通过光流体分析评估嵌合抗原受体T细胞的多模态功能，以单细胞分辨率

Summary

利用CAR-T细胞的过继性T细胞疗法在治疗血癌方面展现出希望，尽管持久的反应尚不稳定。多功能T细胞与缓解耐久性相关，但标准检测方法模糊了关键亚群。我们提出了利用光流控平台的单细胞工作流程，用于识别和分离高功能的CAR-T细胞，供进一步研究。

Abstract

过继T细胞疗法是一种新型治疗范式，在体 外扩殖 和重新输注患者体内之前，通过基因改造自身T细胞表达靶向肿瘤的嵌合抗原受体（CAR）。尽管晚期血液恶性肿瘤患者表现出显著的抗肿瘤效力，但大量病例未能显著出现持久反应。尽管临床结局的变异性可能有多种特殊因素，但越来越多的证据表明，输注前CAR-T细胞产品中多功能T细胞的比例与癌症缓解的持久性高度相关。遗憾的是，目前CAR-T细胞产品的标准评估依赖于整体种群测量或终端检测，限制了分离和研究具有高功能特性亚群体的能力。本研究展示了利用光流控平台评估单个CAR-T细胞的细胞因子分泌谱及CD137表达激活的工作流程，可选择性地结合细胞毒性活性评估。表现出最大多模态功能的细胞可以被分离出来，用于进一步分析，为下一代CAR-T细胞疗法的设计提供参考。

Introduction

嵌合抗原受体（CAR）表达的T细胞在晚期血液恶性肿瘤患者中表现出显著的抗肿瘤效力^1,2。然而，治疗患者中有相当一部分最终会复发，这凸显了开发功能持久性更高的CAR-T细胞产品的需求 ^3,4,5,6。尽管许多特殊因素可能导致临床结局的变异，但越来越多的证据表明，输注前CAR-T细胞产品中多功能T细胞的比例与癌症缓解的持久性高度相关。因此，富集或工程化具有更高多功能性的CAR-T细胞的策略，可能产生具有更强介导长期临床反应潜力的治疗产品 ^6,7,8。遗憾的是，目前表征CAR-T细胞功能的方法主要依赖于整体种群测量或终端检测。这些限制了分离和研究具有高度多功能特性的特定亚群体的能力。例如，细胞因子分泌通常通过大量上清液或细胞内染色来评估。后者需要细胞固定，以换取单细胞层^级9的信息。同样，细胞毒性潜能通常通过量化T细胞/靶细胞^共培养后目标细胞存活力的丧失来评估。能够以单细胞分辨率评估可存活CAR-T细胞的细胞因子分泌、激活和细胞溶解活性，有望推动具有更持久抗肿瘤疗效的治疗产品开发。

本文介绍了一种通过光流控单细胞平台同时对单个CAR-T细胞进行多模态功能剖析的方法（见图1）。该系统利用光电定位（OEP）将细胞因子捕获珠和单个细胞移动到空间隔离的笔中，从而实现单个CAR-T细胞的功能评估（见图2A）。在本方案中，我们展示了通过非病毒基因转移生成CAR-T细胞的工作流程，并评估单个CAR-T细胞在与抗原表达和抗原阴性靶细胞共培养过程中通过CD137的细胞因子分泌和激活（见图3 和 图4）¹¹。通过比较标准CAR-T细胞与c-Jun过^{表达细胞，}展示了区分修饰细胞产物间细胞因子和激活特征的潜力。也可以通过光流控平台上的半胱天冬酶或荧光读数评估对单靶细胞的细胞毒性活性（见图2B）。然而，需要时间流逝分析来确定交互动力学，而交互动力学在每个CAR构造和实验中可能有显著差异。同样，模仿慢性刺激的重复杀死实验需要替代工作流程。因此，本文介绍了进行细胞毒性评估的基本程序，但不讨论其详细应用。

