基于再生的高效农杆菌介导的无性两栖十字花科物种Rorippa aquatica转化

摘要

我们提出了一种高效且优化的方案，用于农 杆介导的无性两栖十字花科物种 Rorippa aquatica转化，无需资源密集的无菌组织培养程序。利用视觉转化标记和新芽再生管道，成功生成了近克隆转化剂，推动了植物适应水下环境的未来研究。

摘要

由 农杆菌（Agrobacterium tumefaciens ）介导的植物稳定遗传转化，已成为基础植物生物学研究和直接影响作物改良的植物生物技术的有力工具。简单有效的转化管道，如拟南芥的花卉浸渍法，极大推动了基因功能的大规模分析。然而，这种管道不能适用于不进行有性繁殖的植物物种。 水生罗里帕 是一种新兴的两栖十字花科模式物种，在陆地或水下环境中表现出异叶、剧烈的叶片和植物形态变化。 水生红鹃 完全以营养繁殖方式繁殖。这里展示的优化流程提供了高效且可靠的水生农 杆菌介导 的水生红菌 转化，无需无菌组织培养。叶片插条会短暂浸泡在含有二元载体的转化缓冲液中的 农杆 菌中，该载体在本构启动子下表达视觉标记 RUBY。随后，接种剂会在浸水的滤纸上生长在生长室中生长。然后，将具有 红宝石 红色素的再生苗株分离并移植到土壤中。这些初始T1再生剂（R1-T1）表达红色扇区。通过切除红色扇区并重复再生步骤，下一代R2-T1产生大量转基因兄弟姐妹，其中一些几乎均为红色;表明 RUBY 的表达。这一简单的转化流程可应用于 水生红菌 及其他营养繁殖植物物种，引入感兴趣的基因以研究其适应陆地 与适应性的功能。水域环境。

引言

稳定的遗传转化，即将感兴趣基因引入并表达到特定植物物种中，是基础植物科学和植物生物技术的核心。农杆菌介导的转化是植物基因工程中最广泛使用的手段，因其可靠地产生稳定的转化体¹。开发出一种二元载体系统，其中T-DNA克隆载体和解除武装的vir辅助质粒分为两个实体，彻底革新了农杆菌介导的转化^1,2。对于模式植物拟南芥，一种简单且经济高效的花卉浸泡转化程序实现了高通量克隆（半合子）转化体，用于功能遗传学和基因^组学3,4。然而，对于主要或完全以无性繁殖为主的植物物种来说，这种方法不可行。

两栖植物展现出独特的能力，能够在陆地和水下环境下都能茁壮成长^5.水蓼是一种两栖的十字花科植物，表现出异叶性。在陆生环境中，水面红蜂会发育出圆形叶片，表皮由铺面细胞和气孔组成。相比之下，它们的水生叶表现出适应水下环境的形态：高度切割的针状叶片，表皮无表皮的表皮，没有有表皮细胞或气孔^6,7。在系统发育上，水生红花与拟南芥关系密切;两者都属于同一科，十字花科⁶。结合全基因组序列数据的可用性以及R. aquatica与A. thaliana之间编码基因的高度序列保守性，R. aquatica作为一种新兴的两栖模式植物，研究对陆地^和水域适应的分子基础8。事实上，最近的生理学和基因表达研究表明，光线和激素信号通路的重接对于水红菌^的异叶性^{至关重要。}

为了测试候选基因和途径的分子功能，遗传转化是绝对必要的。水螳螂在自然界中以营养繁殖方式 ^8,9。因此，与A. thaliana不同，农杆菌花朵浸泡转化不能应用于R. aquatica。令人惊讶的是，R. aquatica能轻松从脱落叶片再生整株植物，无需外源性植物^{激素补充。}短暂地，叶片片段脱落后几天内，切面近端的血管组织细胞增殖开始活跃。一周内，根和嫩芽都会再生，最终长出幼苗（玫瑰花）。单个植株可以分离并种植至成熟¹⁰.这种自发的整株幼株再生过程可以轻易地用于水生红菌的遗传转化。

