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方法文章

菖蒲提取物对大鼠模型辐射性皮肤损伤的治疗作用

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DOI：

10.3791/69705

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2026年1月9日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nuclear Medicine, General Hospital of Northern Theater Command, 2College of Medicine and Biological Information Engineering, Northeastern University, 3Shenzhen Institute for Advanced Study, University of Electronic Science and Technology of China

本文内容

摘要

辐射诱导的皮肤损伤是癌症患者放射治疗过程中常见且严重的并发症，目前尚无有效的临床治疗方法。本方案旨在评估菖蒲（Acorus calamus L.）提取物对辐射诱导皮肤损伤的治疗效果，为该损伤的临床预防与治疗提供新的候选药物和治疗策略。

摘要

放射性皮肤损伤是癌症治疗中常见且致残性的并发症，常导致伤口愈合延迟和患者不适感增加。目前可用于预防或治疗的药物较少。传统中药，特别是菖蒲（Acorus calamus L.），在治疗多种皮肤疾病方面已显示出潜力，但其在放射性皮肤损伤中的疗效仍有待深入研究。

本研究采用暴露于45 Gy辐射以诱导皮肤损伤的Sprague-Dawley大鼠模型。大鼠接受10%、20%和40%的石菖蒲（Acorus calamus L.）提取物治疗，持续45天。通过伤口愈合率、组织病理学分析、细胞因子检测、TUNEL染色和免疫组织化学方法评估伤口愈合、炎症、细胞凋亡和血管生成情况。石菖蒲（Acorus calamus L.）治疗可加速伤口愈合，其中中剂量组的愈合率最高（45天时达88.97%）。组织病理学分析显示炎症减轻、胶原排列改善以及新生血管形成。血清中炎症细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）水平显著降低，细胞凋亡减少，并对关键凋亡蛋白（P53、Bax、Bcl-2）表达具有调节作用。VEGF和bFGF表达上调，促进血管生成和组织修复。石菖蒲（Acorus calamus L.）通过减轻炎症、抑制细胞凋亡和促进血管生成，增强辐射所致皮肤损伤的修复。这些发现提示其在管理放射性皮肤损伤方面具有潜在治疗价值，为临床肿瘤学中辐射诱导的皮肤损伤提供了一种有前景的替代治疗策略。尚需进一步研究以阐明其分子机制。

引言

辐射诱导的皮肤损伤是核事故和肿瘤放射治疗中常见且棘手的并发症1。在放射治疗过程中，约95%的患者会出现不同程度的皮肤损伤，包括红斑、脱屑、反复发生的坏死性溃疡、持续性疼痛以及恶性病变风险升高2。这些病变通常对治疗反应不佳，显著降低患者的生活质量，有时甚至需要中断放疗，从而构成放射肿瘤学领域的重要临床挑战3。辐射诱导皮肤损伤的潜在机制十分复杂，主要涉及皮肤组织内自由基的产生，进而干扰细胞正常功能并加剧愈合过程的障碍4,5。这导致凋亡相关基因的持续表达、炎症反应失调以及信号通路的改变，上述因素共同促成了辐射诱导伤口的持久不愈6。

目前尚无普遍公认的放射性皮肤损伤金标准疗法。临床管理侧重于抗炎或抗氧化治疗策略。7，尤其是外用皮质类固醇，可减轻皮肤反应 通过 抗炎、免疫抑制和血管收缩作用，但长期使用可能导致皮肤变薄8阿米福汀是一种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的放射防护剂，但由于存在显著的不良反应，其临床应用受到限制。9生长因子通过促进细胞增殖、血管生成和肉芽组织形成来加速伤口愈合，但其作用范围较窄，对深层组织损伤和炎症的调控能力有限，且存在过度增生的风险7因此，中医因其整体论哲学、多种具有不同治疗作用的活性成分以及良好的安全性而受到关注。既往研究表明，天然产物如甘草提取物、芦荟多糖和姜黄素可通过清除自由基、抑制促炎介质（TNF-α、IL-6）以及促进成纤维细胞增殖，减轻辐射引起的炎症和组织损伤10,11,12然而，大多数此类研究仅针对单一活性成分或单一靶点，难以充分揭示多组分协同作用的机制。菖蒲（Acorus calamus L.）是一种以其抗炎、抗氧化、抗菌及促进伤口愈合特性而著称的植物，在多种皮肤疾病中展现出潜在应用价值。

