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方法文章

使用LC-Mate实现高效液相色谱自动化分离：一种用于微量纯化的集成式重复自动进样器与组分收集系统

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DOI：

10.3791/69685

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2026年2月27日

 , 
1Natural Product Research Center, Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, 2University of Chinese Academy of Sciences

本文内容

摘要

开发了一种集成式自动进样器和组分收集器（LC-mate），用于自动化重复的高效液相色谱分离。LC-mate 可与输出模拟信号的高效液相色谱检测器兼容，能够提升手动操作系统的性能，并加快依赖高效液相色谱的研究工作流程。

摘要

高效液相色谱（HPLC）在高价值化合物的纯化中发挥着关键作用，满足了学术界和工业界化学与生物学领域日益增长的需求。然而，在微量纯化过程中，重复的手动进样和馏分收集显著限制了实验的效率与可重复性。为克服这一瓶颈，我们开发了一套集成式自动进样与馏分收集系统，暂命名为LC-mate，该系统通过直接响应HPLC检测器的模拟信号，实现重复性分离操作的自动化。该装置以高压六通切换阀用于样品进样，以选择阀用于馏分收集，其操作参数由 通过 直观的触摸屏界面。LC-mate 可与具备模拟信号输出功能的商用 HPLC 检测器兼容，并能通过同步信号触发实现梯度洗脱模式的重复分离。示范实验验证了该系统在天然产物纯化中的稳定运行和可重复的分离效果，显著减少了人工操作时间。该系统为提升常规 HPLC 工作流程的自动化水平提供了实用且易于获取的解决方案，填补了手动操作与全自动纯化系统之间的空白。

引言

色谱法由 M.S. Tswett 于 20 世纪初首创，随着仪器技术的进步，于 20 世纪 60 年代发展为现代高效液相色谱法（HPLC）1,2,3。

如今，高效液相色谱（HPLC）在高价值化合物的纯化中发挥着关键作用，满足了生物医学、化学和生物学领域在学术界与工业界日益增长的需求。在学术研究中，天然产物的微量纯化以及手性分子的拆分高度依赖于半制备型HPLC技术4,5,6,7,8。在大多数实际情况下，研究人员通常一次仅将部分样品溶液注入HPLC色谱柱，而非全部样品，以避免不可预见的样品损失或受限于色谱柱尺寸，这使得重复进样和组分收集不可避免。尽管HPLC具有卓越的分离能力，但其在样品纯化中的应用仍受到当前仪器设备和工作流程固有局限性的制约。其中一个主要瓶颈在于对人工操作的高度依赖，特别是在样品进样和组分收集环节。这些过程不仅耗时且劳动强度大，还容易引入人为误差，从而影响通量、重复性以及整体操作效率9,10。

主要的高效液相色谱（HPLC）制造商（如安捷伦、岛津和沃特世）提供的商用自动进样器和组分收集器可实现可靠且精确的自动化操作，但通常受限于其专有的硬件和软件生态系统。例如，安捷伦1260 Infinity II自动进样器与G1364F组分收集器可无缝集成于安捷伦的HPLC系统中，具有出色的重现性，但跨平台兼容性有限。类似地，岛津SIL-20A/40C自动进样器和FRC-40/FRC-10A组分收集器具备高通量和优异的机械精度，但仍依赖于岛津LC-20和Nexera控制架构。沃特世Alliance HPLC自动进样器和组分收集器III模块同样提供稳定的性能和灵活的收集模式（最高达300 mL/min），但仅适用于沃特世专有的超高效液相色谱（UHPLC）和液相色谱-质谱（LC-MS）环境。此外，依赖进样针的传统自动进样器可能降低样品回收率，而基于试管的组分收集器在处理大量洗脱液体积时可能操作不便。对于大多数其他HPLC仪器而言，半制备级分离仍依赖繁琐重复的手动操作。

这些挑战凸显了在高效液相色谱（HPLC）工作流程中实现样品纯化自动化的创新方法的必要性。为满足这一需求，我们开发了LC-mate，这是一种紧凑且多功能的仪器，将自动进样器和组分收集模块集成于单一平台。LC-mate的流体核心由两个关键部件组成：一个由SUS 316不锈钢制成的耐高压六通切换阀（SKVA-3130-S），其流路直径为0.4 mm，可承受最高45 MPa的工作压力，适用于精确控制样品注入；以及一个10通道多位选择阀，具有极小的死体积（端口间27.5 µL，转子槽5 µL），流道直径为1.2 mm，可实现高效的组分收集。该设计最大限度地减少了死体积，并降低了交叉污染的风险。有关仪器的详细规格，请参见 表1LC-mate 可接收来自 HPLC 检测器的模拟输出信号，并触发 HPLC 仪器 通过 同步信号，可独立控制样品注入和组分收集。

表1：LC-伴侣相关仪器参数。 请点击此处下载该表格。

该仪器配备有用户友好的控制软件和直观的触摸屏界面，可实时可视化模拟色谱信号。LC-mate 支持等度和梯度两种分离模式，用户可设置关键参数——包括进样体积、重复次数、每次进样的间隔时间以及收集模式［基于阈值、基于时间或全部收集（收集阈值上下方的所有组分）］，并可通过单条指令启动完全自动化的操作。这消除了重复性人工干预的需要，显著提高了高效液相色谱纯化的效率。

