在常压下看似无害的气体，在高气压条件下可能引发麻醉等效应。传统的高气压舱成本高昂且操作费时。本研究提出一种简单、低成本的方法，用于研究在低于4个大气压的中等压力下，氙气对黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的影响。
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本文内容
摘要
摘要
在高压条件下，环境中气体浓度的升高可能引发多种动物的一系列行为反应。其中许多行为代表了认知状态的变化，而这些变化目前仍缺乏充分理解。一个显著的例子是全身麻醉。尽管麻醉药物在医学中被广泛频繁使用，但多种气体在高压条件下的行为效应，即麻醉或麻醉样作用，长期以来一直是科学研究的课题。氙气作为一种惰性气体和麻醉剂，被认为是人类全身麻醉中最安全的选择之一。然而，在常压条件下，氙气并不能使果蝇进入麻醉状态。在此，我们建立了一种简单的实验装置，可将环境压力升高至约 3 个大气压，从而能够在最常用的模式生物之一黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中研究氙气的麻醉作用。该实验装置还可进一步用于研究其他气体及其在高压条件下的效应。
引言
在高压条件下，动物表现出的两种极端行为效应分别是氧气引起的惊厥和氮气引起的麻醉1,2。奇怪的是，已有报道称在达到意识丧失程度之前，氮气和氢气在一定压力下可导致幻觉和记忆障碍等认知功能损害3,4。既往已有文献报道氙气、氪气和一氧化二氮在高压条件下可诱导产生麻醉作用5,6。
全身麻醉既是医学的重要基石，也是具有重大科学意义的现象。尽管全身麻醉已长期被广泛应用，但我们对某些化学物质如何精确诱导机体暂时丧失运动、记忆、痛觉和意识的机制仍知之甚少7。氙气作为一种稀有气体，可被视为麻醉剂中最特殊的一种。它被认为是一种安全的麻醉选择，具有诱导和苏醒迅速、生理干扰最小以及仅引起轻微副作用（如术后恶心）等优点8,9。
鉴于麻醉在医学上的重要性以及氙气独特的化学性质，本研究旨在利用简单的动物模型Drosophila melanogaster来探究氙气诱导的麻醉作用。已有大量研究采用果蝇作为模型来研究全身麻醉，提出了多种实验装置，并使用了多种挥发性麻醉剂10,11,12,13。然而，目前尚无关于Drosophila中氙气麻醉的报道。在常压条件下，氙气无法在Drosophila melanogaster（通常称为果蝇）中诱导麻醉。为克服这一局限，本研究提供了一种高压系统，可在1 atm至约4 atm范围内精确调控环境压力。已有若干研究利用高压舱来探索类似问题14,15。然而，大多数商用高压舱虽采用坚固且密封性良好的材料制成，但其体积较大（约3 L），系统操作复杂且价格昂贵。相比之下，本文所述方法简单且成本低廉，便于探索不同气体及其组合的作用效果，适用于D. melanogaster和C. elegans等小型动物模型的实验需求。
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方案
1. Drosophila melanogaster 的制备
- 使用 CO2 收集每组实验所需的 20 只雌性和 20 只雄性果蝇，果蝇日龄为 1–3 天。
- 将选定的果蝇置于含食物的试剂瓶中，在约 22 °C 条件下静置至少 24 小时，然后进行实验。
2. 麻醉给药
- 将气体从储气钢瓶转移至不漏气的气体袋中以供实验使用。从钢瓶直接转移气体至气体袋时，使用硅胶管。
- 将25 mm（3.4 mm直径）硅胶管连接至聚丙烯注射器，然后将聚丙烯注射器连接至气体袋和三通旋塞。为便于说明，下文中将该聚丙烯注射器称为注射器#1。
3. 高压装置的组装（图1）
- 将LED光源台水平放置在桌面上（长边与桌面平行）。
- 将注射泵放置在LED光源台的一条短边旁边，确保泵的方向能使实验用注射器延伸至背光上方。
- 将相机置于装置上方，使其视野覆盖实验注射器所在区域。
- 截取一段75 mm长的硅胶管（直径3.4 mm）。使用硅胶管通过中心喷嘴将三通旋塞连接到压力计。
- 在压力计端和三通旋塞端的喷嘴上使用软管弹簧夹，确保管路连接紧密。
