利用氙气麻醉验证高压压系统对果蝇黑腹胃菌的治疗

摘要

在大气压下看似无害的气体，在高压条件下可能会引发如麻醉等行为。传统的高压压舱成本高且劳动密集。本研究提供了一种简单且低成本的方法，用于在4个大气压以下的中等压力下，观察氙对果蝇黑腹蝇的影响。

摘要

在高压氧条件下，环境气体浓度升高可能引发各种动物的行为反应。这些行为中有相当一部分代表了认知状态的变化，但这些变化尚未被充分理解。一个显著的例子是全身麻醉。尽管这些药物在医学中使用频率极高，但对多种气体在全身麻醉（麻醉）条件下的行为影响一直是长期的科学研究。氙被归类为贵重气体和麻醉剂，被认为是人类全身麻醉中最安全的选择之一。然而，在正常压力条件下，它不会对苍蝇进行麻醉。我们建立了一个简单的实验装置，将环境压力提升至~3大气压，并允许研究最受欢迎模式生物之一—— 果蝇（Drosophila melanogaster ）的氙麻醉。该实验装置进一步促进了对其他气体及其在高压条件下影响的研究。

引言

在高压氧条件下观察到的行为效应的两个极端端点是氧气引起的痉挛和氮气引起的^麻醉。有趣的是，在低于无意识水平的压力值下，有报告显示出现幻觉和记忆障碍等认知^障碍，如氮气和氢气。在^高压条件下，氙、氪和一氧化二氮诱导的麻醉已有^报道。

全身麻醉既是医学的基石，也是一个具有相当科学价值的现象。尽管使用时间长且广泛，我们对某些化学物质究竟如何导致暂时性运动、记忆、疼痛和意识缺失的了解仍然^有限。氙作为稀有气体，可以被任命为麻醉剂中最特殊的成员。它被认为是一种安全的麻醉选择，提供快速诱导和恢复，生理干扰最小，且仅有轻微副作用，如术后恶心^8,9。

鉴于麻醉的重要性及氙的特殊化学性质，本研究旨在利用简单的动物模型Drosophila melanogaster，探讨氙诱导的麻醉效果。已有多种研究利用果蝇研究全身麻醉，提出了许多建议的装置和各种挥发性麻醉剂的使用，如^{10、11、12、13}。然而，目前尚无果蝇中氙气麻醉的报告。在正常气压条件下，氙不会对果蝇（俗称果蝇）产生麻醉。为解决这一限制，本研究提供了一种高压系统，能够控制1大气压至约4大气压之间的环境压力。已有多项研究利用高压氧舱来回答类似的奇特问题^14,15。然而，大多数商用高压氧舱依赖坚固且防漏的材料，但体积较大（~3升），作系统性复杂且成本高。相反，本文所述的方法简单且成本低廉，允许探索各种气体及其组合的影响。它提供了适合小动物模型如黑胃王和秀丽隐杆线虫的设置。

方案

1. 果 蝇黑色胃肠 制备

1. 每次实验使用_CO2采集20只1-3天龄的雌蝇和20只雄蝇。
2. 在实验前，将选定的果蝇放入与食物一起的小瓶中，温度在~22°C下休息至少24小时。

2. 麻醉输送

1. 将容器中的气体转移到防漏气体袋进行实验使用。为了将气体直接从容器输送到袋子，可以使用硅胶管。
2. 将直径25毫米（3.4毫米）的硅胶管连接到聚丙烯注射器上。然后将聚丙烯注射器连接到气囊和三通水龙头。为方便起见，本文其余部分将将聚丙烯注射器称为注射器#1。

