医用水蛭中的局部RNA干扰与异位基因表达

摘要

在本视频中，我们展示了一种利用新型微型基因枪将试剂精确递送至活体组织的生物弹道递送方法。我们通过将双链RNA分子递送至单个节段的腹侧体壁和神经节，实现对水蛭胚胎中轴突导向分子Netrin表达的敲低。

摘要

在本视频中，我们展示了使用气动毛细管枪将试剂精确地通过基因枪法递送至活体组织中的方法。我们利用该方法干扰蛭类胚胎特定节段的基因表达模式，而未处理的节段则作为内部对照。

气动毛细管枪可用于在不打开样本的情况下，到达发育早期阶段的内部细胞层。作为一种将物质局部导入活体组织的方法，该枪具有的基因枪递送技术具有多个优势：操作快速、无需接触且无损。此外，同一支毛细管枪可用于独立递送不同物质。递送区域的横向尺寸约为50–150 µm，沿平均穿透深度周围延伸约15 µm，平均穿透深度可在0至50 µm范围内调节。该递送技术的优势在于，能够在选定位置实现有限数量细胞的靶向处理，其范围介于通过显微注射实现的单细胞敲低与通过细胞外注射或遗传学方法实现的系统性敲低之间。

为了敲低或敲入轴突导向分子Netrin的表达（该分子天然表达于某些中枢神经元和腹侧体壁，但在背侧区域不表达），我们将dsRNA或质粒DNA分子递送至体壁和中枢神经节。该操作程序包括以下步骤：（i）针对特定实验准备实验装置（调节加速压力），（ii）用dsRNA或DNA分子包被微粒，（iii）将包被的微粒装入基因枪中，每次实验最多可装载两种试剂，（iv）准备用于微粒递送的动物样本，（v）将包被的微粒递送至靶组织（体壁或神经节），以及（vi）对胚胎进行后续处理（免疫染色、免疫组织化学和神经元标记），以观察实验结果，通常在递送后2至3天进行。

当颗粒包被 netrin dsRNA 时，会导致 netrin 表达出现明显可见的敲低，且仅发生在含有颗粒的细胞中（通常每个细胞含有 1-2 个颗粒）。当包被编码 EGFP 质粒的颗粒停留在神经元细胞核内时，可诱导细胞产生荧光。

方案

颗粒可以用不同的试剂进行包被，例如双链RNA分子、DNA质粒或染料。颗粒的类型和直径需根据所用试剂以及组织中靶细胞的深度来选择：较大的颗粒穿透更深，但可能会对组织造成一定损伤。

1. 制备包被dsRNA的微粒

1. 将100%异丙醇置于冰上。
2. 用100 µl结合缓冲液重悬5 mg金颗粒（S1600ri，Seashell Technology, LLC；平均直径1.6 µm）。溶液准备好后，继续下一步操作。
3. 加入100 µl结合缓冲液稀释颗粒溶液，短暂涡旋，并超声处理1–2分钟以避免结块。
4. 加入5–10 µg dsRNA/siRNA（dsRNA/siRNA应溶于水，浓度约为1 µg/µl）。
5. 涡旋混匀，在室温下静置2分钟。此浓度和孵育时间可使siRNA充分结合金颗粒。
6. 在台式离心机中以约2,500 rpm离心约15秒，沉淀siRNA/金颗粒复合物。
7. 弃去上清液，轻轻加入750 µl冷的异丙醇，尽量避免扰动沉淀。短暂离心后弃去上清液。
8. 用100 µl冷的100%异丙醇重悬金颗粒，然后在水浴超声仪中短暂超声（2–3次脉冲）以分散颗粒团聚。最后，将悬浮液倒入玻璃载片上，室温下自然干燥。

2. 为特定检测准备实验装置

1. 每种基因枪的喷嘴孔径直径各不相同，范围从最小约50µm到最大约3mm。因此，应根据靶向组织区域的大小选择合适的基因枪。
2. 氦气压力需根据靶细胞在组织中的深度进行调节，通常适用于深度达约100µm的细胞（较高的压力可使微粒穿透更深）。胚胎与喷嘴尖端之间的距离也会影响微粒的穿透深度，因为金微粒在空气中会损失动量。

