可视化人类脂肪来源干细胞在直流电场下的年龄依赖性趋电

Summary

在一小群女性供体中，年龄增长减少了hADSC的电定性迁移。DCEF改变了基因表达（747上行，624下行），富集钠转运/通道GO项和PI3K-Akt KEGG通路，暗示其参与年龄相关的电趋性，但未确定因果关系。

Abstract

人类脂肪来源干细胞（hADSC）在组织再生和伤口愈合中起着关键作用，其定向迁移是发挥这些治疗效果的前提条件。电场（EFs）被公认为指导伤口修复过程中细胞迁移的关键线索，但hADSC的电策略行为——尤其是供体特性（如年龄）如何调控该行为及其底层分子机制——仍鲜为人知。这一知识空白限制了hADSC在再生医学中的优化应用。本研究首次验证了hADSC中的趋电性存在，并证实了其电压依赖性：在100-200 mV/mm直流电场（DCEFs）下，hADSC向阳极方向迁移，较强的EF强度增强了迁移方向性和迁移速度（相比于0 mV/mm控制时）。随后，我们比较了年轻女性供体（27.00±4.58岁）和年长女性供体（62.33±4.04岁）的hADSC，均在200 mV/mm DCEF刺激后进行RNA测序。转录组分析鉴定出老年hADSC中747个上调和624个下调基因，其中差异表达基因（DEGs）富含对趋电性至关重要的生物过程/通路——包括钠离子跨膜运输、电压门控钠通道活性（GO项）以及PI3K-Akt信号通路（KEGG通路）。在功能上，老年hADSC在DCEF刺激下表现出显著减少的阳极迁移（累积距离、欧几里得距离和直接性减少），相比年轻hADSC。本研究首次提供了hADSC中年龄依赖性电的证据，表明供体年龄与定电能力受损相关。研究进一步表明，钠通道活动失调和PI3K-Akt信号传导可能是这种年龄相关下降的根源。这些发现揭示了hADSC电引导的潜在调控机制，并为针对hADSC疗法（如选择最佳供体或靶向钠/PI3K-Akt通路）量身定制，以改善组织再生和伤口愈合效果提供了新见解。

Introduction

脂肪来源干细胞（ADSC）具有强大的自我更新能力和显著的再生潜力。在适当的诱导条件下，它们可以分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等。通过旁分泌信号传导，ADSC还能支持血管和淋巴管的生成^2,3，抑制瘢痕形成^4，并表现出免疫^{调节作用5}。因此，ADSC被认为是再生医学中基于细胞疗法的理想种子细胞。

ADSC的功能受多种供体特征影响，这些特征可能影响其在细胞疗法中的潜在疗效，包括供体年龄、体质指数、性别等^6。来自老年供体的ADSC表现出更明显的衰老特征，脂肪生成分化潜力、骨生成分化潜力和迁^徙能力均降低^7,8,9。此外，促进角质细胞增生和刺激身体自我修复机制的能力也被削弱了¹⁰。

细胞导向迁移是伤口愈合和组织再生中的关键生理机制，电场（EFs）在引导细胞迁移和促进伤口修复中起着重要作用¹¹。例如，当上皮屏障受损时，内源性电场会立即产生并持续，直到伤口愈合并恢复上皮屏障功能 12,13,14。作为指导定向细胞迁移的信号之一，电信号被证明优先级高于其他共存信号，如接触抑制、机械力和趋化因子^15,16。已有多种方法被开发用于促进伤口愈合和组织再生，例如通过药物和外部电刺激装置增强或模拟人体内源性电场^17,18。细胞根据电场梯度迁移的能力被称为趋电。体外研究表明，许多不同类型的细胞能够在电场中定向迁移。一些细胞向阳极迁移，如哺乳动物的颅神经嵴细胞、人类星形胶质细胞和人类乳腺癌细胞19,20,21。其他细胞则向阴极迁移，如人类肾小管上皮细胞、人类真皮成纤维细胞和人类中性粒细胞^22,23,24。ADSC可被引导在直流电场中向阳极迁移，在长时间培养条件下，外源脉冲电流已被证明能有效促进ADSC向阳极方向迁移，同时保持细胞存活能力²⁵。迄今为止，关于人类脂肪来源干细胞的趋电特性的研究仍然稀少，调节其定向电行为的潜在机制仍未完全明了。

