姜黄素对胶质母细胞瘤中AKT/Wnt/β-catenin通路的调控及铜死亡的诱导

摘要

姜黄素（CUM）通过抑制 AKT/Wnt/β-catenin 轴诱导铜死亡，从而抑制胶质母细胞瘤（GBM）的进展。本实验方案旨在研究 CUM 阻碍 GBM 恶性进展的分子机制，并描述评估 CUM 通过调控该通路诱导铜死亡的方法。

摘要

姜黄素（CUM）可调控胶质母细胞瘤（GBM）的恶性行为。本研究探讨CUM是否通过AKT/Wnt/β-catenin信号通路诱导铜死亡（cuproptosis），从而抑制GBM的进展。采用MTT法确定姜黄素的最佳浓度。对A172和U251细胞分别给予CUM、AKT抑制剂MK-2206、Wnt抑制剂LGK974以及Elsm-Cu（Elesclomol + CuCl₂）处理。₂细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡分别通过羧基荧光素琥珀酰亚胺酯染色、划痕实验、Transwell实验和流式细胞术进行评估。线粒体超氧化物（MitoSOX）荧光、Seahorse 代谢分析、免疫荧光和铜²⁺ 检测和蛋白质印迹法用于评估线粒体氧化应激和铜死亡。采用TCF/LEF1报告基因检测试剂盒和蛋白质印迹法分析AKT/Wnt/β-catenin信号轴。建立胶质母细胞瘤异种移植模型，并通过灌胃给予CUM，持续五周。评估CUM对肿瘤生长、铜死亡及AKT/Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达的影响。细胞用10 µM和20 µM的CUM处理。 体外CUM处理抑制了增殖、迁移和侵袭，同时促进氧化应激和铜死亡。CUM还抑制了Wnt/β-catenin信号通路活性。通路抑制使活性氧水平升高（3.7倍）和Cu²⁺ （3.1倍）水平，并降低二氢硫辛酰胺乙酰转移酶的表达，从而抑制恶性行为。在裸鼠模型中，CUM显著抑制肿瘤生长，促进铜死亡，并抑制AKT/Wnt/β-catenin轴的活化。我们的研究结果表明，CUM可抑制AKT/Wnt/β-catenin信号通路，诱导铜死亡，并干扰胶质母细胞瘤（GBM）的进展。

引言

胶质瘤是中枢神经系统（CNS）中最常见的原发性颅内恶性肿瘤¹。4级胶质瘤通常指胶质母细胞瘤（GBM），其预后较差²。GBM是一种高度侵袭性的脑肿瘤，占中枢神经系统恶性肿瘤的近50%，中位生存期不足1年³，以其高恶性程度和高复发率著称^4,5。目前，GBM的治疗策略主要依赖手术，并辅以放疗、化疗及其他综合治疗方法⁶。尽管免疫治疗、生物治疗和纳米医学等新兴治疗策略在临床前研究中已取得显著成果^7,8，但总体5年生存率仍仅为4.3%⁹。目前最常用的化疗方案是著名的Stupp方案；然而，对于MGMT未甲基化的GBM患者，总生存率并未显著延长¹⁰。因此，探索新的治疗策略对于延长患者生存期具有重要意义。本研究假设姜黄素（CUM）对GBM的抗癌机制涉及铜死亡（cuproptosis）。

铜代谢异常或铜诱导的细胞损伤可导致一系列疾病¹¹

方案

所有动物实验均遵循机构制定的实验动物人道护理与使用标准，并已获得机构动物伦理委员会的正式批准。在可能的情况下，均采取措施以减少动物的不适与痛苦。

涉及化学化合物、染料和生物样本的操作均遵循既定的生物安全规范，以降低潜在风险。对于可能具有危害性的物质，包括多聚甲醛、含铜试剂和二氢乙锭（DHE），均使用适当个人防护装备进行操作，如手套、口罩和护目镜。所有废弃物，如使用过的试剂和被污染的一次性物品，均分类收集至指定的生物危害容器中，并由授权的危险废物管理服务机构按照机构及环境安全法规进行后续处理。整体实验设计详见图1。

图1：本研究的工作流程。

结果

抑制 GBM 细胞活力并诱导细胞死亡
首先，在 CUM 干预 2 小时、48 小时和 72 小时后，NHA 细胞活力未出现显著变化（图 2A），表明所使用的 CUM 浓度对正常细胞无毒性作用。相比之下，GBM 细胞系（A172、U251、LN229 和 SHG-44）在 CUM 浓度 ≥ 1 µM 时细胞活力显著降低（P < 0.05–0.001）（图 2B–E）。基于这些结果，后续实验选择 1 µM 和 2 µM 的 CUM 浓度，并设置 4 小时的处理时间。经 CUM 处理后，A172、U251、LN229 和 SHG-44 细胞的 IC₅₀ 值分别为 21.62、37.99、66.11 和 49.2 µM（图 2F）。因此，选择 A172 和 U251 细胞进行进一步研究。CUM 显著增加了 A172 细胞的死亡率（3.......

