。用移液器吸除上清液。
      10. 重复洗涤步骤（步骤 9）一次。
      11. 将洗涤后的细胞各100 µL分装至含有10 µL活化CoA磁珠的8联管中。轻轻吹打混匀，立即在小型离心机中短暂离心以收集悬液（磁珠不应沉降）。
      12. 将珠-细胞悬液在室温下孵育10分钟，以使细胞与珠子结合。
      13. 将离心管置于0.2 mL离心管磁力架上，静置使悬液澄清，用移液器吸除上清液。保留10 µL上清液用于确认细胞是否结合到磁珠上。弃去剩余上清液，并立即进行下一步操作。
      14. 从磁力架上取下离心管，立即向每管中加入50 µL预冷的抗体缓冲液，轻轻吹打使磁珠重悬。
      15. 将10 µL上清液和10 µL细胞/微珠悬液（用抗体缓冲液重悬）与10 µL台盼蓝混合，取混合液加载至细胞计数板。
      16. 使用细胞计数仪进行分析。确认上清液中几乎不含微珠或细胞，而微珠/细胞混合物中含有被微珠包围的已透化的细胞。
          注意：必须检查细胞与CoA磁珠的结合兼容性。
   4. 透化与抗体结合
      注意：CUT 的成功&RUN 的成功在很大程度上依赖于抗体对其靶标的亲和力以及在特定实验条件下的特异性。我们建议如下：1. 使用已针对 CUT 验证过的商业抗体&RUN（若有）。2. 对于无CUT的靶点&经RUN验证的抗体，可考虑选择已验证适用于免疫荧光（IF）的抗体，因为IF抗体能够在其天然细胞环境中识别表位，类似于 原位 CUT中抗体与通透细胞内靶标的结合&RUN。3. 平行测试3至5种抗体，以确定最适合您特定应用的抗体。
      1. 快速离心 K-MetStat Panel 和移液器以重悬，向指定用于 H3K4me3 阳性反应的体系中加入 2 µL K-MetStat Panel & IgG 阴性对照抗体。用移液器混匀并瞬时离心管子（可选）。
      2. 分别向每个反应中加入0.5 µg的H3K4me3、H3K4me1和IgG抗体，以及0.6 µg来自不同来源的E2F7多克隆抗体（表4）标记8联管。
      3. 轻轻吹打以充分混匀各反应管。将管盖端抬高，在4 °C条件下于旋转摇床中孵育过夜。切勿旋转或倒置反应管。^.
2. 第2天
   1. pAG-MNase 与抗体的结合
      注意：磁珠在过夜孵育后发生沉降是正常现象，不会影响实验结果。如果磁珠在过夜孵育后出现结块或黏连，可通过轻柔吹打重新悬浮。为提高实验重复性和通量，建议使用多通道移液器。当使用8联管时，应逐条移除并更换缓冲液，以防止ConA磁珠干燥。
      1. 将磁力架放在冰上。
      2. 从4 ˚C孵育环境中取出8联管，短暂离心以收集管内液体。
      3. 将离心管置于磁力架上，直至悬浮液变澄清。小心用移液器吸出并去除上清液。
      4. 将离心管置于磁力架上。用 200 µL 冷的细胞通透缓冲液洗涤离心管两次。用移液器吸除上清液。
      5. 从磁力架上取下离心管，立即向每个反应体系中加入50 µL冰冷的细胞通透缓冲液。轻轻吹打混匀以重悬细胞/磁珠。
      6. 向每个反应中加入2.5 µL pAG-MNase，轻轻吹打混匀。
      7. 在室温下孵育反应10分钟。
      8. 快速离心管子，放回磁力架上，直至悬液变澄清。用移液器吸除上清液。
      9. 将离心管置于磁力架上，用 200 µL 冷的细胞通透缓冲液洗涤两次。用移液器吸除上清液。
      10. 从磁力架上取下离心管，加入50 µL预冷的细胞通透缓冲液，轻轻重悬细胞。将离心管置于冰上。
   2. 靶向染色质消化与释放
      注意：执行 Ca²⁺依赖性消化在 0 °C 下进行，以最大限度减少 MNase 对可及 DNA 的非预期切割¹²加入外源DNA，例如 大肠杆菌（Escherichia coli），使其约占总测序读段的0.5-5%（理想情况下约为1%）¹³加入的DNA用于标准化测序深度，在系列样本比较中尤为重要，例如在评估组蛋白修饰酶被抑制或基因敲除后全局组蛋白修饰变化时。
      1. 在冰上向8联管（步骤3.2.1.10）中的每个反应体系加入1 µL 100 mM氯化钙。轻轻吹打混匀，充分重悬磁珠，以确保消化反应高效进行。
