可视化人类脂肪来源干细胞在直流电场下的年龄依赖性趋电

Summary

在一小群女性供体中，年龄增长减少了hADSC的电定性迁移。DCEF改变了基因表达（747上行，624下行），富集钠转运/通道GO项和PI3K-Akt KEGG通路，暗示其参与年龄相关的电趋性，但未确定因果关系。

Abstract

人类脂肪来源干细胞（hADSC）在组织再生和伤口愈合中起着关键作用，其定向迁移是发挥这些治疗效果的前提条件。电场（EFs）被公认为指导伤口修复过程中细胞迁移的关键线索，但hADSC的电策略行为——尤其是供体特性（如年龄）如何调控该行为及其底层分子机制——仍鲜为人知。这一知识空白限制了hADSC在再生医学中的优化应用。本研究首次验证了hADSC中的趋电性存在，并证实了其电压依赖性：在100-200 mV/mm直流电场（DCEFs）下，hADSC向阳极方向迁移，较强的EF强度增强了迁移方向性和迁移速度（相比于0 mV/mm控制时）。随后，我们比较了年轻女性供体（27.00±4.58岁）和年长女性供体（62.33±4.04岁）的hADSC，均在200 mV/mm DCEF刺激后进行RNA测序。转录组分析鉴定出老年hADSC中747个上调和624个下调基因，其中差异表达基因（DEGs）富含对趋电性至关重要的生物过程/通路——包括钠离子跨膜运输、电压门控钠通道活性（GO项）以及PI3K-Akt信号通路（KEGG通路）。在功能上，老年hADSC在DCEF刺激下表现出显著减少的阳极迁移（累积距离、欧几里得距离和直接性减少），相比年轻hADSC。本研究首次提供了hADSC中年龄依赖性电的证据，表明供体年龄与定电能力受损相关。研究进一步表明，钠通道活动失调和PI3K-Akt信号传导可能是这种年龄相关下降的根源。这些发现揭示了hADSC电引导的潜在调控机制，并为针对hADSC疗法（如选择最佳供体或靶向钠/PI3K-Akt通路）量身定制，以改善组织再生和伤口愈合效果提供了新见解。

Introduction

脂肪来源干细胞（ADSC）具有强大的自我更新能力和显著的再生潜力。在适当的诱导条件下，它们可以分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等。通过旁分泌信号传导，ADSC还能支持血管和淋巴管的生成^2,3，抑制瘢痕形成^4，并表现出免疫^{调节作用5}。因此，ADSC被认为是再生医学中基于细胞疗法的理想种子细胞。

ADSC的功能受多种供体特征影响，这些特征可能影响其在细胞疗法中的潜在疗效，包括供体年龄、体质指数、性别等^6。来自老年供体的ADSC表现出更明显的衰老特征，脂肪生成分化潜力、骨生成分化潜力和迁^徙能力均降低^7,8,9。此外，促进角质细胞增生和刺激身体自我修复机制的能力也被削弱了¹⁰。

细胞导向迁移是伤口愈合和组织再生中的关键生理机....

Protocol

组织采集前均获得所有参与者的知情同意。本研究获中国医科大学第一附属医院伦理委员会批准（批准号：[2018]2018-110-2）。在组织采集前，所有参与者均获得了书面知情同意

hADSC的隔离与培养
组织采集： 人体腹部脂肪组织样本是在中国医科大学第一附属医院整形外科进行常规择期抽脂手术时采集的。所有捐献者均为接受美容腹部抽脂的健康女性志愿者，且未进行额外的外科手术干预以供研究目的。手术外科医生在抽吸后立即在无菌条件下采集组织样本，并在30分钟内将无菌容器冰上转移到实验室。

样本量： 本研究共纳入6名捐献者，其中3名年轻捐献者（年龄：27.00±4.58岁）和3名年长捐赠者（年龄：62.33±4.04岁）。

组织处理： 将脂肪组织碎片转移到50毫升锥形管中，在1800 x g 离心机下4°C离心3分钟，并小心抽取上层油相（以去除多余脂质）。将0.2%的胶原酶IV型（最终体积：每1克脂肪组织5-10毫升）加入组织沉淀，然后将管子放入37°C的水浴或培养箱中浸泡45分钟。消化过程中每10-15分钟轻轻搅动管子，确保胶原酶与组织均匀接触。消化后，....