本文所述的优化管线通过利用其叶片脱落后的自发再生能力，实现了由农杆菌介导的高效可靠转化。为了简化转化物的选择，无需昂贵的无菌培养过程，采用了一种非侵入性的视觉选择标记RUBY，这是一种合成载体，包含三个基因，导致^β11的生物合成。通过优化细菌培养条件、接种步骤和叶片插条的孵育过程以实现再生，可靠的转基因水生红菌植物得以成熟。几乎所有R1-T1世代的初始转化体都表现出红色扇区，表明它们是异质的遗传拼接体。通过切除RUBY+红叶部分并重复再生过程，可以在后续R2-T1世代中生成完全红色的叶丛植株，从而近乎克隆的R. ahydratica转化株。该转化管线可轻松应用于引入/表达感兴趣的外源基因到R. aquatica中，从而加速杂叶和植物适应极端环境的分子遗传学研究。

方案

试剂和所用设备列于 材料表中。

1. 植物材料的制备

1. 切除并剪下成熟的健康叶片，切碎两个月大的成熟母株，叶片直径1-2厘米（见图1A）。
2. 在植物繁殖托盘（20 x 30厘米的永久巢托盘）上铺上两层高压灭菌折叠纸巾。用 无菌水浸湿纸巾，使表面有一层薄薄的水。
3. 将插枝朝上插入，并在每个植株周围留出空间以避免重叠（见图1A）。
4. 对插枝轻轻喷雾，并用保鲜膜紧紧包裹托盘。
5. 将托盘置于生长室中，温度为25°C至28°C，16小时光照，8小时暗，湿度为50 μmol/^m²/s。
6. 每周检查并维护干净、潮湿的繁殖托盘2-3次。
   1. 加入无菌水，保持在湿润的纸巾上保持一层薄薄的水。
   2. 更换失去粘附力和/或出现污染迹象（如水质明显混浊）的保鲜膜。
7. 使用微剪刀或手术刀，在建立后14-21天内，仔细切除再生且健康、具有枝条和根的单株玫瑰苗（见图1B）。
   注意：需仔细切除，才能获得完整枝条和根的单株玫瑰苗。 罗里帕 叶丛小株密集地分布在叶片外侧与中脉交汇处，这使得单片叶丛小苗的识别变得复杂。玫瑰叶小苗的枝条是逆向生长，而根系则生长在叶面以下，这使得整个叶序小苗的可见性变得复杂（见图1B）。
8. 将单个玫瑰花苗移植到含有湿润土壤介质（盆栽土：蓓石：珍珠岩的比例为2：1：1）并辅以缓释肥料的盆中（见图1B）。
9. 用自来水加0.25克/升颗粒NPK肥料，并用湿度罩或保鲜膜覆盖以保持湿润环境。
10. 在先验条件下（25°C-28°C，湿度下16小时光照和8小时黑暗，光强50 μmol/^{m 2}/s）将托盘放入生长室
    注意：保持土壤湿润条件至关重要。在盆栽植物下方保持一层薄薄的水。

2. 转化用 农杆菌 培养

1. Streak A. tumefaciens 菌株GV3101，携带含有 RUBY 载体的Ti质粒pMP90（pTiC58DT-DNA），载体为30毫升LB板上，该平板内含有利福平（0.03 mg/mL）、庆大霉素（0.025 mg/mL）和spectinomycin（0.05 mg/mL），在28°C下生长48-72小时，直至出现单菌落。
2. 选择单个菌落，接种5毫升MG/L汤，添加生物素和先前选择性抗生素（见表1），并在28°C旋转摇床中以200转/分钟培养16小时。
3. 将接种物转移到装有250 MG/L汤的锥形瓶中，在28°C的旋转摇篮中以200转/分钟培养16小时。
4. 使用分光光度计确保液体培养物的OD₆₀₀ 最低为1.2。在室温（约22°C）下，以3396 x g 离心沉淀细菌，浸泡10分钟。用200微米乙糖管（AS）改良接种液。
   注意：滤无菌AS的分量以DMSO制备，工作浓度为100 mM，并储存在-20°C。 接种汤应新鲜制作。AS会在离心步骤前直接添加，以最大程度减少降解。介质描述和组成部分列于 表1。
5. 避免直接扰动细菌沉淀，丢弃上清液，将沉淀重新悬浮于接种液中。
6. 用手旋转烧瓶，使溶液的OD₆₀₀ 约为0.8。
7. 在常温（约22°C）下，以90转/分钟的摇杆孵育接种物2.5小时。
8. 记录相关条件（培养和接种剂OD₆₀₀、AS浓度及表面活性剂数量、接种时间及转化效率所需的实验单元数量）。
   注意：最佳细菌浓度和悬浮培养浓度对于最大化转化效率、同时减少过度细菌生长至关重要。离心前，确保细菌培养物的OD600最低为1.2;再休眠至接种剂OD600为0.8。对诱导汤液的改良剂经过优化，以增强转化过程而不影响再生物的活性。推荐浓度为AS为150-225微米，界面活性剂为0.005%。
   注意：所有转基因细菌和植物应将它们放入指定的生物危害废物容器中。