      2. 将试管置于4 °C下，在旋转摇床上孵育2小时，管盖端略抬高。
      3. 在新的 1.5 mL 离心管中配制终止缓冲液混合液。每项反应中，将 33 µL 终止缓冲液与 1 µL 混合。 E. coli 加入DNA内参（0.5 ng），轻轻涡旋混匀。
      4. 在2小时孵育结束后，向每个反应体系中加入33 µL终止缓冲液。轻轻吹打混匀。
      5. 在37 °C的热循环仪中孵育反应体系10分钟。
      6. 快速离心以使管内物质沉降至管底，然后将管子置于磁力架上，直至溶液变澄清。
      7. 小心转移约 84 µL 上清液，其中含有 CUT&将 #38;RUN 释放的 DNA 转移至新的 1.5 mL 离心管中。
   3. 使用DNA纯化试剂盒进行DNA纯化（参见 材料表)
      注意：首次使用前，向DNA结合缓冲液中加入6.9 mL异丙醇，并向DNA洗涤缓冲液中加入20 mL ≥ 95%的乙醇。
      1. 向每份收集的上清液中加入 420 µL DNA 结合缓冲液。短暂涡旋振荡以充分混匀。
      2. 将DNA纯化柱放入收集管中。
      3. 将每个样品加载到相应的柱子上。
      4. 在 16,000 × g 条件下离心 g 室温下静置30秒。弃去穿流液，将柱重新放回收集管中。
      5. 向每个柱中加入 200 µL DNA 洗涤缓冲液，于 16,000 x g 室温下静置30秒。弃去穿流液，将柱重新放入收集管中。
      6. 重复洗涤步骤一次。
      7. 再次以 16,000 x g 室温下孵育30秒，以彻底去除残留的洗涤缓冲液。
      8. 将柱子转移至已标记的1.5 mL离心管中。
      9. 将 12 µL 洗脱缓冲液直接加入柱子中心的膜上。
      10. 室温孵育5分钟，然后在16,000 × g 室温下孵育1分钟以洗脱DNA。
          注意：此处为安全的暂停点。将洗脱的DNA于-20 ˚C保存，以备后续处理。
   4. CUT& 运行DNA定量和片段大小分布分析
      注意：使用荧光计配合双链DNA高敏检测试剂盒定量DNA，该方法相较于基于吸光度的检测方法能提供更准确的双链DNA测量结果。
      1. 使用每种样品1 µL来测定CUT& 使用dsDNA高灵敏度检测试剂盒测定DNA浓度（参见 材料表).
      2. 使用额外的 1 µL DNA 来评估切割片段的存在及其大小分布。使用 High Sensitivity DNA Kit 进行片段分析（参见 材料表）按照制造商的说明进行（可选）。
         注意：在此步骤中，可轻松检测到高丰度结合蛋白（如组蛋白翻译后修饰（PTMs））；然而，低丰度转录因子可能较难检测。
   5. 文库构建、片段分析与测序
      注意：总 CUT 量 ≤5 ng&RUN DNA，根据dsDNA高灵敏度检测试剂盒定量结果，用于CUT& 进行下一代测序（NGS）文库构建。为最大限度减少接头二聚体，将Illumina接头用量减少至1 µL用于接头连接反应。文库构建过程中的PCR循环数可根据起始量、文库产量及重复率进行调整。不同的DNA纯化磁珠（参见 材料表) 可根据目标组蛋白PTM或转录因子选择不同的片段大小筛选策略。
      1. 文库构建采用CUT方法进行&RUN 文库制备试剂盒（参见 材料表）根据试剂盒制造商的说明书进行，略有修改。简言之，使用5 ng的CUT&RUN DNA 用作文库构建的推荐起始量。对于少于 5 ng 的 DNA，应尽可能使用全部样品进行文库构建。双端 i5 & i7指数引物被用于每个样本，以确保多重测序的成功进行。
         注意：此处为安全暂停点。DNA 可在 -20˚C 下保存，以备后续处理。
      2. 测定 CUT 的浓度&RUN文库使用荧光计和dsDNA高灵敏度检测试剂盒进行定量。CUT片段的大小分布&RUN NGS文库的浓度使用高灵敏度DNA检测试剂盒（参见 材料表) 根据高灵敏度DNA试剂盒指南或类似的毛细管电泳仪器TapeStation（参见 材料表).