图1 展示了与高效液相色谱系统集成的LC-mate的整体外观、工作原理和配置。补充视频1 提供了其操作原理的演示。

用于蛋白质纯化分析的高效液相色谱（HPLC）系统示意图。
图1：LC-mate 系统的设计与装置。（A）示意图布局。（B）仪器结构图。（C）实际装置照片。（D）紫外检测器与 LC-mate 之间信号传输线的连接方式。请点击此处查看此图的放大版本。

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方案

1. 检查连接

  1. 检查高效液相色谱仪（HPLC）、LC-mate 和色谱柱之间的溶剂管路连接，以确保流路正确（图1A）。
  2. 检查紫外检测器与 LC-mate 之间信号传输线的连接，如 图1D 所示。
    1. 将黑线连接至红色端子，白线连接至黑色端子，以匹配模拟信号输出的极性。
    2. 观察 LC-mate 显示屏。若出现模拟信号波形，则连接正确。
      注意：若未见波形，请反向连接：将黑线接至黑色端子，白线接至红色端子。
  3. 检查紫外检测器与 LC-mate 之间的触发连接。
    1. 将数据线的单端插入紫外检测器的输出端口。
    2. 将另一端的黑线和白线分别连接至 LC-mate 上的蓝色和黑色触发端子。
    3. 拧紧端子和触发线，确保连接牢固。

2. 集成分离系统的启动

  1. 确保高效液相色谱仪（HPLC）正确启动。
  2. 确保 LC-mate 正确启动。
    1. 启动 LC-mate 系统后，单击界面上的 LC-mate 图标，以自动执行系统自检程序并初始化关键硬件模块。
    2. 自检完成后，等待短暂的 Di 提示音（约 0.5 秒）以及屏幕上“自检中”提示消失，表明初始化已完成。

3. 条件优化

  1. 配置高效液相色谱分离条件，并开始洗脱以实现色谱柱平衡。
  2. 点击 LC-mate 屏幕左侧的 Test 图标，屏幕将显示如下界面（图 2A）。输入进样体积、洗脱时间和重复次数参数，然后按下Start图标；自动进样器、组分收集器和高效液相色谱系统将开始运行。在此情况下，洗脱液仅从选择阀的 10 号端口流出，可手动收集或弃去。
  3. 确定可行的分离条件，包括分离度、运行时间、保留时间、进样体积和紫外检测波长等，以便在合适模式下进行后续的分离和组分收集。

4. 自动运行

注意：根据可行分离条件的色谱图，可选择合适的组分收集方式 阈值，时间采集，以及 收集全部 界面左侧的选项。

  1. 基于阈值的组分收集
    1. 在界面左侧选择阈值功能模块，系统将显示参数设置界面，如图2B所示。
    2. 输入进样体积、重复次数、阈值和洗脱时间，然后按下开始按钮；HPLC和LC-mate将自动运行。色谱峰超过阈值的组分将被收集到不同的收集瓶中。
    3. 监控显示屏上垂直排列的状态指示：观察正在进样以确认样品引入已启动；检查正在分离以确认色谱分离正在进行；注意“注射器排空”以识别注射器何时正在排出残留液体；注意相应文字是否高亮显示为蓝色，以确认当前处于何种操作状态。
      注：在分离过程中，按下“色谱图”图标将在新界面中显示色谱图和阈值线，该色谱图与控制HPLC的计算机屏幕上的色谱图一致。
  2. 基于时间段的组分收集
    1. 在界面左侧选择定时收集模块，以打开参数设置菜单（图2C）。
    2. 输入所需参数：进样体积、重复次数、洗脱时间以及所需的一系列收集时间。
    3. 按下开始按钮以启动自动化流程，随后HPLC系统和LC-mate将根据设定参数重复运行。
  3. 使用“全部收集”模式进行组分收集
    1. 在界面左侧选择全部收集功能模块，系统将显示参数设置界面，如图2D所示。
    2. 设置一个收集阈值，高于或低于该阈值的色谱峰均会被分别收集，从而确保混合物中的任何化合物都不会丢失。
      注：乙腈是一种易燃且有毒的溶剂。所有涉及乙腈或其他有机溶剂的操作必须在通风良好的实验室内进行。操作人员必须始终佩戴适当的个人防护装备（PPE），包括防化学飞溅护目镜和耐溶剂手套。废弃的乙腈及其他有机溶剂必须收集在指定的、正确标识的危险化学品废物容器中，并由有资质的处置服务机构按照本机构的环境健康与安全规程进行处理。