- 使用注射泵控制单元上标有双箭头的按钮，将推杆自动压缩或拉伸的速度设为80 mm/m，持续时间设为38 s。
4. 氙气麻醉操作步骤
- 在实验过程中限制实验室内环境光，并打开LED灯板，将亮度调至3级，以提高视频的对比度。
- 取下聚碳酸酯注射器的推杆。在注射器乳头口内塞入少量棉花，防止果蝇逃逸。为便于说明，后文将该聚碳酸酯注射器称为注射器#2。
- 将40只果蝇从培养瓶转移至注射器#2：首先取下培养瓶盖，将注射器筒身垂直置于培养瓶口上方，使筒身法兰与培养瓶顶部贴合，以便果蝇进入注射器筒内。将整个装置旋转180°并轻敲，使果蝇落入注射器筒底部。重新插入推杆，并将装有果蝇的注射器放入注射泵中。
- 调整注射器筒身上的刻度朝向侧面，以便从摄像机视角更清晰地观察果蝇。
- 使用可调节螺丝将注射器筒身和推杆头部固定在注射泵上。
- 移除注射器#2尖端的棉花，并将其连接至三通阀。
- 开始视频录制。打开压力计。旋转止流阀，使压力计与注射器#2连通，并通过压力计确认注射器内压力为0 kPa。
- 将三通阀转至侧向位置，使注射器在实验前可与外界进行气体交换。
- 通过注射泵的手动控制功能，将推杆从20 mL刻度移动至2 mL刻度，此为最快操作方式。
- 从气体袋中吸取18 mL麻醉气体至注射器#1。将注射器#1通过侧向鲁尔锁接口连接至三通阀。为确认正确体积，20 mL混合气体中含有18 mL麻醉气体时，气体浓度为90%。可根据所需最终气体浓度进行调整。
- 通过注射泵的手动模式，将推杆回拉至20 mL刻度线。
- 旋转止流阀，使压力计与注射器#2连通。通常在麻醉气体填充后，压力计显示约为-3 kPa的压力。
- 设置注射泵自动运行，速度和时间分别设为80 mm/s和38 s。预计泵在38 s内将推杆推进至5 mL刻度线。当推杆停止时，最大压力应约为200 kPa。
- 将推杆保持在5 mL位置持续20 s。记录峰值压力。
- 轻敲注射器，使附着在推杆上的果蝇脱落，并静止沉降至底部。
- 在20 s结束时开始自动减压。当推杆回到20 mL刻度线时终止实验。记录最终压力，用于泄漏控制。
5. 数据分析
注意：本实验以麻醉苏醒作为终点指标。从活塞减压开始时刻起，对果蝇的运动进行量化分析。开发了两种不同的分析方法：像素分析和果蝇追踪。每种分析方法均存在一定的局限性，相关内容将在讨论部分予以说明。
- 像素分析
- 使用 ScreenFlow 编辑视频。将每个视频裁剪至感兴趣区域（ROI），即注射器筒的前 5 mL 部分。
- 将视频修剪为注射器减压后的前 20 秒。将编辑后的视频导出为 GIF 格式，并复制该 GIF 文件。
- 使用 Fiji，从一个副本中删除第一帧，从另一个副本中删除最后一帧。操作方法为：选择 图像 > 视频编辑 > 删除帧。
- 在 Fiji 中将每个 GIF 转换为二值图像，使果蝇在黑色背景上以白色显示。操作方法为：选择 处理 > 二值化 > 转为二值图像。
- 在 Fiji 中同时打开两个 GIF 文件，计算两者的像素差异。操作方法为：选择 处理 > 图像计算器。此操作将生成一个表示像素差异的 GIF。
- 保存像素差异 GIF。分析不同 GIF 中的颗粒。操作方法为：在 Fiji 中选择 分析 > 分析颗粒。调整像素大小阈值以提高信噪比。
- 完成颗粒分析后，Fiji 将输出一个包含每帧像素差异的 CSV 文件。保存该 CSV 文件。可利用 CSV 数据绘制每帧的运动情况，并通过帧间的累积运动来评估不同实验之间的统计学差异。
- 果蝇轨迹追踪
注意：在果蝇轨迹追踪方法中，采用了人工智能技术来检测并追踪实验视频中每只果蝇的质心。该方法结合了两个模型：YOLO（You Only Look Once）用于目标检测，MASA（Matching Anything by Segmenting Anything）用于轨迹追踪。模型在 Google Colab 平台上使用 Tesla T4 GPU 运行。- 在 Colab 中安装 Ultralytics YOLO 库，然后加载 yolo11n.pt 模型。使用 CVAT（计算机视觉标注工具）对从视频中提取的帧中的果蝇进行标注，并将数据集以 YOLO 格式导出用于训练。详细的安装与训练流程见在线代码库说明。