我们是首个系统性地研究年轻与老年女性供体在梯度直流电场（DCEF）下hADSCs的年龄依赖性电策略差异，并通过转录组分析进一步揭示其潜在机制（涉及钠通道活性和PI3K-Akt信号）。本研究考察了DCEF对hADSCs的影响。利用RNA测序和差异基因富集分析，我们比较了两个源自年轻和老年女性供体的hADSC组在DCEF刺激后的基因表达谱，以识别与年龄相关的转录差异。我们假设供体衰老会损害hADSCs的电策略反应性，这种与年龄相关的下降与钠通道活动和PI3K-Akt信号的改变有关。

Protocol

组织采集前均获得所有参与者的知情同意。本研究获中国医科大学第一附属医院伦理委员会批准（批准号：[2018]2018-110-2）。在组织采集前，所有参与者均获得了书面知情同意

hADSC的隔离与培养
组织采集： 人体腹部脂肪组织样本是在中国医科大学第一附属医院整形外科进行常规择期抽脂手术时采集的。所有捐献者均为接受美容腹部抽脂的健康女性志愿者，且未进行额外的外科手术干预以供研究目的。手术外科医生在抽吸后立即在无菌条件下采集组织样本，并在30分钟内将无菌容器冰上转移到实验室。

样本量： 本研究共纳入6名捐献者，其中3名年轻捐献者（年龄：27.00±4.58岁）和3名年长捐赠者（年龄：62.33±4.04岁）。

组织处理： 将脂肪组织碎片转移到50毫升锥形管中，在1800 x g 离心机下4°C离心3分钟，并小心抽取上层油相（以去除多余脂质）。将0.2%的胶原酶IV型（最终体积：每1克脂肪组织5-10毫升）加入组织沉淀，然后将管子放入37°C的水浴或培养箱中浸泡45分钟。消化过程中每10-15分钟轻轻搅动管子，确保胶原酶与组织均匀接触。消化后，通过添加低葡萄糖DMEM，补充10%FBS和1%青霉素/链霉素（中和培养基与胶原酶溶液体积比=1：1）终止反应。

注意：处理胶原蛋白时，请佩戴一次性手套、实验服和安全护目镜以避免皮肤和眼神接触，准备并使用试剂于生物安全柜（BSC）中以防止气溶胶污染，若泄漏，应立即用75%乙醇擦拭，并将受污染物质作为生物废弃物处理。

细胞隔离： 将中和后的消化混合物在1200 x g 离心，4°C离心10分钟，以沉淀细胞。丢弃上清液，然后将沉淀重新悬浮在红细胞溶解缓冲液中（155 mM NH₄Cl，10 mM KHCO₃，0.1 mM EDTA;pH 7.4;体积：每粒2-3 mL），并在室温（22-25°C）下培养5分钟以裂解残留红细胞。通过200微米滤网依次过滤细胞悬浮液，去除未消化的组织碎片，获得单细胞懸浮液。

细胞计数： 播种前，使用血细胞计数仪进行定量。简要地，hADSCs与0.25%胰蛋白酶-EDTA分离，重新悬浮于生长基中，并与0.4%的锥蓝溶液1：1混合。可存活细胞（未染色）通过Neubauer血球计在光学显微镜下手动计数，计算总可活细胞数为：细胞数/mL = （平均计数细胞 × 稀释因子 x 10⁴）。