根据所选评估和目标特性，表现出最高多模态功能的活CAR-T细胞可从仪器卸载，转移到96孔板中的单个孔中进行进一步研究（见图2C）。

Protocol

注意：缓冲液和培养基制备详见 表1。

1. 从白细胞还原系统锥细胞中分离出CD8 T细胞

注意：所有步骤均在组织培养生物安全柜中使用无菌无菌技术完成。所有稀释、洗涤和再悬浮液的培养基应在整个过程中保持在4°C。

1. 在两根50毫升锥形管（分离管）中各加入15毫升细胞分离培养基（密度1.077 g/mL）。
2. 将白细胞还原系统（LRS）锥形（锥形朝下）放在一个未盖盖的50毫升锥形管上。用消毒剪刀剪断延伸至LRS锥体下方的塑料管。将LRS锥体放在打开的50毫升锥形管上，然后切开上面的塑料管。在50毫升锥形管内收集约8-10毫升血液。
3. 将50毫升锥形管注入PBS+EDTA（按培养基和缓冲液清单准备），并用移液器混合稀释后的血液。将稀释的血液平均分配到两个分离管之间。
4. 在室温下，用稀释血液以750 x g 离心15分钟，9分钟为加速，2为减速。
5. 使用10毫升血清学移液管，仔细采集并转移每个分离管的淡黄层至新的50毫升锥形管中。
6. 将每个50毫升锥形管填充至40毫升，注入PBS+EDTA并重新悬浮，获得单细胞懸浮液。将单细胞悬浮液以300 x g 离心，4°C离心10分钟。 抽吸上清液。
7. 将细胞沉淀重新悬浮，并结合于40毫升PBS+EDTA中。将单细胞悬浮液以300 x g 离心，4°C离心10分钟。 抽吸上清液。
8. 将细胞沉淀重新悬浮于PBS+EDTA中，并通过Trypan Blue染色确定外周血单核细胞（PBMC）悬浮液的活细胞密度。
   注意：Trypan Blue是一种活细胞不透水染料，用于染色DNA。因此，活的PBMC和非核细胞（即红细胞）都将保持不染色。在确定可存活的PBMC密度时，排除小细胞（如红细胞）非常重要。
9. 将所需数量的PBMC转移到新的50 mL锥形管中，以磁富集CD8⁺ T细胞。估算所需CD8⁺ T细胞数量的10倍，作为磁富集所需的PBMC起始数量。在手术过程中保持试剂冷却。
10. 将PBMC单元悬浮液以300 x g 离心，4°C下离心10分钟。 抽吸上清液。将细胞沉淀重新悬浮于40微升MACS缓冲液中（按培养基和缓冲液列表中准备），每1 x 10⁷ 个细胞。
11. 每10个⁷个细胞加入10微升CD8⁺ T细胞生物素抗抗体鸡尾酒。通过移液法混合，并在4°C下培养5分钟。
12. 每1 x 10⁷单元添加30微升MACS缓冲液。每1 x 10⁷个细胞加入20微升CD8⁺ T细胞微珠。通过移液法混合，并在4°C下培养10分钟。
13. 将预冷的软管柱放在磁铁上。在下面放置一个15毫升的锥形管，收集液体流动。用3毫升MACS缓冲液平衡每根LS柱。
14. 使用与收集管相同的15 mL锥形管，将细胞悬浮液施加在平衡的LS柱上。用1毫升MACS缓冲液清洗柱3次。让每1毫升洗涤液完全通过LS柱后再进行下一次洗涤。
15. 仔细将收集的细胞重新悬浮，并通过锥蓝染色确定富集CD8⁺ T细胞悬浮液的活细胞密度。

2. 基于珠子的CD8⁺ T细胞活化

1. 计算达到1：1T细胞与DNA珠子比例所需的人类CD3/CD28珠数。活化弹珠库存含有每25微升1 x 10⁶ 颗珠子。
2. 在将计算出的珠子悬浮液转移到15毫升锥形管上之前，轻柔地使活化珠旋转至少30秒。加入等量的介质，洗珠子并进行漩涡至少5秒。
3. 将15毫升锥形管放入相应的磁铁中，1分钟以收集管侧的珠子。抽吸并丢弃上清液。
4. 计算最终T细胞浓度为1 x 10⁶ T细胞/mL所需的培养基体积。将15毫升锥形管从磁铁中取出，并重新悬浮在计算出的培养液中。将重组人IL-2加入最终浓度50 U/mL。
5. 将完全补充的培养基转移到含有T细胞的管子并重新悬浮。将细胞悬浮液种种成合适的培养形式（例如，48孔板1毫升，24孔板2毫升），并培养40小时。