3. 高压装置的组装（见图1）

1. 将LED灯台横向放置在桌面上（长边水平于桌面）。
2. 将注射泵放置在LED灯台的短边旁边，确保泵的朝向允许实验注射器伸出背光。
3. 将摄像头放置在装置上方，覆盖实验注射器所在区域。
4. 剪一根75毫米长的硅胶管（直径3.4毫米）。用中央喷嘴的硅胶管将三通阀连接到压力计。
5. 用压力计侧面的软管弹簧夹固定喷嘴和三通阀，确保管子紧固。
6. 使用喷油泵控制单元中标记的双箭头按钮，将速度设置为80毫米/米，持续时间为38秒，用于自动压缩或减压活塞。

4. 氙气麻醉程序

1. 限制实验室的环境光，打开LED灯台，亮度调到3级。这有助于提升视频的对比度。
2. 取下聚碳酸酯注射器的活塞。在注射器的嘴唇处插入少量棉花，以防止苍蝇逃逸。为方便起见，本文其余部分将将聚碳酸酯注射器称为注射器#2。
3. 要将40只苍蝇从小瓶转移到注射器#2，首先打开瓶盖，将注射器桶垂直放在注射器顶部。桶法兰应与瓶口融合，以便飞蝇进入注射器桶。将构造体旋转180度并轻敲。这样就能把飞蝇放在注射器桶底部。把活塞放回去。将带飞蝇的注射器放入注射泵内。
4. 将注射器的桶痕朝向侧面，以便从相机视角更好地观察苍蝇。
5. 用可调节螺丝将注射器从注射器和柱塞头固定到注射泵上。
6. 取下注射器#2的棉花，并用三向水龙头连接。
7. 开始录像。打开气压计。转动阀塞，将压力计与注射器#2连接，并用压力计确认注射器内压力为0 kPa。
8. 在实验前将三向阀门转到侧向位置，以便与注射器进行空气交换。
9. 通过喷油泵的手动控制选项将柱塞从20转到2毫升，该选项旨在实现最快的作。
10. 从气囊吸入18毫升麻醉气体到注射器#1。将注射器#1连接到侧向鲁尔锁口的三通接头。为了评估正确体积，20毫升混合气中18毫升麻醉气体可达到90%的气体比例。这个比例可以根据期望的最终气体百分比进行调整。
11. 通过手动注射泵将活塞移回20毫升管线。
12. 转动阀塞，将压力计与注射器#2连接起来。通常，压力计显示麻醉剂注注后压力~-3 kPa。
13. 自动移动活塞，速度和时间设置为80毫米/秒和38秒。泵预计在38秒内能到达桶体5毫升的能量条。当柱塞停止时，最大压力必须为~200 kPa。
14. 将活塞保持在5毫升位置20秒。注意峰值压力。
15. 轻敲注射器，将附着在活塞上的苍蝇弄下，使其静止地停留在底部。
16. 20秒结束时启动自动减压。当活塞回到20毫升的能量棒时终止实验。注意泄漏控制的最终压力。

5. 数据分析

注：本实验以麻醉药产生作为终点。飞蝇的运动是从活塞减压开始时间开始量化的。开发了两种不同的分析方法：像素分析和飞跟踪。每种分析方法都有其缺点，这些缺点在讨论中有所体现。