细胞培养： 将过滤后的细胞以5 x 10³ cells/^cm2 的密度播种，培养基（低葡萄糖DMEM + 10% FBS + 1% 青胰素/链霉素），并在37°C与5%_CO2培养。每2-3天更换培养基以去除不粘附的细胞并保持最佳培养条件。后续实验中使用的所有hADSC均位于第3至第5通道。

hADSC 特性描述
细胞表面标记的表达：培养细胞至70%汇聚度，然后用0.25%胰蛋白酶-EDTA分离粘附细胞（在37°C下培养3分钟）。在300 x g下离心细胞悬浮液，4°C，持续5分钟，丢弃上清液，并将细胞沉淀液重新悬浮于1x PBS（体积：1-2 mL）中。每个样本中1x10个⁵细胞（再悬浮于100微升1xPBS）中，并添加指定稀释度下的荧光共軛抗体：抗CD44（1：50）、抗CD90（1：100）、抗CD29（1：50）、抗CD73（1：50）和抗CD105（1：20）^1,4,7。将抗体-细胞混合物在4°C下在黑暗中孵育30分钟，以避免荧光团灭光。培养后，在4°C下以1000 x g离心5分钟，完全抽取上清液。将沉淀重新悬浮在1-2毫升1xPBS中，再次以1000 x g离心机在4°C下3分钟，丢弃上清液，重复洗涤2次以去除未结合抗体。最后，将细胞沉淀重新悬浮于200微升新鲜1x PBS中，使用流式细胞仪获取荧光数据，并使用FlowJo软件（v10）进行定量分析。门控工作流程遵循标准MSC表型程序：FSC-SSC门通过排除碎屑并根据大小和粒度选择主细胞群体，随后使用FSC-A对FSC-H和SSC-A与SSC-H图进行双重排除，以确保单细胞事件。随后，进行了活细胞门控排除锥蓝阳性或PI阳性死细胞。单染色对照采用荧光门控，未染色对照组设定CD29、CD44、CD73、CD90、CD105（阳性标志）和CD34、CD45（阴性标记）的阈值。导出并分析了代表性门控图以确认hADSC的身份。

微分潜力
脂肪生成分化： 利用0.25%胰蛋白酶-EDTA采集P3世代hADSCs，在85%汇聚度下采集，然后以每孔1 x 10⁵细胞密度（使用完整DMEM培养基）播种24孔板，在37°C与5%_CO2培养，直到细胞再次达到85%的汇聚度。诱导时，使用脂肪生成分化套件，按照手册重组组分A（脂肪生成诱导剂）和成分B（脂肪生成维持剂），前3天使用A组分，1天后切换到组分B。重复这个循环三周。染色时，抽取诱导培养基，轻柔用3毫升1x PBS洗细胞（避免破坏细胞层），室温下用4%对甲醛（PFA）固定细胞20分钟，然后用0.3%Oil Red O溶液（用60%异丙醇制备）在室温培养15分钟。用1倍PBS洗细胞3次去除多余染色，然后用倒置光学显微镜（20倍）成像脂滴。

骨生成分化： 将hADSC种子于12孔板中，密度为每孔1 x 10⁵细胞，当细胞汇聚度达到85%时，使用成骨分化试剂盒诱导——在低葡萄糖DMEM中重建组分A（成骨诱导剂）和B组分（成骨补充剂）（最终浓度：10% FBS，1% 青霉素/链霉素，0.1 μM地塞米松，10 mM β-甘油磷酸）， 0.05 mM 抗坏血酸-2-磷酸）并每三天刷新培养基，持续三周。染色时，将含有4% PFA的细胞在室温下固定15分钟，用1xPBS洗涤3次，然后用2%丙醇红S溶液（pH值4.2，在去离子水中制备）在室温下培养30分钟。用1倍PBS洗细胞3次去除未结合染色，然后用相差显微镜成像钙沉积结节（20倍），并使用ImageJ软件测量Alizarin红S阳结节面积，定量矿化。