3. 通过非病毒基因转移通过核激化生成CAR-T细胞

注意：培养基（37°C）、试剂（RT）和离心机（RT）的预热对于提供高基因转移效率至关重要。

1. 准备并标记48孔板，内含1毫升细胞培养基，针对每种核接凝条件。培养盘至少30分钟，以提供温热且_CO2调整的培养基，具有生理pH值。
2. 打开核界面，选择16孔带内要核分离的位置。选择合适的项目（例如，FI-115以提升效率，EO-115以提升可行性）。
3. 将含有T细胞的培养板从培养箱取出，用显微镜检查细胞的视觉外观，以初步判断活化是否成功。成功活化的T细胞应表现出均匀聚集和细胞形态。介质颜色与新鲜介质不同，转为略带橙色调，表明激活导致新陈代谢状态更活跃，被认为是好迹象。此时，对早期激活标志物CD25和CD69进行流式细胞计分析可以验证激活效果。
4. 重新休眠、采集并计数激活的T细胞。计算每种条件下需要1.2到2个^10个6 个T细胞。将计算出的体积转移到一个新的15毫升锥形管子上，离心机在200 x g 下离心10分钟，RT处理。
5. 抽取并丢弃上清液，并用10毫升温热的PBS清洗T细胞。在200 x g 下离心10分钟，RT温度。利用离心时间解冻编码CAR的质粒，通常含有1 μg/μL的DNA浓度。在单个无DNA酶1.5 mL微离心管中，将转座酶编码质粒（SB100x）或微圈（0.5 μg）与CAR编码质粒（1.0 μg）或微圈（0.6 μg）一起组装，采用每个核点接触条件下。
6. 准备足够量的P3核控液加补充剂（按条件：16.4微升核光液+3.6微升补充剂）。
7. 将装有T细胞的15毫升锥形管取出离心机，抽取上清液，并用离心机在200 x g下进行1分钟，以收集底部残留液体。用200微升的移液器小心去除尽可能多的缓冲液，同时不接触细胞沉淀。
8. 立即根据条件，将T细胞沉淀重新悬浮于20微升P3缓冲液中（材料清单所示）。将20微升细胞悬浮液在P3缓冲液中转移到含有相应构造物的1.5毫升微离心管，轻柔混合且不引入空气，然后将细胞悬浮液转移到16孔核渗透条带。轻轻敲击，将井底的空气排出。
9. 将16孔条带放入4维核光器系统，开始核光检测程序。成功核化后，屏幕上应显示每个选定井的绿色叉。
10. 立即加入预热培养基100微升，从准备好的48孔培养基中取出，然后将16孔试纸条放入培养箱中孵育10分钟。
11. 小心地重新悬浮2到3次，将细胞悬浮液转移到准备好的48孔板中，然后放回培养箱。
12. 4-5小时后，小心从每个孔中取出500微升，并小心加入500微升新鲜预热培养基，并补充50 U/mL的重组人IL-2。
13. 每隔一天定期更换培养基以扩大细胞，保持细胞密度在0.5到2 x 10^{6 T细胞} /mL之间。
14. 第6天取出CD3/CD28激活珠。通过轻柔地重新悬浮10次，并将细胞悬浮液转移到15毫升锥形管中，收集T细胞。将15毫升锥形管放入相应磁铁中，放置1分钟。
15. 抽取细胞悬浮液，转移到新鲜培养板，并用添加IL-2的新鲜培养基喂养细胞，最终浓度为50 U/mL。磁珠应保持在磁铁内剩余的15毫升锥形管侧壁可见。
16. 第7天通过流式细胞术分析相关CAR或替代标记表达，分析基因转移效率，随后在第8天进行转基因阳性CAR T细胞的磁分选（补充 图1中的门控策略）。

4. 转基因阳性T细胞的磁富集

注意：所有步骤均在组织培养生物安全柜中使用无菌无菌技术完成。所有稀释、洗涤和再悬浮液的培养基应在整个过程中保持在4°C。

1. 通过轻柔地重新悬浮并转移到15毫升锥形管中采集T细胞。计数T细胞，取需磁富集的细胞数量，在300 x g下离心10分钟。
2. 抽取并丢弃上清液，并通过重新悬浮于10毫升MACS缓冲液中清洗。离心机加热10分钟，压力为300 x g。抽吸并丢弃上清液。
3. 计算针对替代标记物（如tEGFR）所需的生物素抗体量。通常，抗体应滴定至每1 x 10^6细胞1 微升。
4. 将T细胞以每毫升1 x 10⁷ 个细胞的密度重新悬浮，并加入计算出的生物素化抗体。在4°C下孵育20分钟。
5. 加入10毫升MACS缓冲液，离心10分钟，浓度300 x g。抽吸并丢弃上清液。
6. 将T细胞以1 x 10⁷ 个细胞/80微升MACS缓冲液中重新悬浮。每1 x 10⁷ 细胞加入20微升的抗生物素微珠。充分混合后，在4°C下孵育15分钟。
7. 加入10毫升MACS缓冲液，离心10分钟，浓度300 x g。抽吸并丢弃上清液。将细胞重新悬浮于500微升MACS缓冲液中。
8. 将预冷的软管柱放在磁铁上。在下面放置一个15毫升的锥形管，收集液体流动。
9. 用3毫升MACS缓冲液平衡每根LS柱。使用与收集管相同的15 mL锥形管，将细胞悬浮液施加在平衡的LS柱上。
10. 用1毫升MACS缓冲液清洗柱3次。让每1毫升洗涤液完全通过LS柱后再进行下一次洗涤。
11. 要收集转基因阳性细胞，取下磁铁上的LS柱，放入一个新的15毫升锥形管中。加入5毫升MACS缓冲液，轻轻将液体推出柱外。
12. 计数分离的细胞，并在300 x g下离心10分钟。将转基因阳性细胞重新悬浮在适当体积的培养基中，补充IL-2，培养期直到进行功能和/或表型评估。在开始工作流程前，通过染色检测CAR或替代转导标记进行纯度检测（补充图2）。