Acorus calamus L. 是天南星科的一种多年生草本植物，含有多种生物活性成分，包括萜类、苯基丙烷类、黄酮类、甾体类和生物碱。其多组分的化学组成可同时作用于多个靶点，产生协同的药理效应13。研究表明，该植物能抑制NF-κB和MAPK等炎症信号通路，并呈剂量依赖性地下调促炎因子（如TNF-α和IL-6）的mRNA表达，同时增强超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶的活性，从而发挥抗炎、抗氧化和抗菌作用14,15。尽管已有文献证实其在治疗感染和过敏引起的皮肤疾病方面具有疗效，但Acorus calamus L.在辐射所致皮肤损伤中的作用仍研究较少。近期研究已表明其对辐射损伤具有保护作用，可促进伤口愈合并减轻炎症反应13。然而，Acorus calamus L.在辐射诱导的皮肤损伤中的具体治疗机制尚未完全阐明。

本研究的总体目标是评估菖蒲（Acorus calamus L.）提取物在辐射诱导皮肤损伤动物模型中的治疗效果。我们从多个角度评估伤口愈合、炎症反应及细胞行为，以阐明该提取物的作用机制。研究结果旨在为在癌症放射治疗所致皮肤病变的临床管理中应用菖蒲（Acorus calamus L.）提供理论依据。此外，本研究还将展示该提取物的功能特性、适用的干预场景及核心疗效数据，以帮助读者判断这种基于天然产物的方法是否能够满足其科研或临床需求。最终，本研究致力于寻找有效的治疗方案，以提高接受肿瘤放射治疗患者的生活质量。

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方案

本研究中涉及的动物实验已获得北部战区总医院动物医学研究伦理委员会批准（伦理审批号：2018-03）。实验采用SPF级雄性SD大鼠（6–8周龄，体重190–220 g）。所用试剂与设备的详细信息列于下文 材料表.

1. 实验动物的饲养

  1. 选取108只6至8周龄、体重在190至220 g之间的SPF级雄性SD大鼠。
  2. 维持动物房温度为22 ± 2 °C，相对湿度为50 ± 5%，光照-黑暗周期为12 h。允许大鼠自由摄食和饮水。经过一周的适应性饲养后，进行后续实验。

2. 动物分组

  1. 将大鼠随机分为五个不同组别：正常组（Normal，n = 18）、模型组（Model，n = 18）、阳性药物组（Positive，n = 18，倍他米松乳膏）16、低剂量实验组（Experimental-L，n = 18）、中剂量实验组（Experimental-M，n = 18）和高剂量实验组（Experimental-H，n = 18）。除正常组外，其余各组均接受辐射处理。

3. 建立放射性皮肤损伤的动物模型

  1. 通过腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液（40 mg/kg）进行麻醉，确保操作精准且动物不适最小化。通过观察角膜反射消失以及足趾捏压无反应来确认麻醉深度。在大鼠眼部涂抹眼膏以防止角膜干燥。
  2. 用电动剃须刀去除大鼠背部的毛发，然后用碘伏和75%酒精对背部区域进行消毒。
  3. 将每只大鼠置于俯卧位。固定 32P-β 放射源照射仪（表面剂量率：0.9 Gy/min）对双侧脊柱区域（2 cm × 2 cm 范围）进行照射，照射中心位于中线外侧1 cm处，确保放射源与表皮接触，无间隙。使用无菌医用胶带固定施用器，防止照射过程中发生移位。对目标皮肤区域照射50分钟，以达到45 Gy的总吸收剂量。17.
  4. 大鼠在照射后恢复意识时，将其放回单独的笼子，并确保其能够获取水和食物 随意，保持温度为22 ± 2 °C，相对湿度为50 ± 5%，并维持12小时光照-黑暗循环。
    注意：实验过程必须严格遵守生物安全和放射性职业防护的既定原则。此外，所有操作程序均须遵循医疗废物和放射性废物的规范处置指南，以确保所有相关人员的安全与健康。