软骨病分化： 在15毫升锥形管中离心250,000 hADSCs，500 x g，4 °C，离心5分钟，形成细胞沉淀，向管内加入500微升完整DMEM培养基，并在37°C与5%_CO2 共孵育一夜以稳定沉淀。第二天，使用软骨生成分化试剂盒诱导——在_CO2非依赖培养基（最终浓度：1%青霉素/链霉素，10 ng/mL TGF-β3,50 μg/mL抗坏血酸-2-磷酸，100 μg/mL丙酮酸钠）中重组软骨生成分化剂A（软骨诱导剂），并每3天轻柔刷新培养基（避免扰动沉淀）。诱导3周后，将细胞沉淀用4% PFA定型30分钟，抽取定影剂，在室温下用0.1%（水/伏）托鲁胺蓝O溶液（制备于0.1 M醋酸钠缓冲液，pH 4.0）在室温下孵育15分钟，吸取染色剂，用去离子水冲洗沉淀3次以去除多余染料， 然后在明场显微镜下进行20倍成像，并通过使用ImageJ软件测量甲苯胺蓝O染色的平均光学密度（OD）来定量硫酸蛋白聚糖的积累。

注意：处理4%PFA（一种有毒腐蚀性试剂）时，务必在排气柜内工作，佩戴一次性手套、实验服和安全护目镜，以避免吸入蒸汽或接触皮肤和眼睛——如发生接触，立即用流动水冲洗15分钟并就医。在危险废物处置时，应将用过的PFA及PFA污染材料（如移液器吸头、板）收集到标有PFA废物的专用化学废物容器中，并按照机构的有害废物处理程序进行处置，确保不与生物废物混合。

Electrotaxis腔体组件：在中心线两端钻两个孔（直径0.75厘米），位于距培养皿边缘1厘米处的培养皿盖上（以适应琼盐桥）。在培养皿底部中心线沿边缘距4厘米处，涂抹一层薄薄的真空润滑脂（≤长2厘米，宽≤1厘米）（见图1A）。使用无菌细尖镊子，在每个润滑脂贴上1厘米×2厘米的无菌玻璃盖片，轻轻按压以确保密封（避免盖片破裂;图1B-C）。在每个附着的盖玻片上再涂一层薄薄的真空润滑脂，然后直接在润滑脂上放置第二层无菌的1厘米×2厘米玻璃盖玻片，形成双层盖玻片堆叠。轻轻按压，确保两片盖片之间密封紧密（防止介质泄漏;图1D）。沿着连接一个盖滑套堆左上角与最近碟边、对侧堆栈右下角与最近边缘的对角线，涂抹真空润滑脂，形成连续的屏障墙。墙壁应紧贴盘底（无缝隙），高度约2厘米，宽约0.5厘米（见图1E）。在紫外线下对组装后的腔体消毒20分钟（以消除微生物污染），然后在室温下无菌保存直到使用（见图1F）。

DCEF刺激： 将无菌玻璃载玻片（用于细胞播种）放入10厘米培养皿中，并在37°C下与5%_CO2 隔夜孵育，以预处理载玻片（促进细胞附着）。通过将10毫升10x存液稀释到90毫升ddH₂O（无菌;最终浓度：58 mM NaCl，0.67 mM KCl，0.44 mM Ca（_{NO 3}）₂4H₂O，0.83 mM MgSO₄7H₂O，10 mM HEPES;pH 7.4）制备Steinberg溶液。将0.3克琼脂加入20毫升的斯坦伯格溶液中，微波加热20秒，直到琼脂完全溶解且溶液透明，然后立即将热琼脂-斯坦伯格混合物填充定制玻璃盐桥，使其在室温下凝固。固化后，在紫外线下对盐桥进行灭菌15分钟，并在紫外线下对两个烧杯（每杯装有30毫升斯坦伯格溶液）消毒15分钟。在预处理的无菌载玻片上以2 x 10⁴细胞/平方厘米密度的P3生成hADSC种子，在37°C与5%_CO2 下培养24小时，以促进细胞粘附， 然后将细胞播种的载玻片转移到组装好的导电引导舱跑道上，并用无菌侧滑套固定（以防止移动）。通过在真空润滑脂上放置3厘米×2厘米的玻璃盖套，轻轻按压以确保密封，并在顶盖套边缘涂抹额外真空润滑脂以形成屏障（防止介质蒸发）来密封跑道。用_CO2独立培养基填充腔室储液（补充10% FBS和1%青霉素/链霉素;容量：每个储液槽5-8毫升），将消毒过的琼盐桥通过培养皿盖上的孔插入（一端浸入腔室介质储液槽，另一端浸入Steinberg溶液充填烧杯），并通过Ag/AgCl电极将烧杯连接到电源（以提供稳定的直流电）。施加2 V/cm的直流电场（DCEF）4小时，每15分钟使用数字万用表监测电压（如有需要可调整以保持场强恒定），并使用软件（5倍物镜明场模式）每5分钟拍摄4个随机场下的细胞迁移延时图像。