5. 系统准备

1. 打开仪器并打开 单元分析套件（CAS）软件。确保垃圾收集容器是空的。确认加湿器柱内是否有水。
2. 进入工作流程面板。打开 “完全清洁 ”工作流程（系统安装时预加载）。
   注意：建议在仪器实验开始后72小时内运行 全净 流程。
3. 完成所有检查后，点击 开始即可继续。提示时，将各试剂槽槽中的锥形管和试剂瓶换成带有BLI清洁液的新容器。点击 “运行 ”图标继续。
4. 当提示时，将各试剂槽槽中的锥形管和试剂瓶换成装有无菌水的新容器。点击 “运行 ”图标继续。
5. 打开 预检 检查流程（系统安装时预加载）。完成所有检查后，点击 开始即可继续。
6. 准备一个50毫升锥形管，内含2毫升润湿溶液。准备一个单独的50毫升锥形管，内含39.6毫升1倍DPBS和400微升润湿添加剂。
7. 当提示时，用光流控芯片替换Flush芯片。点击 “运行 ”图标继续。在关闭巢穴前，用70%乙醇仔细清洁光流体芯片和巢套的表面。
8. 提示时，将每个试剂槽槽中的锥形管和试剂瓶换成含有相应溶液的新容器。

6. 分析工作流程创建

1. 进入工作流程面板。选择 创建新工作流程（+），选择 光谱T细胞画像，然后从下拉菜单中选择 MCA和细胞毒性检测 。
2. 双击“ 多重细胞因子凝珠 加载”以展开珠子加载列表。如果检测细胞因子靶点少于3个，点击 X 键以删除细胞因子加载列表中的细胞因子珠。
3. 更新每个字段，添加相应的珠子类型、细胞因子靶点和导入位置。
   注意：CAS软件会自动加载每个细胞因子捕获微珠，按亮度从Cy5降低的顺序加载，无论加载珠条目如何排列。
4. 双击“优先装 甲运兵车载荷带控制 ”以展开目标单元装载列表。如果检测多个对照靶细胞系和1条样本靶细胞系，则需增加额外的细胞加载步骤。
5. 更新每个字段，包含目标单元线名称、期望视野（视野）到笔，以及APC选择标准（通过指定目标笔选择（TPS）模板文件）。
6. 选择 T细胞负载配置 并选择 多细胞系。双击“优先级 T电池负载 ”以展开T电池负载列表。
7. 通过指定TPS模板文件，更新每个字段的T细胞系名称、期望的笔视角和T细胞选择标准。
8. 双击细胞 毒性检测 以展开细胞毒性检测设置。更新针对工作流程的成像设置字段，添加所需的检测时间（h）。
9. 双击“ 表型与细胞因子检测” 以扩展细胞因子分泌检测的染色方案。
10. 更新芯片染色字段，添加主染和次染料的适当导入位置。
11. 双击 “T单元卸载 ”以展开卸载列表。将#每芯片出口（含空白）字段更新为所需的出口数量。保存并打开新创建的工作流程。

7. 细胞因子捕获珠负载

1. 对每个珠子进行超声和/或漩涡处理，完全重新浮起捕获珠。通过细胞计数器测定珠子浓度。
2. 在30微升的珠子稀释缓冲液中，将珠密度调整为4.5 x 10⁶ 颗珠子/mL（A型珠子）或4 x 10⁶ 颗6珠/mL（B型珠子）。
3. 将珠悬浮液储存在4°C，直到提示装入样品装载区。完成所有检查后，点击 开始即可继续。
4. 提示时，将细胞因子微珠悬浮液与20微升移液器混合，并装入相应的进口位置。点击 “运行 ”图标继续。
5. 提示时，目视检查多个视野，以确认捕获珠在流体通道中均匀分布且密度适中。如果加载分布和/或密度不理想，选择 冲洗并导入 以重新尝试珠子加载。如果负载分布和密度足够，选择 “继续 ”开始点珠。
6. 对每个细胞因子捕获球重复步骤7.3。