3. R. aquatica 叶插的转化

1. 在接种物休眠培养期间，选择几株2个月龄、叶片健康且边缘完整的砧木。
2. 准备一个植物繁殖托盘（20 x 30厘米的永久巢托盘），用两层高压灭菌纸巾。折叠纸巾。用无菌水浸湿纸巾，使表面有一层薄薄的水。
   注意：建立一个负向对照托盘，未接种的外植植株在其中经历相同的环境条件。
3. 确保实验台配备100-500毫升ddH_2O、适合预期再悬浮接种量的无菌容器、微量移液器和吸头。
4. 在孵化阶段结束前，迅速从选定的砧木植株中从叶柄基部切除十片叶子。将植株放入带有无菌水的培养皿中。
   注意：使用新鲜切除的组织进行叶片接种非常重要，以避免叶片干燥。
5. 2.5小时后，将50微升界面活性剂移入1升的浮液溶液中（界面活性剂浓度0.005%），轻轻旋转瓶子混合（见图2A）。确保在接种后放置植株时，有繁殖托盘可供使用（图2B）。
6. 将叶片背面朝上放置，并沿中脉垂直切成1厘米长的切片（见图2C）。
7. 立即将新鲜切下的叶子放入适合旋转管搅拌机的50毫升管中，作为接种用的植株。
8. 将接种剂以一定体积倒入取材管中，使所有材料饱和，然后在室温下用旋转搅拌机搅拌10分钟进行接种（图2D，E）。
9. 用镊子将所有接种的叶片从溶液中取出，直接放入预备好的繁殖托盘中。
10. 将浸湿的植株分开并铺开，使其部分但不完全浸入浸湿纸巾表面薄水层中（图2F）。
    注意：保持无菌环境，避免接触农 杆菌 程序中使用的任何表面或工具，消毒前。
11. 用保鲜膜封好每个托盘，并在常温（22°C）下黑暗中孵育三天。
12. 暗期结束后，确保托盘用透明保鲜膜密封，并用ddH_2O补制托盘以保持湿度。
13. 将接种盘移至营养繁殖条件下的生长室。
    注意：将接种废物集中在废物容器中，使用10%漂白剂溶液处理，并按照生物安全指南进行处置。

4. 玫瑰花小苗再生及R1-T1世代的建立

1. 每周检查接种盘2-3次，确保环境干净湿润。
   1. 用挤压瓶加入ddH_2O。如果有，建议在重新密封托盘前用喷雾瓶喷雾去除植物。
   2. 通过更换失去粘附力或出现污染迹象（如水浊度）的保鲜膜来保持高湿度。
2. 目视检查再生的玫瑰花瓣幼苗，以确定移植适宜性特征。理想的再生剂会展现出完整的枝条，拥有多片叶片和至少2-3毫米长的根（见图2G）。
   注意：转基因玫瑰花序通常再生较慢，通常在放入生长室后21-28天达到移植适宜性。
3. 在与白日子克隆再生株相同的条件下，切除并移植完整的转基因玫瑰花丛幼苗。
4. （可选）记录再生转化体数量，并与其转化条件相关联以评估效率。
   注意：选购时请格外小心。转基因再生体通常体积较小，容易被忽视。用镊子仔细检查叶面的轴向和背向，以最大化产量并减少损伤。
5. 切除叶丛小苗，同时避免触碰任何转基因叶片。修剪转基因叶周围多余的叶片。每个盆栽移植一株植物。
6. 快速施肥、浇水并喷雾，并置于塑料罩下以保持湿度（见图2G，H）。
7. 给每株转基因幼苗做标记和记录。
8. 回归的移植植物含有转化株，但这些转化体缺乏枝条、根系，或看起来太小，无法移植到繁殖托盘进行持续筛选。当生长足够时，移植额外的转化剂。
9. 第一周每天喷雾和水移植。确保托盘里始终有水。
10. 移除并处理所有已衰老或不再表现出RUBY色素表达的移植。
    注意：根据机构生物安全法规，处理所有转基因材料。