         注意：稀释 CUT&RUN文库以使浓度处于dsDNA高灵敏度检测试剂盒和高灵敏度DNA试剂盒的检测范围内。
      3. 基于等分子量和唯一性索引合并文库（40-46）。在DNA纯化及磁珠片段筛选后，对混合文库在Illumina NovaSeq 6000系统上进行半S-Prime（SP）的双端测序（读长100 bp），每文库测序深度约为1000万条读段。
   6. CUT&RUN 数据分析
      1. 分析 CUT& 使用自定义流程运行数据（图 5A）。使用 FastQC 评估测序读段质量。利用 Cutadapt 去除读段起始端的接头序列。将成对末端读段比对至人类基因组（hg38）和 E. coli 使用Bowtie2比对参考基因组。利用Samtools去除未比对的reads。使用Picard去除重复reads，并用Bedtools生成bedGraph文件。通过DeepTools创建bigWig（bw）文件。使用IGV和DeepTools可视化数据。将总read数基于spike-in进行标准化 E. coli 读数计数。使用 SEACR（稀疏富集分析用于 CUT）进行峰呼叫&RUN)¹⁹.

结果

典型或“经典型”小细胞肺癌（SCLC）神经内分泌（NE）细胞系的特征是细胞核较大、胞质稀少，并以非贴壁的聚集体或致密球状体的形式悬浮生长。ASCL1高表达的细胞系（如NCI-H146和DMS79）以及NEUROD1高表达的细胞系（如NCI-H82和H446）均表现出这种经典SCLC表型：细胞体积小至中等，胞质稀少，染色质呈细颗粒状，且主要以非贴壁聚集体或致密球状体的形式生长。尽管NEUROD1高表达模型仍保留神经内分泌标志物的表达，但其富集了与神经元分化、细胞骨架重塑和细胞迁移相关的转录程序。例如，NCI-H82以体积较大、结构松散的悬浮聚集体形式生长，而H446则呈现混合形态——约80%为贴壁细胞，20%为悬浮细胞，体现出干细胞样特性及表型可塑性（图2）。

利用安捷伦基于芯片的片段分析技术，我们成功检测到了组蛋白修饰H3K4me3和H3K4me1的CUT&RUN DNA，而对丰度较低且表达可能具有细胞周期依赖性的转录因子E2F7的检测则更具挑战性。CUT&RUN DNA的产量和片段大小分布总结于

讨论

表观遗传失调和LDTF是小细胞肺癌（SCLC）肿瘤生物学的关键驱动因素⁶。确定SCLC中特定组蛋白修饰和DNA结合蛋白的基因组分布，有助于揭示获得性治疗耐药性和表型可塑性的潜在机制。CUT&RUN-seq是一种高分辨率绘制组蛋白及非组蛋白-DNA相互作用的强有力方法，适用于细胞和组织¹⁴。本实验方案为传统ChIP-seq方法在SCLC神经内分泌（NE）细胞系中的应用提供了一种高效且低成本的替代策略，可用于识别适合干预治疗的新型基因通路。

与 ChIP-seq 相比，CUT&RUN-seq 通常产生的背景噪声更低。然而，背景信号仍可能出现，并在数据分析过程中对峰识别产生负面影响。为了最大限度减少背景读数，起始使用的细胞应具有最佳的活力。这一点对于小细胞肺癌神经内分泌（SCLC NE）细胞系尤为关键，因为与贴壁细胞系相比，这些细胞系由于其生长特性，活力通常更具变异性。我们建议在 CUT&RUN 实验过程中轻柔处理样品。重悬细胞时应使用移液器，而...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>试剂
RPMI-1640 培养基	Gibco 赛默飞世尔科技	11875093	细胞培养基
胎牛血清（FBS）	神经组学	FBS002-HI	细胞培养基组分
1% 青霉素-链霉素	Gibco 赛默飞世尔科技	15140122	抗生素，用于防止细胞培养中的细菌污染
0.4% 台盼蓝溶液	Gibco ThermoFisher Scientific	15250061	采用台盼蓝染色法结合自动细胞计数仪评估细胞通透性。
Roche cOmplete，无EDTA蛋白酶抑制剂混合物	罗氏	11873580001	蛋白酶抑制剂。洗涤缓冲液的成分
5% 皂苷	EpiCypher	21-1004	缓冲液成分  缓冲液配方详见缓冲液工作表