8. 目标单元负载

1. 通过锥蓝染色确定每个目标细胞系的活细胞密度。
   注意：本工作流程假设目标细胞来源于活性培养。如果使用冷冻保存细胞，确保细胞至少在解冻后培养过一次，且存活率至少达到90%。
2. 将1×10个⁶个靶细胞采集到1.7毫升微量分离管中。离心机在300 x g下RT下5分钟。抽取上清液。
3. 将每个靶细胞沉淀重新悬浮于100微升附录蛋白V染色溶液中。在RT上孵育30分钟，避免光线。
4. 加入400微升1x附录蛋白V结合缓冲液，并通过移液法重新悬浮。离心机在300 x g 下RT下5分钟。抽取上清液。
5. 将每个靶细胞沉淀重新悬浮在250微升装载培养基+_CaCl2中。将目标细胞悬浮液存放在4°C，直到提示加载样品。
6. 提示时，用200微升移液器重新悬挂目标细胞，并将目标细胞悬浮液装入相应的进口位置。点击 “运行 ”图标继续。
7. 提示时，目视检查多个视场角，以确认目标单元在流体通道中均匀分布且密度适中。如果加载分布和/或密度不理想，选择 冲洗并导入 以重新尝试目标单元装载。如果载荷分布和密度足够，选择 继续 开始TPS门控。
8. 提示时，进入 手动操作，点击 TPS，加载所需的 TPS 模板。
9. 指定要成像的光学滤光片和视场角以定义TPS门，然后点击 仅捕捉 开始图像采集。
10. 打开 门控配置编辑器， 点击 Annexin的复选框，然后选择X参数的附件V染色通道。在下拉菜单中，选择 “日志（Delta 中位数亮度）”。选择 OEP 作为 y 参数。从下拉菜单中选择 最近邻。
11. 拖动生成的门角以排除附录V^的高 和最近邻^低 单元格，然后保存TPS模板，不更改文件名。
12. 返回 工作流程 ，点击 继续 写字。对每个靶细胞系重复步骤8.7-8.11。

9. T细胞负载

1. 通过Trypan Blue染色确定每个T细胞系的活细胞密度。
   注意：本工作流程假设T细胞来源于活性培养。如果要使用冷冻保存的细胞，确保细胞在解冻后经过过夜培养，且存活率至少达到90%。
2. 将1x10个^6T细胞收集到1.7毫升的微量泵管中。离心机在300 x g下RT下5分钟。抽取上清液。
3. 将每个靶细胞沉淀重新悬浮于100微升附录蛋白V染色溶液中。在RT上孵育30分钟，避免光线。
4. 加入400微升1x附录蛋白V结合缓冲液，并通过移液法重新悬浮。离心机在300 x g 下RT下5分钟。抽取上清液。
5. 将每个T细胞沉淀重新悬浮在250微升的加载介质+_CaCl2中。将T细胞悬浮液存放在4°C，直到提示加载样品。
6. 提示时，用200微升移液器重新悬浮目标细胞，并将T细胞悬浮液装入相应的进口位置。点击 “运行 ”图标继续。
7. 当被提示时，目视检查多个视野，以确认T细胞在流体通道中均匀分布且密度适中。如果加载分布和/或密度不理想，选择 冲洗并导入 以重新尝试T细胞加载。如果载荷分布和密度足够，选择 继续 开始TPS门控。
8. 提示时，进入 手动操作，点击 TPS，加载所需的 TPS 模板。
9. 指定要成像的光学滤光片和视场角以定义TPS门，然后点击 仅捕捉 开始图像采集。
10. 打开 门控配置编辑器， 点击 Annexin的复选框，然后选择X参数的附件V染色通道。在下拉菜单中，选择 “日志（Delta 中位数亮度）”。选择 OEP 作为 y 参数。从下拉菜单中选择 最近邻。
11. 拖动生成的门角以排除附录V^的高 和最近邻^低 单元格，然后保存TPS模板，不更改文件名。
12. 返回 工作流程 ，点击 继续 写字。对每个T细胞系重复步骤9.7-9.11。

10. 细胞毒性分析

1. 通过将100微升预解冻的NucView 530 Caspase-3试剂加入20毫升T细胞培养基（库存浓度1 mM，最终浓度5 μM）中，制备50 mL锥形管中的灌注培养基。
2. 提示时，将试剂槽槽内相应的锥形管替换为装有灌流介质的锥形管。点击 “运行 ”图标继续。
   注意：20毫升灌注介质足以灌注一块光流控芯片24小时。如果细胞毒性测试时间超过24小时，准备额外的灌注培养基。
3. 如有需要，可在14小时后点击 “跳过剩余TPS成像”后终止剩余的细胞毒性检测成像步骤，继续工作流程。

11. 表型与细胞因子测定

1. 在1.7毫升微离奇管中，混合76微升多重人CD8/NK面板检测抗体和4微升抗药剂，制备初级染色溶液CD137_BV421。
2. 通过移液混合，储存在4°C，直到提示加载。提示后，将主染色液与20微升移液器混合，并装入相应的进口位置。点击 “运行 ”图标继续。
3. 在一个独立的1.7毫升微离槽管中制备二次染色溶液，方法是将72微升1x DPBS与8微升多重套装SA-PE混合。
   注意：二次染色溶液应提前准备，确保在初级染色完成后即可装填。
4. 通过移液混合，储存在4°C，直到提示加载。提示时，将二次染色溶液与20微升移液器混合，并装入相应的进口位置。点击 “运行 ”图标继续。