5. 后续再生及近克隆R2-T1生成的建立

1. 当玫瑰丛小苗长成大型健康植株（2个月）后，切除单个幼苗中扩展的红 宝石表达叶片（见图2H）。
   注意：虽然表达 红宝石的叶片看起来均匀呈红色，但更常见的是嵌合体。这两种表型都适合繁殖。后续步骤采用标准的营养繁殖方法。
2. 将变形后的叶片分开，放入繁殖盘中。每个育苗托盘上应清晰标注对应的幼苗供体编号。
   注意：不要在同一托盘中混合多个幼苗的叶子。每株幼苗代表一个独特的转基因事件，必须作为独立的一代进行追踪。
3. 移植在繁殖后14-28天内再生了R2-T1植株。为每株植物分配一个新的标识符，反映其第二状态。移植后照常进行标准护理，如前所述（见图2I，J）。

结果

A . tumefaciens 转化的参数经过优化，成功生产表达 RUBY的转基因R . aquatica 植物，绕过了不育限制，同时利用其快速的无性再生速率（见图1 和 图2）。在接种叶片外植株并接受后续72小时暗处理后，再生幼苗在描述条件下2周内开始生长。在接种后3-5周内发现了具有嵌合体 RUBY 区块且体积足够可移植的再生幼苗（见图3），且其体积略小于那些未表达的玫瑰丛小苗。在对照野生型托盘上未发现RUBY再生幼苗，证实该现象与 R. aquatica 生理不同。细菌培养液类型、悬浮接种液类型、浸润方法和接种时间在转化物生成能力或速率上无显著差异（见表2 和表3）。积极影响转化效率的处理因子包括在叶片移植接种前提高AS浓度和生长素暴露处理。表面活性剂浓度升高对产率产生负面影响，并被认为不适用。

R 版本 4.4.2 12,13,14,15 用于对玫瑰丛小苗计数数据进行泊松一般线性混合模型（Poisson GLMM）分析。然而，在实验D（表2D）中，RUBY表达的再生剂被检测为15分钟接种并以150 μM AS或225 μM AS进行改良，模型因分散不足而违反了假设，因此采用了负二项式GLMM。

仔细研究了不同细菌汤液和培养条件对转化效率的影响。在五个实验复制中，使用米勒LB汤或转化特异性MG/L汤，转化体在几乎相同的参数下表达 RUBY 且效果无显著差异（见表2A）。从单个叶片中表达再生玫瑰花瓣幼苗的 RUBY 方法，每次处理包含15-60个外植株，使用LB和非MS培养液的实验（对照诱导汤， 表1）产生的再生剂从1.61±0.71个不等，而MG/L和优化诱导汤液实验中产出的3.23±1.13个再生剂。尽管差异不大，但由于主观观察，MG/L培养液和优化诱导汤液（见表1）被选为未来优化实验对象。

接着，我们测试了影响细菌负荷和分生组织获取能力的因素。在8个复制中（见表2B），接种的界面活性剂浓度增加0.01%的外植株一个月后表现出极大压力，导致再生体体积小且大多无法存活。这些复制体中似乎没有再生的转化体，尽管被淘汰的再生体表型为栗色、棕色和黄色色素，因此可能存在潜在的转化体。无论如何，再生剂的不可存性验证了维持表面活性剂浓度为0.005%的有效性。