注意：使用电气设备时，确保电源和电极干燥，并放置在非导电表面，以避免触电。连接或断开电极时请戴绝缘手套，调整前关闭电源，若介质泄漏到电气元件，应立即断电并用浸有75%乙醇的吸水纸擦拭。本研究通过最小化电泳室厚度并保持约1毫米，并在电泳室两端进行多点电压测量，将电场强度变化控制在10%以内。在这些条件下，认为培养区内的电场分布基本均匀²⁶。

迁徙与形态分析
实时影像： 对于采用DCEF刺激的hADSC，将延时图像序列（5分钟间隔）导入ImageJ软件，使用手动追踪插件从起点（t=0）到刺激结束（t=4小时）手动跟踪4个独立场的100个单元格，计算平均迁移速度（μm/min）和方向性（D/T比，其中D = 从起点到终点的直线距离）， T = 总路径长度），使用趋化工具插件（ImageJ）。

追踪： 计算以下迁移参数以量化定向电行为：方向性（Σcosθi/n，其中θi是单元位移矢量与电场方向（EF）之间的夹角，n是跟踪单元的总数，范围为-1到1，接近1表示阳极导向迁移更强）、累积距离（每个单元在刺激期间的总路径长度， 单位为μm）、追踪速度（累积距离除以刺激时间，单位为μm/h）和欧几里得距离（每个单元的直线起点到终点位移，单位μm，反映净迁移）。

形态计量学： DCEF刺激后，在室温下用4% PFA固定细胞20分钟，用1倍PBS洗涤3次，在室温下用Phalloidin-TRITC（1：500稀释剂，1倍PBS;体积：每孔200微升，24孔板）染色30分钟（标记F-肌动蛋白），然后用DAPI（1微克/毫升，1xPBS;体积： 每孔100微升）持续5分钟。细胞通过20倍倍的荧光显微镜成像（代表性高分辨率图像为40倍）。Phalloidin-TRITC的成像方式为激发波长为540-555 nm，发射波长为565-580 nm，而DAPI则采用358-405 nm激发波长和420-480 nm的发射波长成像。然后测量ImageJ中的以下形态参数：长轴（最大Feret直径，单元周边任两点之间的最长距离）、垂直长度（单元体垂直于长轴的宽度）和垂直度（sinα，其中α是单元长轴与EF方向之间的夹角，值越高表示与EF的对齐度越高）。

衰老与扩散测定
SA-β-Gal染色： 使用衰老检测套件在明场显微镜下识别衰老细胞（蓝色染色细胞）。在6孔板中以每孔2 x 10⁵ 细胞密度进行种子P3生成hADSC，培养至80%的融合度，抽取培养基，轻柔清洗细胞3次，每孔添加1毫升固定液（盒中附带），并在室温下培养15分钟，3次用1xPBS清洗细胞以去除固定液残留。 每孔添加0.5毫升SA-β加仑染色工作液（根据试剂盒手册，将50微升SA-β加仑底物与450微升染色缓冲液混合制备），用透明膜封闭板（防止蒸发），在37°C下培养一夜（16-18小时）（避免暴露_CO2 ，因为它改变pH并抑制酶活性）， 次日拍摄每孔≥10个随机场（10倍目标值）的明场图像，统计蓝色染色（SA-β加仑⁺）细胞数及总细胞数，计算衰老细胞百分比为（SA-β加仑⁺ 细胞数 / 总细胞数）×100。