4. 石菖蒲提取物的制备及给药

  1. 称取石菖蒲（Acorus calamus L.）的根茎，确保彻底清洗干净，晾干后研磨成粗粉（40目）。加入10–20倍体积的50%乙醇，在室温下均质处理24小时。
  2. 静置提取液30分钟后，倾去上清液，先用4–8层纱布进行初步过滤以去除粗杂质，随后使用滤纸进一步过滤，并在50–60 °C条件下通过旋转蒸发仪减压蒸馏回收溶剂，得到无溶剂的固体残留物（AE，水分含量< 5%）。
  3. AE软膏的制备18
    注：根据《中华人民共和国药典》2020年版（通则0109）19，配制10%（实验低剂量组，w/w）、20%（实验中剂量组，w/w）和40%（实验高剂量组，w/w）的石菖蒲提取物软膏。
    1. 准确称取AE（例如，配制20%软膏时取20 g）及相应量的药用级凡士林（例如，配制20%软膏时取80 g）。
    2. 取总量10%的凡士林加入AE中，充分研磨5分钟，形成均匀糊状物（采用几何稀释法，确保AE在亲脂性基质中均匀分散）。
    3. 将剩余凡士林于60 °C加热熔化，冷却至55 °C后，缓慢加入AE-凡士林糊中。
    4. 在55 °C下以250 rpm磁力搅拌30分钟，然后持续搅拌并冷却至室温，获得光滑、无颗粒的软膏。
    5. 空白对照品制备：将凡士林于60 °C熔化，以250 rpm搅拌30分钟，冷却至室温（与AE软膏基质相同）。
    6. 将所有软膏及空白凡士林密封置于无菌容器中，4 °C保存。
  4. 所有组别在照射后连续45天，每日两次（09:00和17:00）局部给药。正常组未接受照射，但同步进行相同给药操作。给药剂量为0.2 g/cm²，均匀涂抹于背部2 cm × 2 cm区域。正常组给予赋形剂（凡士林），模型组给予赋形剂（凡士林）。阳性对照组给予倍他米松乳膏。实验低、中、高剂量组分别给予含10%、20%和40%（w/w）AE的乳膏。每次给药后，轻轻按摩给药区域10秒以促进吸收，并将大鼠限制活动5分钟以防止舔舐。

大鼠皮肤组织和血液的采集

  1. 使用1%戊巴比妥钠溶液（40 mg/kg，腹腔注射）对大鼠进行麻醉。消毒手术器械，并沿伤口部位切除皮肤。
  2. 将部分组织固定于4%多聚甲醛（10 mL）中，另一部分固定于戊二醛/四氧化锇（5 mL，2.5%）中，其余组织保存于液氮中以备后续分析（参见材料表）。
  3. 从大鼠腹主动脉采集血液样本，在4 °C条件下以3,000 × g 离心15分钟；将上清液吸移至EP管中，分装后于-80 °C保存。

6. 愈合评估

  1. 在照射后的第7、15、30和45天观察伤口，并使用高清相机拍摄伤口表面图像。将图像导入ImageJ软件，沿伤口边缘勾画伤口区域，计算图像中的面积。确保每次操作的一致性，以避免测量误差。计算伤口愈合时间及愈合率。
    注意：伤口愈合率（%）=（初始照射面积 - 未愈合伤口面积）/ 初始照射面积。伤口愈合标准：完全愈合定义为结痂面积< 伤口面积的5%，或已愈合面积> 伤口面积的95%。初始照射面积：指照射动物出现稳定伤口时所测得的伤口面积（基线值）。

7. 电子显微镜检查

  1. 快速组织取样与固定
    1. 使用锋利刀片切取一块大小为 1 mm³ 的皮肤组织，包含表皮-真皮层。
    2. 立即将样本浸入预冷的 2.5% 戊二醛磷酸缓冲液（0.1 M，pH 7.4）中，在 4 °C 下固定 24 小时。
  2. 缓冲液洗涤
    1. 用 0.1 M 磷酸缓冲液（pH 7.4）洗涤三次，每次 15 分钟。
  3. 后固定
    1. 将样本转移至 1% 四氧化锇溶液中，在 4 °C 下继续固定 1.5 小时。
  4. 梯度脱水
    1. 依次通过 50%、70%、80%、90% 和 100% 的丙酮浓度进行脱水，每个步骤持续 15 分钟。
    2. 用 100% 丙酮重复处理三次，每次浸泡 10 分钟。
  5. 环氧树脂包埋
    1. 将样本浸入丙酮与环氧树脂按 2:1 混合的溶液中 2 小时，随后在纯环氧树脂中过夜浸泡。
    2. 在 60 °C 下聚合 48 小时，形成固体包埋块。
  6. 切片与染色
    1. 使用超薄切片机切出 70 nm 的超薄切片。
    2. 先用醋酸铀染色 15 分钟，再在 60 °C 下用柠檬酸铅染色 5 分钟。