比较了两种机制性技术——搅拌或真空渗透——在将所需DNA引入寄主植物时的效果。对照浸润法，即将外植株浸入50毫升再悬浮接种剂中，并在管状搅拌机中旋转，成功在上述处理中成功产生 了RUBY表达的再生剂。施加的真空渗透也产生了 RUBY表达的再生剂，但其转化效率与对照法无异（p = 0.478， 见表2D）。每个繁殖托盘大约观察到2-5个 RUBY表达的再生剂，无论是 通过 真空渗透还是物理搅拌接种。

改良后的乙酰胺酮（AS）细菌接种剂浓度在转化效率上明显不同。将AS浓度从150微米提高到225微米显著提高了表达 RUBY 的转基因移植株产量（p = 0.000309， 0.000458; 表3C，D）。四个实验中，每个处理包含一个托盘，内含40个相同处理的接种外植株。高浓度接种者平均含有近5个 RUBY 表达再生剂，而每个对照AS托盘仅有1个转化剂（见表3C）。此外，AS效应似乎与接种持续时间是分开的。

在三项15分钟接种周期的实验中，采用225微米AS修补的外植株，发现平均4.13 RUBY表达的再生剂为7.28±，明显高于150微米处理的2.03±1.32再生率（见表3D）。150 μM AS对照处理期间间隔无明显影响（p = 0.676），平均10分钟接种率为1.48±0.954，而15分钟接种中再生者为1.84±1.230人（见表3B）。同样，10分钟、225微米处理的接种剂每次处理可再生约5个 RUBY 表达的玫瑰苗，与15分钟接种剂处理中6-7个再生剂用于处理托盘无明显差异（见表3A）。

此外，植物激素生长素（促进植物再生）也进行了测试。在接种前将新鲜切除的叶片暴露于脉冲生长素处理下，明显对 RUBY 再生增加有积极效果，相较于ddH₂O的叶片（p = 0.00969， 表2C）。当置于ddH_2.0中，添加285微米吲哚-3-醋酸（IAA）时，植株每次处理平均转化率为6.67 ± 1.490，而无生长素处理则平均为2.00±0.816再生率。

立即再生的转基因系被指定为R1-T1世代（见图2），单个再生株作为系。所有最初的R1-T1玫瑰花结小苗均表现出 RUBY 表现为嵌合叶片，图案多样。最常见的是1-3片小叶表达明显嵌合体，其中 RUBY表达的和未表达的组织在中脉分化。大多数一个月大的R1-T1幼苗保持嵌合表达（见图3A），但也发现了少量完全表达 RUBY的幼苗。

从R1-T1幼苗叶片中无性繁殖的红宝石色素嵌合体区块（图3B）在切除后2-4周内再生了完全RUBY或嵌合体R1-T1玫瑰丛幼苗（见图3C）。一个月后，大多数R2-T1幼苗主要呈现红宝石叶片，部分幼苗显示出少量未表达的嵌合体区域（图3D，E）。

图1：营养繁殖方案及时间线。 代表性图片展示了用于再生无性玫瑰叶幼苗的生产管道。（A）从已建立的母株中摘取成熟、健康、完整的裂叶，并将其切成2-3片。（b）将植株放入繁殖托盘中并在指定条件下进行维护。3周后，玫瑰苗从外植苗中切除，移植到土壤介质中。下面是一张再生玫瑰花结仍附着在母叶插上的真实照片（粉色箭头）。这些幼苗处于移植的最佳阶段。比例尺：10毫米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：水 红树 叶插条的转化及表达 RUBY 转录本的转化体再生。 转化过程及转化再生体生产的图示概述。（A）获取细菌接种剂。（B）准备一个用无菌滤纸和水的繁殖托盘。（C）将叶子切成短片。（D）将植株浸入接种剂中。（E） 在旋转搅拌机中搅拌20r/1分钟，持续10分钟。（F） 将饱和的植株撒入托盘，覆盖塑料罩，并在黑暗条件下培养72小时。（G，H） 1个月后，从受 农杆菌暴露的植株中切除完整转化的再生体，并移植以建立成熟植株。（I，J）重复传播步骤（G，H），产生近克隆的R2-T1生成。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3： RUBY 转基因系的无性繁殖世代。 （A）成熟的R1-T1幼苗，表现出带有 RUBY 表达的嵌合叶片。比例尺：1厘米。（B）20株外植株中，有2株新鲜放入育苗盘，取自（A）中3个月龄幼苗。这些外植株表现出在脉脉分离的嵌合体状红宝石图案。比例尺：1厘米。（C） 移植前一个月再生的R2-T1玫瑰花结小苗，嵌合 RUBY 表达程度不一。再生的红宝石正根（马龙箭）。比例尺：移植后一个月显示的R2-T1幼苗，长2厘米（D），表现出 RUBY 表达。比例杆：2厘米（E）移植后3个月成熟的R2-T1幼苗，表现出小扇形（绿色箭头）。比例尺：2厘米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4：优化流水线的流程图。 请点击此处查看该图的放大版本。