Ki67免疫染色
SA-β加仑染色后，抽吸染色溶液，用1倍PBS洗细胞2次，室温下用0.1% Triton X-100（1xPBS;每孔1毫升）渗透细胞膜10分钟，再用5% BSA（1xPBS;每孔1毫升）在室温下阻断非特异性抗体结合1小时。随后细胞在4°C下与抗Ki67一级抗体（1：200稀释，1% BSA/PBS;每孔500微升）培养，隔夜。次日，细胞用1次PBS（每次5分钟）清洗3次，去除未结合的初级抗体，并用Alexa Fluor 488 488结合二级抗体（1：500稀释于1% BSA/PBS;每孔500微升）在室温下在黑暗中孵育1小时。细胞再次用1倍PBS清洗3次，并用DAPI（1 μg/mL in 1x PBS;每孔200 μL）进行对色处理5分钟。荧光图像使用荧光显微镜以20倍倍率拍摄（代表性高分辨率图像为40倍）。Alexa Fluor 488标记的Ki67⁺ 细胞被用485-495 nm激发波长和515-545 nm发射波长成像，而DAPI染色核则用358-405 nm激发波长和420-480 nm发射波长成像。增殖细胞的百分比计算为：（Ki67⁺ 细胞数 / DAPI⁺ 细胞核数）乘以100。

注意：处理初级和次级抗体时，应在BSC中工作以防止污染，将抗体分成一次性容量以避免反复冻融循环，并将受抗体污染的材料（如移液器尖端、平板）收集到专用的高压灭菌消毒后再处理。

hADSCs的年龄依赖性电诱导分析： 使用直流脉冲电源生成三种强度的DCEF：0 mV/mm（对照）、100 mV/mm和200 mV/mm，使用活细胞工作站实时观察和记录细胞迁移，对每个EF强度，通过测量累积距离定量比较年轻和老年女性供体hADSC的阳极迁移能力， 欧几里得距离、追踪速度和定向性，每组使用三个独立的生物复制，以确保结果的可靠性。通过ImageJ（NIH）中的手动追踪和趋化工具插件量化了定向电迁移参数。单个细胞在整个4小时刺激期间被人工跟踪，并根据标准方法计算了以下参数：累计距离：记录期间每个细胞所行进的总路径长度。欧几里得距离：单元起始位置与终点位置之间的直线距离。履带速度：累计距离除以总追踪时间（μm/h）。定向性：计算为每个位移矢量与电场矢量之间角度（θ）的平均余弦值（值范围为-1至1;接近1的值表示阳极迁移较强）。

RNA测序
RNA提取与制备： 在紫外线下将装满冰块的容器消毒15分钟（以保持RNA稳定性），然后在冰上完成后续步骤。将hADSC种子玻璃载玻片（1厘米×2厘米）从趋电腔转移到无菌培养皿，用3毫升冰冷的1倍PBS洗细胞3次（轻轻加入PBS，轻轻搅拌，完全抽取以去除残留介质），然后向每张载玻片加入1毫升TRIzol试剂，在室温下培养20分钟，使细胞完全裂解（确保裂解液覆盖整个细胞层）。将裂解液转移到无RNase的1.5毫升离心管，加入0.2毫升氯仿，强烈旋转15秒诱导相分离，将管子冰藏15分钟，然后以12,000 x g 离心机在4°C下离心15分钟。 这使裂解液分为三层：含有RNA的上水相、中间的蛋白质层和下有机相。小心地将上层水相（≈ 0.5 mL）转移到新的无RNase管（避免接触中间层），加入0.5 mL异丙醇，轻微涡旋沉淀RNA，冰藏10分钟，然后以12,000 x g 离心机在4°C离心10分钟;RNA会在管底形成白色颗粒。丢弃上清液，重复异丙醇沉淀一次以提高RNA纯度，完全抽取上清液，将RNA沉淀置于室温BSC中自然风干5-10分钟（勿过度干燥，以免降低溶解度），将RNA沉淀重新悬浮于30微升DEPC处理水中，在55°C下培养10分钟以助溶解， 通过使用分光光度计测量A260/A280比值（目标：1.8-2.0）来量化RNA纯度，使用RNA纳米芯片评估RNA完整性;目标：RNA完整性数[RIN] > 8.0，并将合格RNA样本存放于-80°C，直到测序。