8. 苏木精-伊红（HE）染色

  1. 进行石蜡包埋
    1. 切除皮肤标本，使用梯度酒精脱水（例如，70%、80% 和 95% 乙醇各 15 分钟，随后用两次 100% 乙醇替换，每次 15 分钟），然后转移至二甲苯中，直至组织呈半透明状态。
    2. 浸入石蜡中以确保充分包埋，随后使其凝固。
  2. 执行脱蜡和复水
    1. 将石蜡切片浸入二甲苯 I/II 中，各 10 分钟。
    2. 用 100% 乙醇冲洗去除二甲苯，然后依次浸入 95% 乙醇 3 分钟、80% 乙醇 3 分钟、70% 乙醇 3 分钟，最后用蒸馏水冲洗。
  3. 进行苏木精核染色
    1. 在室温下浸泡于 Harris 苏木精染液中 7 分钟。
    2. 用流水冲洗 10 分钟，直至出现蓝色着色。
  4. 实施分化与对比染色
    1. 用 1% 盐酸乙醇溶液分化 3 秒（在显微镜下观察细胞核清晰度）。
    2. 用 0.5% 氨水溶液复染 30 秒。
  5. 进行伊红对比染色
    1. 用含 1% 冰醋酸的 0.5% 伊红溶液染色 90 秒。
    2. 用蒸馏水快速冲洗 5 秒，以去除多余染料。
  6. 执行脱水与透明
    1. 依次通过 70%、80%、95%、100% 乙醇 I/II（各 1 分钟）。
    2. 用二甲苯 I/II 透明，各 2 分钟。
  7. 封片与观察
    1. 滴加中性树胶，然后加盖盖玻片。
    2. 在 60 °C 烘箱中干燥 30 分钟后进行显微镜检查。

9. 马松三色染色

  1. 进行常规脱蜡，方法与HE染色前处理相似。
  2. 细胞核染色
    1. 浸入苏木精溶液中10分钟。
    2. 用流水冲洗5分钟，直至切片呈现蓝色。
  3. 胶原纤维染色
    1. 浸入茜素红与酸性品红混合液中5分钟。
  4. 磷钼酸分化
    1. 转移至1%磷钼酸水溶液中1分钟。
  5. 肌纤维复染
    1. 直接转移至2.5%苯胺蓝溶液中染色5分钟。
    2. 用0.5%冰醋酸水溶液快速冲洗5秒。
  6. 脱水与封片
    1. 梯度乙醇脱水：95%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ（各30秒）。
    2. 二甲苯透明。
    3. 中性树胶封片，60 °C烘干后镜检。

10. ELISA 法检测 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 水平

注意：IL-1β、IL-6 和 TNF-α 是重要的促炎性细胞因子，常用于评估炎症的存在及其强度。监测这些细胞因子的水平对于深入了解炎症过程以及评估抗炎治疗的效果至关重要。

  1. 准备血清样本
    1. 按照第5.3步中详述的方案收集血清样本。
  2. 稀释标准品和样本
    1. 使用样本稀释液对标准品进行梯度稀释；将血清样本按1:4的比例稀释。
  3. 加入样本并孵育
    1. 向每个孔中加入100 µL标准品或样本；用封板膜覆盖各孔；在37 °C孵育90分钟；然后弃去液体，并用吸水材料将孔内残留液体吸干。
  4. 检测抗体-酶反应
    1. 向每个孔中加入100 µL针对IL-1β、IL-6和TNF-α的酶标记试剂；在37 °C孵育60分钟；移除液体并吸干；用200 µL洗涤缓冲液洗涤平板4次。
    2. 向每个孔中加入100 µL链霉亲和素-HRP工作液（1:100稀释）；在37 °C避光孵育30分钟；用200 µL洗涤缓冲液洗涤平板4次。
  5. 显色与终止反应
    1. 向每个孔中加入100 µL TMB底物溶液；在室温下避光孵育10分钟；随后向每孔中加入50 µL终止液。
  6. 读取数据
    1. 在30分钟内使用酶联免疫吸附测定仪在450 nm波长（校准波长为630 nm）下测定吸光度；利用标准曲线计算浓度（pg/mL）。