3. 用预包被的微粒装载基因枪

应将颗粒以干燥粉末形式装入连接至多通阀的特氟龙颗粒注射管路中。该管路在不使用时应保存在4°C的干燥环境中，且可在使用相同试剂的后续实验中重复使用。我们的实验装置可通过多通阀中的不同端口，在每次检测中输送最多两种不同的试剂。

1. 在将干燥的包被颗粒装入Tygon管路之前，使用玻璃盖玻片边缘或刀片从载玻片上刮取颗粒。该Tygon管路仅专用于此试剂，以避免交叉污染。
2. 装入颗粒时，将管路靠近连接器处弯成U形，以防止颗粒分散至整段管路，使其集中于连接器附近。使用小刮勺或折叠的称量纸取样，每批胚胎装入约一半的颗粒。在装样过程中轻敲管路，使颗粒均匀分布。

4. 动物准备

在金颗粒递送前后，胚胎均需保存在室温下的无菌人工池水中。

1. 将胚胎腹侧朝上放置于一块平整的、5毫米厚的硅橡胶（Sylgard 184，Dow Corning，Midland，MI）上刻出的沟槽中，并用含8%乙醇的无菌人工池水溶液进行麻醉（E6-E8阶段的较年轻胚胎可在整个实验过程中保持在不含乙醇的人工池水中）。
2. 在射击微粒前，立即通过移除部分溶液降低浴液液面，以暴露胚胎的腹面。在其上方覆盖一张中间剪有小孔的滤纸，以固定胚胎并防止其表面干燥。

5. 将包被颗粒递送至目标组织

通常，一批颗粒可用于最多十次轰击，单次轰击一般可递送数百个颗粒。

1. 打开其中一个阀门 0.3 秒以产生一次射击，使相应管路中的一团颗粒注入基因枪内。
2. 在每次射击之间轻轻敲击管路，使附着在管壁上的颗粒脱落，从而促进其进入基因枪的氦气流中。
3. 为了覆盖目标组织区域，可能需要进行多次射击。
4. 颗粒递送完成后，将胚胎放回人工池水中，最好将每个胚胎单独放置于多孔板中的一个孔内。

6. 免疫染色与神经元标记

在颗粒递送后，将胚胎置于室温及避光条件下培养1至3天，直至实现RNA干扰（或异位表达）。随后，对实验组样本和对照组进行以下任一操作：

1. 原位杂交检测Netrin mRNA的存在与否。将地高辛标记的蛭类netrin核糖探针与完整的蛭类胚胎进行杂交。
2. 免疫细胞化学染色检测Netrin蛋白以及其他神经组织特异性蛋白（如抗乙酰化微管蛋白）。该操作同样在整体胚胎上进行。
3. 脂溶性染料的显微注射（DiI和DiO）至单个神经元内，通过染料填充标记处理组和对照组节段中目标神经元（本研究中为机械感受性压觉神经元）的完整分支结构。该检测在活体胚胎（完整或解剖后）上进行。

讨论

在本实验中，我们使用气动毛细管枪将金颗粒递送至活体医用水蛭胚胎的局部微小区域，以实现基因的敲入和敲除。靶向区域的直径通常约为 150 µm，颗粒分布于平均穿透深度周围约 15 µm 范围内，穿透深度可在 0 至 50 µm 范围内调节。当金颗粒表面包被轴突导向因子 netrin 的双链 RNA（dsRNA）分子时，可导致 netrin 表达显著下调，且该效应仅出现在含有颗粒的细胞中。当颗粒包被编码绿色荧光蛋白（GFP）的质粒时，一旦颗粒进入神经元细胞核，即可诱导细胞产生荧光信号。

我们向您展示了气动毛细管枪如何为基因枪递送技术赋予新的能力，即能够在三维空间内精确定位组织中的微观区域，实现高精度靶向，且不会对组织造成可检测到的损伤。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
金颗粒	其他	Seashell Technology, LLC	S1600ri
结合缓冲液	试剂	Seashell Technology, LLC
硅橡胶	试剂	Dow Corning	Sylgard 184