表1：媒体表述 请点击此处下载此表。

表2：四个优化参数对水螳螂转化效率的影响。请点击此处下载此表格。

表3：接种乙糖磺氨酸浓度对水生红菌转化效率的影响。请点击此处下载此表格。

讨论

本研究建立了一种简单、直接再生的农杆菌介导稳定转化方法，R. aquatica是一种十字花科两栖植物，仅无性繁殖^10,16。尚未建立完整的营养繁殖两栖植物转化管线，水生红鹃的实际转化能力也未被通过视觉标记利用。值得注意的是，该管道不需要繁琐的无菌植物组织培养过程或专门的植物生长孵化器。因此，该协议可广泛应用于从科学研究实验室到课堂等多种实验环境。

在测试的不同接种和培养条件下，有几个因素显著提升了转化效率。值得注意的是，稍高的乙酰芠酮（AS）浓度以及吲哚-3-醋酸（IAA）浓度对转化效率有积极影响（见表1 和表2）。AS是一种酚类化合物，能吸引 农杆菌，已被证明能提升拟南芥¹⁷的植物转化效率。植物激素生长素在植物细胞重编程中起着关键作用。在伤口诱导再生过程中，生长素相关基因表达的快速增加被观察到¹⁰。因此，可以推测在植外接种过程中外源性施用生长素（IAA）能提高再生效率。但三项试验中观察到再生幼株数量的差异未被观察到（对照组为57 7.55 vs. 59.67 5.51）。因此，生长素处理可能有助于转化过程，而非再生本身。

一种非离子表面活性剂——氯氧基化三硅烷（称为Silwet L-77）， 通过 花^浸法3大幅提升拟南芥的转化效率，因此在植物生物学界被广泛使用。在用Silwet L-77改良后，植物胁迫极小，浓度为0.005%（推荐的花卉浸渍浓度）。当剂量加倍（0.01%）时， 水生红斑 叶片严重受损，几乎没有转化株的恢复（表2B）。在拟南芥花卉浸泡过程中，使用界面活性剂降低接种剂的表面张力，并增强花蕾的获取。相比之下，作为一种两栖植物， 水边红鹬 长出光滑的叶片，没有毛毛或厚实的角质^层5。表面活性剂增加会导致叶片组织损伤，表明应优先考虑除表面活性剂外的其他因素以实现非被毛叶组织的转化效率。表面活性剂更适用于被毛表型，有助于组织穿透。在积分所有测试参数后，提供了具有最优条件的流水线，作为流程图（见图4）。

视觉标记RUBY的使用对这一转型流程至关重要。RUBY是一种合成报告蛋白，编码三个编码基因（CYP76AD1、DODA和葡萄糖转移酶），合成一种鲜红色色素——甜菜白素¹¹。当观察到R1-T1再生体中的RUBY表达时，表现出红色扇区，表明它们很可能是嵌合体（见图2和图3）。一项先前研究显示，水面红菌的再生起源于切叶^第10段的维管形成层。引人注目的是，R1-T1再生体偶尔在中脉上呈现嵌合边界，叶片一半为红色，另一半为绿色（见图3A，B）。红宝石区的再生偶尔会长出全红的幼苗，根系为红色（见图3C，红色箭头），随后这些幼苗被培育成均匀红色的R2-T1植株（见图3D）。未观察到RUBY过度表达对R. aquatica生长和发育的不良影响（见图3）。支持方面，带有RUBY扇区的R1-T1玫瑰花结叶片的大小和形状未观察到明显差异（例如图3B）。任何强而有力的、由启动子驱动的转基因都可能干扰植物的正常生长和生理反应。