注意：三唑和氯仿有毒、挥发性强且致癌，务必在排风柜内使用，同时佩戴丁腈手套、实验服和安全护目镜——避免吸入蒸汽，若洒在皮肤上，用纸巾擦拭，并用肥皂和水冲洗10分钟，切勿与漂白剂或其他氧化剂混合使用（以免产生有毒气体）。对于与RNA提取相关的危险废物处置，应将混合物、异丙醇上清液和受污染管收集在密封、耐化学且标有RNA废物的容器中（勿与水性废物或生物废物混合），并按照机构危险废物规范处置，确保不会倾倒在排水沟中。

数据预处理与质量控制： 按照制造商的协议，使用VAHTS的mRNA-seq文库准备套件制备测序文库——用寡核苷酸（dT）磁珠富集mRNA，利用二价阳离子将mRNA片段化为200-300碱基对的片段，使用随机六聚体合成第一链cDNA，再用第二股cDNA，进行末端修复，添加A尾，连接测序适配器，通过PCR扩增文库，并用珠子进行纯化。在测序平台上对文库进行测序（150碱基对端读段），每个样本产生约5000万个原始读段，然后使用软件修剪低质量读段（去除具有Phred质量评分<20>50%碱基的读段）和适配序列，保留约4800万个干净读段（每样本约30次>90%），用于裁剪后下游分析。

生物信息学分析： 使用Hisat2 v2.2.1软件将干净的读段比对到人类参考基因组（GRCh38/hg38），并将比对结果保存为BAM文件，使用htseq-count v0.13.5软件统计每个基因映射到的读取次数（基于Ensembl基因注释），使用DESeq（2012）R软件中的estimateSizeFactors函数对基因计数数据进行归一化，以消除批量效应和测序深度差异， 并使用nbinomTest函数（DESeq包）进行差异表达分析，利用折叠变化阈值（FC）>2，调整p值（padj）<0.05，选择差异表达基因（DEGs）。使用clusterProfiler v4.0 R软件包，对DEG进行基因本体（GO）富集分析（生物过程、分子功能、细胞组分）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，重点关注与细胞迁移相关的富集（如细胞附着、细胞迁移）、离子转运（如钠离子跨膜转运）及信号通路（如PI3K-Akt信号通路）。使用pheatmap v1.0.12 R软件包对DEG进行无监督的层级聚类，并用热图（行尺度z分数）可视化样本间的基因表达模式。

统计分析： 所有实验数据均以均值±标准误（平均 ± SEM）表示，每组至少有3个独立的生物复制（n≥3个）。使用学生t检验比较两组（如年轻捐赠者与老年捐献者）之间的差异，并进行单向方差分析（ANOVA），随后使用Tukey事后检验比较三个或多个组间的差异（例如不同的EF强度），使用SPSS 23.0软件进行统计分析，并定义统计显著性如下：*p < 0.05， **p < 0.01， < 0.001页。

Results

电场的应用引导hADSC的定向迁移，增强其迁移能力
提取的hADSC表现出典型的间充质干细胞表面标记（如CD29、CD44、CD90、CD73、CD105），并具有三谱分化潜力（脂肪生成、骨生成、软骨生成;图2A），符合hADSC识别的标准标准。我们应用了0 mV/mm、100 mV/mm和200 mV/mm的直流电场（DCEFs），以研究hADSC的定电响应。在无电刺激（0 mV/mm）的对照组中，hADSCs向随机方向迁移。然而，在外源性DCEF刺激下，200 mV/mm，细胞会朝阳极方向迁移（图2B）。此外，随着电场强度的增加，向阳极迁移的hADSC数量也增加（见图2C-D）。通过量化单元位移矢量与电场矢量之间的夹角，我们观察到阳极导向迁移在场强增强时显著增强（见图2E）。值得注意的是，尽...