讨论

胶质母细胞瘤（GBM）的复发率与其恶性生物学特性相关³⁶。CUM通过调节氧化应激、凋亡、自噬、转移、侵袭及关键分子靶点发挥抗GBM作用³⁷。本研究的细胞水平实验表明，CUM显著提高了GBM细胞的死亡率，并抑制了细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力，这些发现与既往报道一致²⁰。

铜死亡（cuproptosis）与多种癌症的进展相关，包括胶质母细胞瘤（GBM）^30,38。生物信息学分析表明，CUM可能影响肝细胞癌中的铜死亡³⁹，但尚无先前研究报道其在GBM细胞中诱导铜死亡的能力。过量的Cu²⁺可直接结合DLAT和DLST，导致其发生寡聚化，从而破坏三羧酸（TCA）循环，并引发氧化应激和代谢紊乱。此外，细胞内Cu²⁺水平升高会诱导铁硫（Fe-.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.1% 结晶紫染色液	Servicebio	G1014	细胞标记
4% 多聚甲醛	Beyotime	P0099	固定细胞或组织
AKT 抑制剂（MK-2206）	Selleck.cn，中国上海	S1078	特异性 AKT 抑制剂
抗体（一抗和二抗）	ABclonal Technology，中国武汉 / abcam，英国剑桥 / Servicebio，中国武汉 / Beyotime，中国上海 / Cell Signaling，美国马萨诸塞州丹弗斯	A8814, ab32572, GB25303, ab15580, ab108257, ab246917, A8814, AF6708, AA326, 4060, ab219412, 280376, 9322, ab97051, ab229025	检测蛋白表达水平
细胞凋亡检测试剂盒	Servicebio，中国武汉	G1021	凋亡检测
Cell Trace CFSE 荧光染料	Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德	C34570	细胞增殖检测
化学发光成像系统	Bio-Rad，美国加利福尼亚州赫克力士	Chemi Doc XRS+	蛋白超高灵敏度检测
Cu2+ 比色法检测试剂盒	Elabscience，中国武汉	E-BC-K300-M	检测肿瘤组织和胶质母细胞瘤细胞中的 Cu2+ 含量
CuCl2	Sigma-Aldrich，德国达姆施塔特	751944	铜死亡诱导剂
姜黄素（CUM）	上海源叶，中国上海	S19245	多酚类化合物
DHE 检测试剂盒	Beyotime，中国上海	S0063	活性氧（ROS）水平检测
二甲基亚砜（DMSO）	Servicebio	G4101-2	MTT 实验溶剂
ECL 显影液	Servicebio	G2161	用于 Western blot
依立斯莫（Elesclomol）	Selleck.cn	S1052	铜死亡诱导剂
流式细胞仪	BD Biosciences，美国新泽西州	BD FACSAria III	用于细胞死亡和 CFSE 检测
荧光显微镜	OLYMPUS，日本东京	IX73	用于免疫荧光、ROS、TUNEL、DHE 和线粒体膜电位（MMP）检测
胶质母细胞瘤细胞系 A172（RRID: CVCL_0131）、U251（RRID: CVCL_0021）、LN229（RRID: CVCL_0393）和 SHG-44（RRID: CVCL_6902）	普诺赛生物科技有限公司，中国武汉	CL-0012, CL-0237, CL-0578, CL-0207	人源胶质母细胞瘤细胞系
GraphPad Prism 9.0 软件	GraphPad Software, LLC	版本 9.0	统计分析
ImageJ 1.53k 软件	美国国家心理健康研究所	版本 1.53k	统计计算
JC-1 工作液	Solarbio，中国北京	M8650	线粒体膜电位（MMP）检测
雄性 BALB/c 裸鼠	斯莱克金达实验动物有限公司，中国湖南		小鼠实验
酶标仪	Bio-Tek，美国佛蒙特州	ELX-800	用于测定 OD450 nm 值
显微镜	OLYMPUS	BX53	用于细胞划痕实验、Transwell 实验和免疫组织化学检测
MitoSOX 探针	Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	M36008	用于活性氧（ROS）检测
Mitotracker Red CMXRos	Thermo Fisher Scientific	M7512	活细胞中线粒体的特异性标记
MTT 检测试剂盒	Servicebio	G4101-1	细胞活力检测
正常人脑星形胶质细胞 NHA 细胞（RRID:CVCL_B0DK）	华拓生物科技有限公司，中国深圳	HTX2408	对照实验用细胞系
核蛋白提取试剂盒	Beyotime	P0027	核蛋白提取
Seahorse 细胞能量代谢分析仪	Agilent， 中国北京	Seahorse XF	用于氧消耗率（OCR）检测
TCF/LEF1 荧光素酶报告基因检测试剂盒	百奥莱博科技有限公司，中国北京		检测 Wnt/β-catenin 信号通路活性
TUNEL 检测试剂盒	Beyotime	C1088	肿瘤组织中细胞凋亡检测
Wnt 抑制剂（LGK974）	Selleck.cn	S7143	特异性 Wnt 抑制剂