5. 管道清洗

注意：清洗管路可确保使用自动进样器时，管路中无残留样品。

  1. 准备一小瓶洁净的溶剂，并将自动进样器的进样管路插入溶剂中。
  2. 从左侧界面选择 清洗 模块，以打开参数设置菜单（图 2E）。
  3. 进样管路的清洗
    1. 将 进样体积 设置在 0–1000 之间，并设置 重复次数（无限制）。
    2. 点击“清洗完成”下方的 清洗 按钮，以启动进样管路的清洗程序。
    3. 监控“循环”计数，以跟踪已完成的清洗循环次数。
  4. 收集管路的清洗
    1. 设置 清洗时间（无限制）。
    2. 点击“当前管路”下方的 清洗 按钮，以启动收集管路的清洗程序。
    3. 监控 当前管路 显示，以确认正在清洗的管路，系统将按顺序从管路 0 到管路 10 依次处理。

色谱系统示意图；进样体积、重复时间、洗脱过程控制设置。
图2：LC-mate 触摸屏界面用于方法操作。（A）优化界面。（B）阈值模式。（C）定时模式。（D）全收集模式。（E）管路清洗。（F）设置。请点击此处查看此图的放大版本。

6. 数据保存说明

  1. 启用自动保存功能。系统会在每次洗脱循环完成后自动保存色谱图。
  2. 执行手动保存。洗脱完成后，点击 保存 按钮。在弹出的对话框中输入所需的元数据以保存文件。
  3. 选择存储位置。可选择将文件保存至设备的本地存储、SD 卡或外部 USB 驱动器。
    注意：建议使用外部 USB 驱动器存储所有数据，以避免容量限制，并确保数据访问便捷。

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结果

2"-O-没食子酰基异槲皮苷的纯化
2"-O-没食子酰基异槲皮苷（2-GH）是中药泽漆（Euphorbia helioscopia L.）中一种主要的水溶性成分，该药材具有悠久的化痰祛湿应用历史11。其化学结构见图3。最近研究发现，2-GH在动物模型中具有抗纤维化作用12。为获得足量高纯度的2-GH样品以开展进一步的药理学研究，采用LC-mate辅助的半制备型高效液相色谱（HPLC）进行分离。具体分离参数如下：

色谱柱：Sharpsil C18，150 × 30 mm，10 µm；流动相：等度洗脱，乙腈-水（25%），流速 15 mL/min；进样体积：200 µL；洗脱时间：20 min；重复次数：20；采用阈值收集模式。结果如

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讨论

这些结果表明，LC-mate 系统能够根据设定参数自主完成连续的样品进样和馏分收集，从而显著减少人工干预，提高分离效率。该系统具有用户友好的界面，仅需初始的硬件设置，随后即可通过直观的触摸屏操作运行。

为确保实验成功，需关注三个关键方面。首先，必须正确连接高效液相色谱检测器与 LC-mate 之间的模拟信号线和触发线缆（详见方案步骤 1.2.2），以实现信号的准确显示和基于峰信号的可靠馏分收集。其次，应优化色谱条件（方案步骤 3），以获得理想的分离度，并确保保留时间、峰形和信号强度均处于合适状态。最后，应根据优化后的色谱图选择合适的馏分收集模式。“阈值”模式适用于具有显著吸收信号的化合物收集。“定时收集”模式依赖于高效液相色谱泵的稳定运行，可用于具有或不具有显著吸收信号的化合物收集。而“收集 全部”模式虽也依赖于设定阈值，但可用于分离主要组分与次要组分，并避免珍贵样品的损失。

从技术角度来看，该系统的设计解决了现有商业产品的特定不足。简化的自动进样器避免了传统针式自动进样器相关的死体积问题，从而提高了珍贵样品的回收率...

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披露

赵卫民提出了LC-mate的设计方案，该方案由上海比然医疗科技有限公司的工程师实施。该仪器的专利由上海比然医疗科技有限公司和中国科学院上海药物研究所共同持有。

致谢

作者衷心感谢上海倍特润医疗科技有限公司为将解放化学家繁琐的高效液相色谱手动操作这一构想变为现实所提供的所有支持，同时感谢沃特世材料公司何旭红先生对LC-mate重复性的测试。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
高效液相色谱仪-EasySep-1050上海同为分析技术有限公司。EasySep 仪器网页®-1050 https://www.instrument.com.cn/netshow/sh100522/C140238.htm1009992一种在本方案中使用的模块化制备型高效液相色谱系统。该系统包括溶剂输送泵、紫外/可见光检测器和手动进样阀。该系统构成LC-mate自动化系统的核心分离单元。
（液相色谱柱）Sharpsil-U C18 150 mm（L） × 30 mm（内径）S-10 µ米，100安培上海轩美工业发展有限公司U180110-300150反相C18色谱柱，粒径为10 μ米，孔径为100 Å它专为分离小分子（如药物、有机化合物）而设计，具有良好的重现性和稳定性。该色谱柱尺寸（150 mm 长，30 mm 内径）适用于制备型或半制备型色谱。
LC-mate上海贝特瑞医疗科技有限公司。如有任何咨询，请联系  仪器LC-mate，请联系通讯作者，邮箱：wmzhao@simm.ac.cn GD202200337液相色谱系统的辅助设备，可能用于样品进样、流动相管理或数据采集。可与高效液相色谱（HPLC）系统集成，以提高实验过程的自动化程度和效率

参考文献

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