11. TUNEL 检测

  1. 切片预处理
    1. 脱蜡并水化石蜡切片，直至进入蒸馏水。
    2. 加入蛋白酶K工作液（浓度为20 µg/mL），37 °C孵育20分钟。
    3. 用PBS洗涤切片三次，每次洗涤持续2分钟。
  2. 标记反应
    1. 加入含有TdT酶和荧光素标记dUTP的TUNEL反应混合液。
    2. 在湿盒中37 °C避光孵育60分钟。
  3. 信号转换
    1. 用PBS洗涤三次，每次洗涤5分钟。
    2. 加入HRP标记的抗荧光素抗体，稀释比例为1:500。
    3. 37 °C孵育30分钟。
  4. DAB显色反应
    1. PBS洗涤后，加入DAB显色液，在显微镜下观察1至3分钟，监测显色过程。
    2. 用蒸馏水终止反应。
  5. 复染与封片
    1. 用苏木精复染细胞核1分钟。
    2. 梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
  6. 结果判读
    1. 凋亡细胞核呈棕黄色，正常细胞核呈蓝色。
    2. 每张切片随机选取五个高倍视野（400×），计算凋亡率。

12. 免疫组织化学染色

  1. 脱蜡与抗原修复
    1. 将石蜡切片浸入二甲苯 I 中 10 分钟，然后转移至二甲苯 II 中再处理 10 分钟。随后使用梯度乙醇进行脱水：依次在 100% 乙醇 I 中浸泡 5 分钟，100% 乙醇 II 中 5 分钟，95%、80% 和 70% 乙醇中各 3 分钟，最后用蒸馏水冲洗 2 分钟。
    2. 使用 pH 6.0 的 0.01 M 枸橼酸钠缓冲液进行高压热修复，维持温度 121 °C，持续 3 分钟。
  2. 封闭内源性干扰
    1. 在室温下加入 3% H2O2 溶液处理 10 分钟，以灭活内源性酶类。
    2. 滴加 5% BSA 封闭液覆盖组织，在 37 °C 湿润环境中孵育 45 分钟；吸除多余封闭液，无需冲洗。
  3. 抗体孵育
    1. 滴加 5% BSA 封闭液，在 37 °C 孵育 30 分钟。
    2. 加入优化浓度的一抗工作液（如 P53、Bax、Bcl-2、VEGF 和 bFGF），在 4 °C 湿润环境中过夜孵育；用含 0.1% Tween-20 的 PBS-T 缓冲液洗涤三次，每次 5 分钟。
    3. 加入 1:200 稀释的 HRP 标记二抗，在 37 °C 湿润环境中孵育 60 分钟；用 PBS-T 缓冲液洗涤三次，每次 5 分钟。随后加入 ABC 复合物溶液，在 37 °C 孵育 30 分钟，再用 PBS 缓冲液洗涤三次，每次 5 分钟。
  4. DAB 显色
    1. 加入含 0.02% H₂O₂ 的 DAB 显色液，在室温下于显微镜下观察显色过程，持续 1–4 分钟。
    2. 立即用蒸馏水终止反应。
  5. 复染与封片
    1. 将样本浸入 Harris 苏木精溶液中染色 1 分钟，然后在流水下冲洗 10 分钟以实现蓝化。
    2. 依次浸入以下溶液：70% 乙醇 30 秒，80% 乙醇 30 秒，95% 乙醇 30 秒，100% 乙醇 I 中 1 分钟，100% 乙醇 II 中 1 分钟。
    3. 为彻底透明并固定，先浸入二甲苯 I 中 2 分钟，再转移至二甲苯 II 中 2 分钟。滴加中性树胶封片剂，加盖盖玻片，并在 60 °C 烘箱中干燥 30 分钟。
  6. 结果定量
    1. 出现棕黄色为阳性反应；阳性信号（棕黄色）应与阴性背景形成对比。
    2. 使用 Image-Pro Plus 软件计算至少 5 个视野中阳性细胞的百分比。