- 在 Google Colab 中安装 MASA 代码库，并引入卡尔曼滤波器以实现连续帧间的对象追踪。将训练好的 YOLO 检测模型与 MASA 追踪框架集成。
- 使用 FixTrack 手动检查由 MASA+YOLO 联合流程生成的轨迹片段。识别并合并错误分割的轨迹片段，或修正身份匹配错误，以获得个体果蝇的连续运动轨迹。FixTrack 的详细安装与使用方法见其代码库说明。
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结果
本文所述方法可用于监测果蝇在高气压条件下运动活动的时间和程度。该配置使得在正常情况下不具有麻醉特性的气体（如氙气和一氧化二氮）能够在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中产生麻醉作用。为验证这一点，我们尝试了不同浓度的氙气与空气混合气体。实验首先采用90%氙气和10%空气的混合气体建立流程，随后通过将麻醉气体浓度分别增加和减少5%并比较测量结果，验证该方法的敏感性。图1展示了使用90%氙气进行麻醉的实验方案。
图1：高压麻醉暴露的实验装置及操作步骤。 首先，将注射器#2的推杆压缩至2 m...
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讨论
这种简单且低成本的装置使得高压环境下的行为学检测在 黑腹果蝇 广泛可及，无需专用压力容器即可实现快速、可重复的实验。然而，该方法也存在一些局限性。其中一个重要的折衷是与现有装置相比，其最大压力较低。本装置所能达到的最高压力约为 4 atm，而用于 黑腹果蝇 据报道可达到其约两倍的水平，而用于小鼠的系统可高达100 atm16,17这些高压容器的缺点是通常价格昂贵、劳动强度大，且需要大量气体。
在方法开发过程中，我们面临两个主要问题：第一个问题是如何在注射器内维持数分钟的高压力。我们观察到压力下降，尤其是在较高的设定值下，原因主要有两个：一是由于活塞与垫圈密封不严导致气体从注射器泄漏，二是气体通过硅胶管扩散。为解决管路问题，我们尽量减少装置中管路的使用，并采用弹簧软管夹。我们选择20 mL的注射器，因为较小体积的注射器更容易发生泄漏。常见的低容量注射器其活塞垫圈较薄，导致密封性较差，在高压下泄漏更严重。小容量注射器的另一个问题是筒壁...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由TBD（Tiny Blue Dot）基金会提供资金支持。我们感谢来自Google DeepMind的Jennifer Sun和Ting Liu在追踪技术方面提供的帮助与指导。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 密封气体袋（0.5 L） | Techinstro | 7440440 | |
| 相机 | Apple | Iphone 15 | |
| 双线弹簧软管夹 | sourcing map | a24120200ux2109 | |
| 果蝇饲料混合物 | Advanced Husbandary | DM900 | |
| Drosophila melanogaster | Darwin Biological | LZ-210 | |
| 注射管 | Aitoserlea | B09M8G5BQ8 | |
| LED光源板 | Lairi | M1-3878368 | |
| 压力计 | Dwyeromega | 477AV-8 | |
| 金属三通压缩螺母旋塞阀 | Sigma Aldrich | Z182184 | |
| 聚碳酸酯注射器（20 mL） | DMC Medical | FD-1031NS | |
| 聚丙烯注射器（20 mL） | BD | 301031 | |
| 硅胶管 | |||
| 氙气 | 成都泰宇工业气体 |
参考文献
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