在某些情况下，这些“近克隆”的 红宝石 植株会发育出绿色扇区（见图3E，绿色箭头），暗示回归或转基因沉默。这表明，拥有像 RUBY 这样的可见标志物对于异位表达或沉默（如RNAi）对于未来分子机制研究中感兴趣的基因至关重要。可以将感兴趣的转基因引入 RUBY 盒，观察红色 RUBY 区的表型。总之，利用叶片剪断引起的直接重编程和非侵入性的可见标记，为营养繁殖十字花科R . aquatica优化了一条简单高效的转化流程。虽然这超出了本协议的范围，但未来对转化后 水生红菌 再生的确切起源的理解，或许能为植物细胞重编程提供见解。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1000 和微型;L 低滞留LTS过滤移液头	雷宁	30389213
醋糖磺胺酮	西格玛-奥尔德里奇	D134406-1G
双子酵母提取物，技术	费舍尔科学	DF0886-17-0
BD 巴克托阿加尔	费舍尔科学	214030
BD 迪夫科 LB 布罗斯，米勒	米德兰科学	DIFCO 244610
BD Bacto 脱水色蛋白	费舍尔科学	DF0123-17-3
生物素冻干粉	西格玛-奥尔德里奇	B4501-100MG
PermaNest托盘的透明穹顶	种植者的解决方案	GD221
透明塑料膜	托马斯科学	22-305654
粗蛭石	比克汀
二氢磷酸钾无水	西格玛-奥尔德里奇	105109
一次性培养皿 100 x 15 毫米	VWR国际	25384-342
D-甘露醇	西格玛-奥尔德里奇	M9546-250G
乙醇，200 proof。	费舍尔科学	04-355-720
Falcon 50 mL锥形离心管	费舍尔科学	14-432-22
折叠纸巾 9.3英寸x 10.5英寸	金伯利-克拉克	2920
GENESYS 30 可见光分光光度计	热力科学	840-277000
庆大霉素溶液	西格玛-奥尔德里奇	G1272-100ML
L-谷氨酸 一钠盐水合物	西格玛-奥尔德里奇	G1626-100G
氯化镁	西格玛-奥尔德里奇	M8266-100G
硫酸镁，七水合物	西格玛-奥尔德里奇	M9546-250G
MaxQ 6000 孵化器摇床	热力科学	SHKE6000
MES水合物	西格玛-奥尔德里奇	M8250-100G
村重和斯库格基底盐混合物（MS），粉末	西格玛-奥尔德里奇	M5524-50L
MX-RL-pro：旋转管旋转器	西洛格克斯	824222019999
肌醇	西格玛-奥尔德里奇	I7508-100G
珀西瓦尔生长室	珀西瓦尔	AR36L3
珍珠岩种植土壤添加剂	PVP工业	PVP105408
永久巢植托盘 8''x12''	VWR国际	470150-476
pH表 Seven Compact 5220	梅特勒·托莱多	30019028
受保护手术刀	费舍尔科学	02-688-79
利福平	西格玛-奥尔德里奇	R3501-5G
智能释放肥料植物肥料	奥斯莫科特	B0071CZTBA
氯化钠	费舍尔科学	S271-3
五水合二盐酸斯佩替霉素	西格玛-奥尔德里奇	S4014-5G
带泵式蒸汽器的喷瓶	托马斯科学	1141V43
方形3.5英寸GAGE电位器	种植者苗圃供应公司	03GA-0350S
蔗糖	西格玛-奥尔德里奇	S0389-5KG
Sunshine #4 专业种植混合土	Sun GRO 园艺	1341CFL0028P S
界面活性剂- Silwet L-77	费舍尔科学	NC1791615
真空除湿器	实验室仓库	55207
水溶性多用途植物饲料	奇迹-格罗	160101