12. 化验分析

1. 进入桌面，打开 Assay Analyzer 软件。选择 Assay Analyzer，选择 工作流程，然后选择要分析的工作流程类型。
2. 使用任何期望的标准来定义适合卸载的围栏。根据所需条件生成卸载列表，然后返回CAS软件并选择 “继续所选工作流程”。
3. 确认用检测分析仪创建导出列表的复选框勾选了：[光流体芯片ID]。

13. 卸货

1. 准备一个96孔圆底板，每孔装50微升T细胞培养基。点击 “继续 ”以继续进行单元卸载。
2. 提示时，打开芯片装载区，打开巢盖，取出光流体芯片。将芯片放入无菌培养皿中，光流体芯片的顶缘抬高>1°，以防止细胞从笔中滚出。在后续冲洗步骤中储存在无菌组织培养箱中。
3. 把无菌冲洗芯片放进空巢，盖上巢盖，然后关闭芯片舱。点击 完成 ，然后 继续。
4. 提示时，打开芯片装载区，打开巢盖，取出冲洗芯片。将光流控芯片装回空巢，关闭巢盖，然后关闭芯片舱。点击运行图标继续。
5. 提示时，选择 打开 以显示 装卸井板 菜单。点击 卸载 以移除之前的板块。更新井板ID和井板类型，选择 装载，然后选择 完成。
6. 点击 “继续 ”以继续进行单元卸载。卸下所有所需笔后，进入 手动操作区 ，打开芯片槽取出含有感兴趣单元的板。

Results

使用所述方案，我们对单个模拟核系、CAR和C-Jun过度表达的CAR T细胞，对抗原阴性或抗原阳性 图3 K562肿瘤细胞进行挑战，或不刺激（仅T细胞）。靶细胞的抗原表达均一性被评估为可重复结果的前提条件（补充图3）。由于它们被单独分离在单个纳米笔中，我们能够根据测试条件将这些细胞的细胞因子表达谱描述为单、双或三生产体（见图3）。这些结果通过ELISA作为已建立的细胞因子检测方法得到验证（补充图4）。

如预期，大多数模拟核状的T细胞对三种细胞因子（TNF-α、IFN-γ和IL-2）均为阴性。在标准CAR T细胞中，检测到双阳性、三阳性和单阳性IFN-γ细胞因子产生细胞，以及少量分泌TNF-α和IL-2细胞，而暴露于抗原阴性肿瘤细胞则未诱导多细胞细胞因子分泌。有趣的是，c-Jun的过度表达在目标接触时增加了双细胞因子和三细胞因子产生细胞以及单细胞因子分泌细胞的比例，从而降低了与标准CAR T细胞相比的细胞因子阴性细胞的整体比例。这些结果与此前关于通过强制表达该转录因子⁶对CAR T细胞表型调节的报告一致。值得注意的是，我们观察到仅T细胞组中IFN-γ阳性细胞的比例高于抗原阴性肿瘤细胞组，这可能是由于该组分析的细胞数量较少所致。

为进一步研究T细胞激活，我们评估了上述处理的假核固定、CAR和c-Jun过度表达CAR T细胞中CD137的表达（见图4及补充表1）。与抗原表达的K562靶细胞挑战CAR T细胞相比，CD137表达较模拟细胞核系细胞增加。此外，我们观察到c-Jun过度表达CAR T细胞中CD137阳性细胞比例略高于标准CAR产物的趋势。

总之，该方案使得单细胞层面的细胞因子分泌和激活CAR T细胞能够评估，从而识别单细胞和多细胞细胞因子生产者，并重现此前在^体量层面描述的表型趋势。

图1：通过光流体平台进行多模态剖面的示意工作流程。请点击此处查看该图的更大版本。

图2： 不同光流体平台特征的代表性图像。（A） 通过OEP将单个粒子序列导入单个笔。图像左侧的笔在上一个序列中已加载。（B）在三个独立围栏中随时间杀死事件，显示出表达GFP抗原的肿瘤细胞。（C） 通过 OEP 从一个笔导出单个单元格。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3：单细胞水平细胞因子分泌特征的代表性分析。 单个模拟核状T细胞（CAR-T细胞）在含有细胞因子捕捉珠（针对TNF-α、IL-2和IFN-γ的纳米笔中，无论是否存在抗原阴性或抗原阳性K562肿瘤细胞进行培养。饼图显示了经过24小时共培养后，已分析的单个CAR-T细胞与指示的细胞因子分泌谱比例（终点分析）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4：单细胞层面CD137表达的代表性分析。单个模拟核连接T细胞（CAR-T细胞）在培养后24小时，在光流控芯片上对CD137表面表达进行染色，无论有无抗原阴性或抗原阳性K562肿瘤细胞。小提琴图展示了24小时培养后，模拟核系连接T细胞和CAR-T细胞上CD137表达的荧光强度。 请点击此处查看该图的放大版本。