13. 蛋白质印迹检测

  1. 组织裂解制备
    1. 将液氮冷冻的皮肤组织置于预冷至 -80 °C 的不锈钢研钵中；分三次逐步加入液氮，以减少挥发；垂直研磨至无可见颗粒；将所得粉末转移至含有裂解缓冲液的 EP 管中。
    2. 加入蛋白酶抑制剂（1:100）和磷酸酶抑制剂（1:50）；在冰上涡旋振荡 30 秒；进行超声破碎；在 4 °C 摇床孵育器中孵育 2 小时；在 4 °C、14,000 × g 条件下离心 20 分钟；小心吸取上清液。
  2. 蛋白质定量与处理
    1. 取 5 µL 上清液加入 96 孔板中；加入 200 µL BCA 工作液；在 37 °C 避光孵育 30 分钟；使用酶标仪在 562 nm 处测定吸光度；根据标准曲线确定蛋白浓度。
    2. 按 4:1 比例将 5× 还原型蛋白上样缓冲液与蛋白溶液混合；置于沸水浴中变性 15 分钟；于 -20 °C 保存以备后续使用。
  3. SDS-PAGE 电泳
    1. 配制 12% 丙烯酰胺分离胶；灌胶至梳齿下方约 1 cm 处；用异丙醇覆盖以隔绝空气；凝固后去除异丙醇；灌注 4% 浓缩胶；插入 15 孔梳子；室温静置 30 分钟使其凝固；在第 1 孔加入 5 µL 预染蛋白 Marker；第 2 孔加入 20 µL 空白裂解液；第 3 至 14 孔每孔加入含 40 µg 蛋白的样品 10 µL。
    2. 起始电泳电压设为 80 V；当溴酚蓝进入分离胶后，切换至 120 V；通过冰水循环维持温度在 10–15 °C；持续电泳至溴酚蓝距凝胶底部约 0.5 cm 处停止。
  4. 湿转印程序
    1. 配制含 20% 甲醇的转膜缓冲液；预冷至 4 °C。将 PVDF 膜浸入甲醇中活化 1 分钟；将 NC 膜在缓冲液中平衡。按以下顺序组装转膜夹： "阴极板 - 海绵垫 - 滤纸 - 凝胶 - 膜 - 滤纸 - 海绵垫 - 阳极板"；用滚轮彻底去除气泡；根据目标蛋白分子量设定参数：对于 < 50 kDa 的蛋白，采用 100 V 恒压转膜 60 分钟；对于 50–100 kDa 的蛋白，采用 250 mA 恒流转膜 90 分钟；对于 > 100 kDa 的蛋白，采用 300 mA 恒流转膜 120 分钟；连接 4 °C 循环水浴。
  5. 免疫检测程序
    1. 转膜完成后，将 PVDF 膜浸入甲醇中 1 分钟；用 TBST 洗涤三次，每次 5 分钟；用 3% H₂O₂/TBST 覆盖膜表面；室温避光孵育 15 分钟；吸除液体；加入 5% BSA/TBST 封闭液；在 37 °C 摇床孵育器中封闭 1 小时；用 TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
    2. 加入一抗工作液（如 P53、Bax、Bcl-2、VEGF 和 bFGF）；在 4 °C 摇床孵育器中孵育过夜；用 TBST 洗涤四次，每次 10 分钟；加入 HRP 标记的二抗；在室温摇床孵育器中孵育 90 分钟；用含 0.5% SDS 的 TBST 洗涤六次，每次 8 分钟。
  6. 化学发光成像
    1. 等体积混合 ECL A 液与 B 液；均匀覆盖膜表面；在避光条件下反应 60 秒；吸除多余液体；对于强信号蛋白，设定单次曝光时间为 1–5 秒；对于弱信号蛋白，进行五段累积曝光（10/30/60/120/300 秒）；使用化学发光成像仪采集图像。
  7. 数据分析流程
    1. 使用 ImageJ 软件对蛋白条带进行定量；设定统一的背景扣除阈值；计算目标蛋白与内参蛋白（β-actin 或 GAPDH）的灰度比值。
    2. 将数据导入 GraphPad Prism 进行分析。

14. 统计分析

  1. 以均值 ± 均值标准误表示数据。两组之间的比较采用独立样本 t 检验，多组之间的比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。
  2. 使用 SPSS 26.0 和 GraphPad Prism 8.0.2 进行数据分析。
  3. 以 P < 0.05 为差异具有统计学意义的标准。