Discussion

在组织损伤修复和再生的早期阶段，电场作为微环境中最早确立的物理线索之一出现。它们的方向性特性与细胞招募到损伤部位的时空相关性²⁷。内源性电场源自上皮组织中极化离子输运产生的跨上皮势。当上皮屏障被破坏或经历老化时，电位会被次要改变，而未受损或非衰老区域则保持离子输运，产生与上皮表面平行的DCEF电压梯度²⁸。在这种情况下，损伤中心充当阴极，是电场的关键组成部分。ADSC位于^{脂肪组织中}的特定干细胞位中。越来越多的证据表明，ADSC可以从其原生生态位中被动员，参与皮肤修复和再生³⁰。本研究探讨了ADSC是否对外部DCEF表现出趋电反应，从而评估其在皮肤再生过程中对内源性EF的响应性。我们的发现表明，在DCEF刺激下，ADSC会朝阳极方向迁移，其迁移极性与EF强度呈正相关。鉴于ADSC在伤口愈合和组织再生中的关键作用，多项研究探讨了其电定性行为。例如，小鼠的ADSC也在类似的EF范围

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4°C/-20°C/-80°C型冰箱	海尔，中国	HYC-390/DW-25L262/DW-86L728J
琼脂	中国胡什	10000561
安捷伦2100生物分析仪	安捷伦科技，美国	G2939BA
阿利扎林红 S	Sigma-Aldrich，美国	A5533
生物安全柜及nbsp;	美国Thermo Fisher Scientific公司	1300 A2 1.5 米
CaNO3·4H2O	中国胡什	10013960
离心机	美国Thermo Fisher Scientific公司	X4R 优点;
CO2 孵化器	美国Thermo Fisher Scientific公司	Forma Steri-Cycle 3307
胶原酶IV型	Biosharp，中国	BS076
共焦点显微镜	德国蔡司	LSM 900
直流脉冲电源	韩国大道Powertronics	DDP-500
地塞米松	Sigma-Aldrich，美国	D4902
数字万用表	弗鲁克，美国	弗鲁克-175
DMSO	Sigma-Aldrich，美国	D2650
电子天平	德国萨托留斯等;	BSA224S-CW
FBS	Gibco，美国	10270-106
流式细胞仪	美国Thermo Fisher Scientific公司	A24858
IBMX（1-甲基-3-异丁基黄基）	Sigma-Aldrich，美国	I7018
吲哚美辛	Sigma-Aldrich，美国	I7378
胰岛素	Sigma-Aldrich，美国	I5500
倒置显微镜	德国蔡司	Axio 观察者7号 / ACR
ITS-G	Sigma-Aldrich，美国	I3146
KCl	中国胡什	10019318
KH2PO4	中国胡什	10019320
亚油酸等;	Sigma-Aldrich，美国	L1376
活跃基站	活细胞仪器，韩国	查姆利德 TC
低葡萄糖DMEM	Gibco，美国	11885084
MgSO4·7H2O	中国胡什	10019322
Na2HPO4middot;12H2O	中国胡什	10019324
氯化钠	中国胡什	10019318
NanoDrop 2000分光光度计	美国Thermo Fisher Scientific公司	ND-2000
油红O	Sigma-Aldrich，美国	O0625
青霉素/链霉素	Gibco，美国	15140122
移液器	德国埃彭多夫	4920000061
SYBR 预混 EX Taq	中国Takara;	RR420A
甲苯胺蓝 O	Sigma-Aldrich，美国	T3260
特里斯	中国胡什	10019326
特里佐尔	碧昂泰姆，中国	R0016
胰蛋白酶-EDTA	Gibco，美国	25200056
立式显微镜	德国蔡司	415200-0000-000
真空润滑脂	道·康宁，美国	1597418
维生素C	Sigma-Aldrich，美国	A4544
水净化系统	美国Thermo Fisher Scientific公司	GenPure xCAD Plus UF-TOC
&β;-甘油磷酸	Sigma-Aldrich，美国	G9422