T细胞培养基组分（使用0.22μM真空过滤单元进行无菌过滤）	体积（最终浓度）
RPMI-1640（1 个 GlutaMAX，25 毫米 HEPES）	500毫升
青霉素/链霉素（10,000 U/mL）	5毫升（90微量/毫升）
β-巰基乙醇（50mM）	0.5毫升（45微米）
人体血清（热灭活）	50毫升（9%）
GlutaMAX补充剂（100倍）	5毫升（0.9倍）
肿瘤细胞培养基成分	体积（最终浓度）
RPMI-1640（1 个 GlutaMAX，25 毫米 HEPES）	500毫升
青霉素/链霉素（10,000 U/mL）	5毫升（90微量/毫升）
胎儿小牛血清（热灭活）	50毫升（9%）
MACS缓冲组件	体积（最终浓度）
DPBS（无Mg2+，Ca2+无）	500毫升
胎儿小牛血清（热灭活）	2.5毫升（0.5%）
EDTA（0.5 米）	2毫升（2毫米）
PBS/EDTA 缓冲区组件	体积（最终浓度）
公共卫生科学研究院	500毫升
EDTA（0.5 米）	2毫升（2毫米）
加载介质组件	体积（最终浓度）
T细胞培养基	18毫升
装载试剂	2毫升
装载介质+CaCl2 成分	体积（最终浓度）
加载介质	499微升
CaCl2	1.25微升
灌流介质+卡斯帕酶底物	体积（最终浓度）
T细胞培养基	20毫升
NucView 530 Caspase-3 基底（DMSO 中 1 mM）	100微升
珠状稀释缓冲液组件	体积（最终浓度）
公共卫生科学研究院	800微升
BSA（2% 无/缺）	100微升（0.2% w/v）
20岁以上（10% 无/不在）	10微升（0.1% w/v）

表1：培养基和缓冲液制备。

补充图1。评估 磁富集前基因转移效率的示例门控策略。 示例轮廓图和直方图展示了基因转移后识别CAR表达（tEGFR阳性）CAR T细胞的门控策略。请点击这里下载此文件。

补充图2。分 拣后进行纯度控制。 示例轮廓图显示了磁分选后表达CAR的（tEGFR阳性）CAR T细胞的比例。请点击这里下载此文件。

补充图3。 靶肿瘤细胞上的抗原表达。 代表性的直方图显示WT K562肿瘤细胞，或通过流式细胞术以表达ROR1并染色同型或ROR1靶向抗体的细胞。请点击这里下载此文件。

补充图4。使用标准ELISA检测细胞因子。 通过ELISA测量，上清液中与K562^ROR1肿瘤细胞共培养24小时后，E：T为4：1，比较CAR与CAR+cJ T细胞。γ统计显著性由未配对t检验确定，分别为*P≤ 0.05、**P≤ 0.01、***P≤0.001、****P≤0.0001。请点击这里下载此文件。

补充表1：分析的细胞。表格显示了每种条件分析的单个单元数量。请点击这里下载此文件。

Discussion

该流程可评估单个CAR-T细胞在与抗原阳性和抗原阴性靶细胞共培养过程中的细胞因子分泌和激活特征，且可选择性地结合细胞溶解活性评估。虽然以单细胞分辨率捕捉多模态泛函数据为分析CAR T细胞性能提供了前所未有的精度，但测量的量化性高度依赖于OEP技术在每个笔中装载相同数量细胞因子捕获珠、靶细胞和CAR-T细胞的准确性。因此，确保每个试剂或细胞样品的加载密度和TPS标准得到优化，以实现单珠和/或单细胞加载至关重要。虽然调整流体通道中珠子或电池悬浮液的浓度可以实现足够的笔式加载，但平台的冲洗和导入选项作为重新尝试加载过程的额外策略。

光流体芯片设计的一个优点是笔布局被分为22个不同的视场角。通过将不同CAR构造物的T细胞工程化到光流体芯片内不同的视角，我们还评估了强制c-Jun过表达的替代构造是否能相较于标准CAR构造增强多模态功能的CAR-T细胞生成（见图3 和 图4).通过这种方式，光流控平台能够快速识别可能提升CAR-T细胞诱导癌症缓解耐久性的候选CAR构造。值得注意的是，单细胞层面靶细胞与效应细胞相互作用的分析需要关键参数的控制，例如肿瘤细胞上靶抗原表达的异质性以及CAR-T细胞群体的纯度（补充图2 和补充 图3）。