1. 像素分析
   1. 用ScreenFlow来编辑视频。将每个视频裁剪到感兴趣区域（ROI），即注射器桶的前5毫升。
   2. 把视频剪辑到注射器减压后的前20秒。把剪辑好的视频导出成GIF。复制动图。
   3. 使用斐济，从一个复制品中移除第一帧，从另一个复制品中移除最后一帧。要实现这一点，请选择 “图片>视频编辑>删除帧”。
   4. 把斐济的每个GIF做成二进制，让苍蝇在黑色背景上呈现为白色。要实现这一点，请选择 “过程 > 二进制 > 制作二进制”。
   5. 在斐济打开两个GIF。计算这些GIF之间的像素差。要实现这一点，请选择 “图像>过程计算器”。这个作会生成像素差GIF。
   6. 保存像素差GIF。分析不同GIF中的粒子。为此，选择“ 分析”>“分析斐济的粒子 ”。调整像素大小阈值以提升信噪比。
   7. 分析粒子后，斐济输出带有每帧像素差异的CSV。保存CSV。CSV数据可用于绘制每帧的移动。利用累积的帧移动来分配实验间的统计差异。
2. 飞蝇追踪
   注意：在蝇类追踪方法中，实验视频中利用了人工智能技术检测和追踪每只蝇的质心。为此合并了两种型号：YOLO（你只需看一次）用于检测，MASA（通过分段匹配任意物体）用于追踪。模型在谷歌Colab上运行，使用特斯拉T4显卡。
   1. 在 Colab 安装 Ultralytics YOLO 库，然后加载 yolo11n.pt 模型。使用CVAT（计算机视觉注释工具）对从视频中提取的画面中的苍蝇进行注释，然后导出为YOLO格式的数据集进行训练。详细的安装和培训流程详见在线仓库。
   2. 在 Google Colab 中安装 MASA 仓库，并集成 Kalman 滤波器以实现连续帧间的对象跟踪。将训练好的YOLO检测模型与MASA跟踪框架集成。
   3. 使用 FixTrack 手动审核由合并后的 MASA+YOLO 流水线生成的 tracklet。识别并合并错误碎片化的航迹片段或纠正身份不匹配，以获得单个飞蝇的连续轨迹。详细的安装和培训流程详见 FixTrack 仓库。

结果

本文所述的方法能够监测高压条件下飞蝇的运动活动时间和范围。这种结构使得氙气和一氧化二氮等在正常条件下无麻醉特性的气体能够在 果蝇中产生麻醉作用。为了证明这一点，我们实验了不同浓度的氙和空气。我们开始建立工艺时，使用90%氙气和10%空气。随后，我们通过比较麻醉气体量增加和减少5%时测量到的差异，证明了该方法的灵敏度。 图1 展示了90%氙气麻醉方案。

图1：高压麻醉暴露的实验装置及步骤。 首先，注射器#2的活塞被压缩至2毫升条线（1）。然后，麻醉剂氙从气袋（2）中吸入注射器#1。注射器随后连接到三通吸头（3）。为给果蝇施打麻醉剂，需用电动注射泵（4）拉动注射器#2的活塞。三段...

讨论

这一简单低成本的装置使果蝇的高压行为检测广泛可及，实现无需专用压力容器即可快速且可重复的实验。然而，它存在一些局限性。其一个重要的妥协是相对于现有装置的最大压力更低。这种设置能诱发的最高压力是~4大气压，而用于果蝇的压力容器据报道可达大约两倍，而小鼠系统最高可达^{100大气16,17}。这些高压容器的缺点是通常成本高昂、劳动密集型，并且需要大量气体。

在方法开发过程中，有两个主要问题挑战了我们;第一个是在注射器内保持高压数分钟。我们观察到压力下降，尤其是在高设定点时，并确定了两个原因：注射器因活塞-密封松动导致气体泄漏，以及气体通过硅胶管扩散。为了解决管子问题，我们尽量减少了管子的使用，并使用了弹簧软管夹。我们选择了20毫升注射器，因为小容量注射器更容易漏液。常见的低容量注射器采用较薄的活塞垫圈，导致密封松动，高压时泄漏增加。小容量注射器的另一个问题是枪管凹面较大，增...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
密封气囊（0.5升）	技术介绍	7440440
相机	苹果	iPhone 15
双线弹簧软管夹	来源地图	a24120200ux2109
果蝇饲料混合	高级饲养	DM900
果蝇 melanogaster	达尔文生物	LZ-210
注入管	艾托瑟利亚	B09M8G5BQ8
LED灯台	莱里	M1-3878368
压力计	德怀尔欧米茄	477AV-8
金属三段压缩螺母止水阀	西格玛·奥尔德里奇	Z182184
聚碳酸酯注射器（20毫升）	DMC医疗	FD-1031NS
聚丙烯注射器（20毫升）	BD	301031
硅胶管
氙气	成都太裕工业煤气