珠子活化缓冲液	EpiCypher	21-1001	缓冲液成分  缓冲液配方详见缓冲液工作表
刀豆球蛋白A（ConA）珠	EpiCypher	21-1401	ConA偶联的顺磁性微球是经凝集素包被的磁珠，可实现脂质膜结合
CUT&RUN 试剂盒	CUTANA ChIC EpiCypher	14-1048	CUT 试剂&RUN DNA 生成
DNA纯化试剂盒	CUTANA  EpiCypher	14-0050	从反应中上清液释放的靶向DNA片段中提取DNA
CUT&RUN 文库构建试剂盒	CUTANA EpiCypher	14-001	生成 CUT&RUN 下一代测序（NGS）文库
DNA纯化 磁珠	Agencourt AMPure XP Beckman Coulter	A63880	PCR产物纯化与片段筛选（即接头二聚体和引物去除）
大肠杆菌内参DNA	EpiCypher	18-1401	用作外源性内参，用于校准一系列样本中的测序读段—例如，处理组与未处理组的条件
pAG-MNase	EpiCypher	15-1016	当被钙离子激活时，该酶在结合到一抗上的位点两侧切割目标DNA片段
PBS，pH 7.4，1×	Gibco（赛默飞世尔科技）	10010-049	洗涤细胞
预洗缓冲液	EpiCypher	21-1002	缓冲液组分  缓冲液配方详见缓冲液表格
dsDNA 高灵敏度  检测试剂盒	Qubit™ 赛默飞世尔科技	Q32854	CUT&RUN DNA 定量
终止缓冲液	EpiCypher	21-1003	缓冲液成分  缓冲液配方见缓冲液表格
高灵敏度DNA试剂盒	安捷伦科技	5067-4626	CUT&RUN DNA及NGS文库定量与片段大小分布分析
<强>材料
8联排0.2 mL PCR管	EpiCypher	10-0009k	CUT 实验用管&RUN 反应，兼容 0.2 ml 管的磁力分离架
LUNA 8通道载玻片	Logos BioSystems INC	L72001	用于细胞计数的计数板  细胞活力与完整性检测
多通道试剂储液槽	Fisher Scientific	14-387-072	洗涤缓冲液容器
DynaMag™-2（磁力分离架），1.5 mL 离心管	赛默飞世尔科技	12321D	使用磁力架通过磁分离将ConA磁珠从保存缓冲液中分离，随后在1.5 mL微量离心管中用活化缓冲液重悬以进行活化。
磁力分离架，0.2 mL 离心管	EpiCypher	10-0008	站立以分离  结合细胞、抗体及反应和洗涤缓冲液中的pAG/MNase的磁珠
Eppendorf Research plus 8通道移液器，0.5–10 μL	Eppendorf	3125000010	吸取8联管中的样本  以加快工作流程，使用可比的多通道移液器
Eppendorf Reference 2 8通道移液器，30-300 μL	Eppendorf	4926000050	吸液和洗涤步骤以加快工作流程，可与多通道移液器配合使用
<强>仪器设备
Scientific Industries Vortex-Genie 2 混匀器，可调速度，120 V	Fisher Scientific	50-728-002	迷你离心机离心
LUNA FX7 自动细胞计数仪	Logos BioSystems INC	L70001	细胞计数仪
摆动式混合器	VWR	82007-202	珠子孵育步骤（抗体过夜孵育，pAG-MNase 消化反应）。
Eppendorf 6331 Nexus Gradient MasterCycler 梯度PCR仪	Eppendorf	6331	CUT&RUN 下一代文库构建
Qubit 4 荧光仪	赛默飞世尔科技	Q33226	DNA 定量
安捷伦 2100 生物分析仪	安捷伦科技	G2939A	片段大小、CUT 浓度分析&RUN DNA 和 CUT&RUN 文库，  可比的毛细管电泳仪器（例如 Agilent TapeStation）
安捷伦 TapeStation	安捷伦科技	G2992AA	片段大小、CUT 浓度分析&RUN DNA 和 CUT&RUN 文库
Illumina NovaSeq 6000 系统	Illumina，美国加利福尼亚州圣地亚哥		测序混合的CUT&RUN 文库