虽然我们重点评估IL-2、TNF-α和IFN-γ分泌，但市面上可检测的多种可溶性分析物允许对工作流程进行相当大的定制化。最新进展表明，该领域也正朝着高维流式细胞术方向发展，为不同免疫细胞类型的功能剖析带来协同新可能（^12,13）。例如，未来的应用可能涉及筛选活动，以识别多功能表达的CAR调控T细胞（Tregs）。这些细胞分泌多种抗炎细胞因子，如TGF-β和IL-1014。因此，光流控系统的适应性有望为细胞免疫疗法在非恶性疾病治疗领域拓展到新领域时带来关键见解。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
四维核光束	隆扎
抗生物素微珠	米尔滕尼生物技术	130-090-485
CD3/CD28 发电机串	赛莫飞舍尔	11131D
CD8+ T细胞分离套件	米尔滕尼生物技术	130-096-495
CELLSTAR 15毫升锥形管（PP）	格赖纳生物一号	188271-N
CELLSTAR 50毫升锥形管（PP）	格赖纳生物一号	227261
康宁75厘米及2厘米;U形倾斜颈部细胞培养瓶，带封口盖	科宁	430720U
Costar 24孔透明TC处理多孔板，单独包裹，消毒	科宁	3526
Costar 48孔透明TC处理多孔板，单独包裹，无菌	科宁	3548
DPBS，不加钙，不加镁	赛莫飞舍尔	14190169
DynaMag-15 磁铁	赛莫飞舍尔	12301D
EGFR（艾比妥，西妥昔单抗）	礼来公司	国家防务委员会 66733-948-23	用于内部结合（生物素）
EGFR抗体（C225（西妥昔单抗））[Alexa Fluor 647]	Novus生物制品	NBP2-75903AF647
胎儿牛血清，价值	赛莫飞舍尔	A5256801
GlutaMAX补充剂（100倍）	赛莫飞舍尔	35050038
人类IL-2 IS，高级级	米尔滕尼生物技术	130-097-748
人体血清	德国红十字会（DRK）/ 德国红十字会（GRC）	无
MACS单元分离柱，LS	米尔滕尼生物技术	130-042-401
MACS 多站立	米尔滕尼生物技术	130-042-303
P3原生细胞4D-核光X套件	隆扎	V4XP-3032
Pancoll人类，密度：1.077 克/毫升	泛生物技术	P04-60500
PE附录V型凋亡检测套件I	BD生物科学	559763
青霉素-链霉素（10,000 U/ml）	赛莫飞舍尔	15140122
Pierce 细胞表面生物素化与分离试剂盒	赛莫飞舍尔	A44390
QuadroMACS 起始套件（LS）	米尔滕尼生物技术	130-091-051
RPMI 1640中等剂量，谷氨他max补充剂，HEPES	赛莫飞舍尔	72400054
血清学移液器2、5、10、25和50毫升	格赖纳生物一号	710180, 606180, 607180, 760180, 768180
锥虫蓝染料（0.4%）	赛莫飞舍尔	15250-061
超纯 0,5 M EDTA，pH 8,0	赛莫飞舍尔	15575020
&β;-巰基乙醇（50mM）	赛莫飞舍尔	31350010
信标试剂
96孔圆底板	科宁	3799
信标塑料冲洗芯片		500-00030
BLI清洁液，次氯化钠，0.825%	布鲁克	520-08000
牛血清白蛋白（BSA）	西格玛-奥尔德里奇	A4161
Brilliant Violet 421 抗人类CD137（4-1BB）抗体	生物传说	309820
氯化钙（CaCl2）	西格玛-奥尔德里奇	C5670
LEGENDplex 人类IFN-γ;捕捉珠B3,13倍	生物传说	740545
LEGENDplex 人类IL-2捕捉珠A5,13X	生物传说	740934
LEGENDplex 人类Th面板检测抗体V02	生物传说	741041
LEGENDplex 人类TNF和alpha;捕获珠B7,13X	生物传说	740711
传奇综合 SA-PE	生物传说	740452
NucView 530 Caspase-3 基底，1 mM 在 DMSO 中	Hö伊泽尔	B-10406
OptoSelect 芯片 3500	布鲁克	500-12001
叠氮化钠	西格玛-奥尔德里奇	2002年季
晚20	西格玛-奥尔德里奇	P1379
纯素出口缓冲	布鲁克	520-00040
VWR媒体瓶，方形，PETG，125毫升	VWR	216-2265
VWR媒体瓶，方形，PETG，500毫升	VWR	216-2267
润湿加法	布鲁克	520-08016
润湿溶液	布鲁克	520-00009