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结果

石菖蒲对辐射所致皮肤损伤的治疗作用
照射后15天，所有组别的大鼠均出现皮肤干燥脱屑、局部红肿、溃疡及结痂现象。照射后30天，模型组皮肤损伤最为严重，照射部位的结痂和溃疡达到高峰。至照射后45天，模型组结痂脱落极少，伤口略有收缩。相比之下，石菖蒲组和阳性药物治疗组的皮肤损伤明显减轻，溃疡程度较轻，伤口愈合加快，上皮覆盖更迅速（见图1A）。照射后45天，中剂量石菖蒲组的伤口愈合率最高，达88.97%，其次为高剂量石菖蒲组（72.88%）和阳性对照组（64.75%）（见图1B）。在各实验组中，中剂量石菖蒲组的伤口愈合速度最快（见表1）。

透射电子显微镜观察皮肤组织的超微结构变化
在正常组中，表皮细胞完整，细胞器（如线粒体）结构保存良好。在模型组中，毛囊缺失，成纤维细胞出现严重水肿，胶原纤维排列紊乱，细胞器数量减少，游离线粒体增多。线粒体呈中度肿胀，粗面内...

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讨论

辐射诱导的皮肤损伤仍然是临床癌症放射治疗中最常见且最具挑战性的并发症之一。作为人体最大的器官且是辐射的首要靶器官，皮肤易受到辐射产生的自由基和活性氧物种的损害，这些物质可破坏细胞功能，包括细胞分裂、迁移和分化，最终导致伤口愈合延迟和组织损伤20,21。此类损伤常表现为红斑、水肿、反复溃疡和坏死，严重时甚至可能危及患者生命20,21。目前针对辐射诱导皮肤损伤的治疗方法缺乏特异性，因此寻找有效的治疗药物是医学研究的重要方向。传统中药菖蒲（Acorus calamus L.）因其具有抗炎、抗氧化、抗菌以及清除自由基等多种药理特性，在促进伤口愈合方面展现出潜在价值22。然而，其在辐射诱导皮肤损伤中的治疗作用及潜在机制仍缺乏充分研究。本实验方案基于放射性皮肤损伤的动物模型，旨在从炎症反应、细胞凋亡和血管生成等方面探讨菖蒲（Acorus calamus L.）治疗放射性...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到辽宁省科学技术计划联合计划（技术攻关项目）（2024JH2/102600273）和北部战区总医院自主研究项目（ZZKY2024001、ZZKY2024002、ZZKY2024003）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4% 多聚甲醛固定液Beyotime Biotech Inc (Beyotime)，中国P0099
石菖蒲提取物自行制备N/A  详细的制备方案见方案第4节。
抗Bax抗体  中国湖北武汉，武汉赛维尔生物科技有限公司GB11690
抗Bcl-2抗体中国湖北武汉服务生物技术有限公司GB113375
抗bFGF抗体Proteintech Group, Inc.（中国湖北武汉）11234-1-AP
抗P53抗体 中国湖北武汉服务生物技术有限公司GB111740
抗VEGF抗体 中国湖北省武汉市武汉赛维尔生物科技有限公司GB111971
BCA 蛋白检测试剂盒 中国湖北武汉服务生物技术有限公司G2026-200T
倍他米松乳膏 中国联合制药有限公司N/A 浓度：0.1% w/w
国家药品批准文号：H19994057
乙醇上海阿拉丁生化科技有限公司E111991用作石菖蒲提取物的提取溶剂。
凝胶与印迹成像系统Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, USA)ChemiDoc MP
苏木精-伊红染色试剂盒北京索莱宝科技有限公司 & Technology Co., Ltd.，（中国北京）  G1120
HRP标记的山羊抗兔IgG（H+L）中国湖北武汉服务生物技术有限公司GB23303
倒置荧光显微镜奥林巴斯株式会社（日本东京）IX83  
马松’s Trichrome 染色试剂盒北京索莱宝科技有限公司 & Technology Co., Ltd.，（中国北京）  G1340
酶标仪（用于吸光度、荧光和发光检测）Molecular Devices（美国加利福尼亚州圣何塞）SpectraMax iD3
凡士林国药集团化学试剂有限公司（中国上海）N/A  药用级白凡士林；熔点：45-60 °C  国家药品批准文号：H31022350
大鼠 IL-1β ELISA试剂盒  Beyotime Biotech Inc (Beyotime)，中国PI303
大鼠 IL-6 ELISA 试剂盒  Beyotime Biotech Inc (Beyotime)，中国PI328
大鼠 TNF-α ELISA试剂盒  碧云天生物技术股份有限公司（碧云天），中国PT516
TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（DAB）Beyotime Biotech Inc (Beyotime)，中国C1091

参考文献

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