Results

电场的应用引导hADSC的定向迁移，增强其迁移能力
提取的hADSC表现出典型的间充质干细胞表面标记（如CD29、CD44、CD90、CD73、CD105），并具有三谱分化潜力（脂肪生成、骨生成、软骨生成;图2A），符合hADSC识别的标准标准。我们应用了0 mV/mm、100 mV/mm和200 mV/mm的直流电场（DCEFs），以研究hADSC的定电响应。在无电刺激（0 mV/mm）的对照组中，hADSCs向随机方向迁移。然而，在外源性DCEF刺激下，200 mV/mm，细胞会朝阳极方向迁移（图2B）。此外，随着电场强度的增加，向阳极迁移的hADSC数量也增加（见图2C-D）。通过量化单元位移矢量与电场矢量之间的夹角，我们观察到阳极导向迁移在场强增强时显著增强（

Discussion

在组织损伤修复和再生的早期阶段，电场作为微环境中最早确立的物理线索之一出现。它们的方向性特性与细胞招募到损伤部位的时空相关性²⁷。内源性电场源自上皮组织中极化离子输运产生的跨上皮势。当上皮屏障被破坏或经历老化时，电位会被次要改变，而未受损或非衰老区域则保持离子输运，产生与上皮表面平行的DCEF电压梯度²⁸。在这种情况下，损伤中心充当阴极，是电场的关键组成部分。ADSC位于^{脂肪组织中}的特定干细胞位中。越来越多的证据表明，ADSC可以从其原生生态位中被动员，参与皮肤修复和再生³⁰。本研究探讨了ADSC是否对外部DCEF表现出趋电反应，从而评估其在皮肤再生过程中对内源性EF的响应性。我们的发现表明，在DCEF刺激下，ADSC会朝阳极方向迁移，其迁移极性与EF强度呈正相关。鉴于ADSC在伤口愈合和组织再生中的关键作用，多项研究探讨了其电定性行为。例如，小鼠的ADSC也在类似的EF范围

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4°C/-20°C/-80°C型冰箱	海尔，中国	HYC-390/DW-25L262/DW-86L728J
琼脂	中国胡什	10000561
安捷伦2100生物分析仪	安捷伦科技，美国	G2939BA
阿利扎林红 S	Sigma-Aldrich，美国	A5533
生物安全柜及nbsp;	美国Thermo Fisher Scientific公司	1300 A2 1.5 米
CaNO3·4H2O	中国胡什	10013960
离心机	美国Thermo Fisher Scientific公司	X4R 优点;
CO2 孵化器	美国Thermo Fisher Scientific公司	Forma Steri-Cycle 3307
胶原酶IV型	Biosharp，中国	BS076
共焦点显微镜	德国蔡司	LSM 900
直流脉冲电源	韩国大道Powertronics	DDP-500
地塞米松	Sigma-Aldrich，美国	D4902
数字万用表	弗鲁克，美国	弗鲁克-175
DMSO	Sigma-Aldrich，美国	D2650
电子天平	德国萨托留斯等;	BSA224S-CW
FBS	Gibco，美国	10270-106
流式细胞仪	美国Thermo Fisher Scientific公司	A24858
IBMX（1-甲基-3-异丁基黄基）	Sigma-Aldrich，美国	I7018
吲哚美辛	Sigma-Aldrich，美国	I7378
胰岛素	Sigma-Aldrich，美国	I5500
倒置显微镜	德国蔡司	Axio 观察者7号 / ACR
ITS-G	Sigma-Aldrich，美国	I3146
KCl	中国胡什	10019318
KH2PO4	中国胡什	10019320
亚油酸等;	Sigma-Aldrich，美国	L1376
活跃基站	活细胞仪器，韩国	查姆利德 TC
低葡萄糖DMEM	Gibco，美国	11885084
MgSO4·7H2O	中国胡什	10019322
Na2HPO4middot;12H2O	中国胡什	10019324
氯化钠	中国胡什	10019318
NanoDrop 2000分光光度计	美国Thermo Fisher Scientific公司	ND-2000
油红O	Sigma-Aldrich，美国	O0625
青霉素/链霉素	Gibco，美国	15140122
移液器	德国埃彭多夫	4920000061
SYBR 预混 EX Taq	中国Takara;	RR420A
甲苯胺蓝 O	Sigma-Aldrich，美国	T3260
特里斯	中国胡什	10019326
特里佐尔	碧昂泰姆，中国	R0016
胰蛋白酶-EDTA	Gibco，美国	25200056
立式显微镜	德国蔡司	415200-0000-000
真空润滑脂	道·康宁，美国	1597418
维生素C	Sigma-Aldrich，美国	A4544
水净化系统	美国Thermo Fisher Scientific公司	GenPure xCAD Plus UF-TOC
&β;-甘油磷酸	Sigma-Aldrich，美国	G9422