使用生物提取现场试剂盒和现场qPCR单元进行微生物DNA分析

Summary

可靠且准确的现场部署DNA分析对许多行业至关重要。本文提出了两种用于现场环境微生物分析的方法：1）使用生物提取现场试剂盒从环境样本中分离微生物DNA，2）通过现场qPCR单元分析DNA。

Abstract

随着定量PCR（qPCR）在各行业的广泛应用，能够在远程环境中无后勤障碍地提取和分析DNA的能力变得至关重要。一个明显的例子是需要简单的工具来量化受列车脱轨或石油泄漏影响的偏远场所的污染物降解细菌，从而能够及时评估风险和环境影响。为了可靠实现这一目标，工艺必须便携轻便，非科学家易用，抗污染，并能快速交付结果，同时保持严格的质量控制。尽管核酸提取和qPCR实验室外分析的选项多年来一直存在，但直到最近技术进步，才使得能够实现可靠且准确性能的现场部署系统的发展。本研究展示了在真实环境条件下，现场DNA提取试剂盒与便携式qPCR仪器结合的应用。在约30°C的室外环境下进行的田间试验显示，DNA产量和扩增效率与受控实验室环境相当。重要的是，现场结果显示出同等的灵敏度和可重复性，证实便携式工作流程无需传统实验室基础设施即可提供高质量数据。这些发现凸显了去中心化分子分析的潜力，能够将qPCR扩展到偏远且资源有限的环境中，同时保持决策所需的准确性和可靠性。

Introduction

在考虑分子生物学分析，如qPCR，样本管理存在若干限制。一个明显的例子是对简单可靠工具的需求，以量化受列车脱轨或石油泄漏影响的偏远地点污染物降解细菌，支持对环境风险^和影响的及时^评估。主要限制是无论样本多冷，微生物群落都会（而且会）随着时间变化 ^6,7。为确保数据准确反映样本采集的原始环境，建议在24^小时8分钟内提取DNA。对于在海上石油平台采集微生物样本的工程师，或深入雨林内部的科学家来说，这个时间线是不可行的。从这些偏远地区当天内将水样或土壤样本送到运输公司，然后隔夜送往实验室（同时保持制冷），再提取DNA再进行分析，是不可能的。

一旦提取DNA，时间停止，样本的全部遗传信息通过适当的^{存储技术无限}期保存。这使得提取出来的DNA与绝大多数化学、冶金和生物样本极为独特——而这些样本大多保质期有限。存档的DNA可以在数年甚至数十年后被检索，并在新平台上分析新的靶点。因此，提取的DNA必须真正代表原始微生物群落，而非因延迟转运而改变的DNA。

此外，实验室对样本提取和分析的要求极大限制了采样项目的灵活性和一致性。仅物流成本对^{某些项目来说}可能难以承受。能够在采样后数小时甚至几分钟内准确定量样本，为全球环境项目打开了许多大门。

Protocol

注意：以下方案使用生物萃取试剂盒（生物提取现场试剂盒）和FieldQuant qPCR（现场qPCR）完成。

1. 从地下水中采集生物质样本及使用封装过滤器和生物提取现场套件的DNA分离方案

1. 步骤1的所有步骤都戴手套和安全眼镜。
2. 准备蠕动泵和管道，并按照美国环境保护署（EPA）地下水采样指导¹¹进行标准体积净化。
3. 取下封装的滤网、适配器、夹具和盖子，从提供的离心管中取下（见图1）。
4. 将管子（内径1/4-5/16英寸[I.D.]）穿过附带的夹具，并拧紧夹具，将软管固定在锁定的鲁尔适配器上（见图2）。
5. 将过滤器的进气口连接到前一步安装的Luer-Lock适配器上。
6. 将过滤器放入接收容器中，以便准确测量过滤水量。
7. 使用低流量（<0.5升/分钟）过滤最多1升水。过滤的水量会根据水的浊度而变化。
   1. 如果过滤器在过滤1升之前堵塞，就停止并继续下一步。
      注意：DNA分析灵敏度高，最低可用10毫升进行，具体取决于系统的生物量。
8. 手动记录通过过滤器的体积（毫升）。将过滤水倒掉。
9. 两端都盖上滤网。确保较薄的一端用红色盖子封闭，较厚的一端用白色Luer-Lock塞子封闭。
10. 把滤网放回提供的塑料管里。
11. 将标签贴在离心管上，并注明通过过滤器的水量、位置、采样日期及所需分析内容。保存温度为1-4°C，直到提取。
    注意：滤芯必须在采样后24小时内取出。
12. 使用附带的酒精准备湿巾，清洁一个平面以便分阶段提取（例如木板、卡车尾门等）。
13. 提取DNA时，将生物提取场试剂盒的所有组成部分铺放在平坦干净的表面上（见图3）。
    1. 把过滤器两端的盖子都打开，把盖子放在一边，以备后用。找到套装里附带的3毫升注射器，打开其中一支。把空气吸入3毫升注射器，并通过锁定润滑器连接到过滤器。
    2. 把注射器里的空气挤出来，把过滤器里残留的水排出去。断开注射器，吸入更多空气后再重复。
    3. 重复多次，确保尽可能多的水从过滤器中排出。重新盖上红色插座盖。
14. 将封闭的溶液A注射器倒置多次，以确保充分混合。取下锁铅针盖。
15. 通过鲁尔锁定头将溶液A注射器连接到封装的0.2微米滤芯入口，通过按下柱塞缓慢加入全部溶液A。推得太快会导致背压产生，所以一定要慢慢放下活塞。如果过滤器堵塞导致无法添加溶液A，请取下过滤器的红色出口盖，再试一次。重新汇集过滤器。
16. 用力摇晃关闭的过滤器5分钟。
    注意：为防止疲劳，可以准备多个样本，并且可以同时手摇。如果有，可以使用可充电的涡旋混合器来完成这一步骤，而非握手。
17. 将封闭的溶液B注射器倒转多次，以确保充分混合。取下注射器上的锁住帽。
18. 取下封装的滤网进水口盖。通过封闭吸头将溶液B注射器连接到封装的滤嘴入口，然后通过按下柱塞缓慢加入全部溶液B。推得太快会导致背压产生，所以一定要慢慢放下活塞。重新盖上过滤器进水口盖。
19. 用力摇晃关闭的过滤器5分钟。
    注意：为防止疲劳，可以先准备多个样品，并同时手摇。如果有，可以使用可充电的涡旋混合器来完成这一步骤，而非握手。
20. 拆下进气口盖。
21. 在滤器倒置后，使用连接在封装滤器单元上的3毫升注射器向滤芯注入1毫升空气，然后拉回活塞以尽可能去除裂解液（液体）。
    注意：如果裂解液特别粘稠，可能需要多次推拉活塞以将溶液从滤器中抽出。
22. 将裂解液加入5毫升的珠管中。封住管子，顶部用防腐胶封住。
23. 用力摇晃管子5分钟。将管子竖立，同时继续作步骤。
    注意：为防止疲劳，可以准备多个样本，并且可以同时手摇。如果有，可以使用可充电的涡旋混合器来完成这一步骤，而非握手。
24. 在避免箔面污染的同时，将样品制备筒放在平面上。
25. 将1毫升注射器从包装中取出，并将可锁住的柱子拧在注射器末端。用色柱尖端在样品制备盒的第一段上戳两个孔。
    注意：弹壳部分含有混逆盐和/或乙醇。请戴手套和安全眼镜。
26. 使用塑料体积移液管，将1毫升裂解液（仅液体，尽量避免转移珠子）从珠管转移到第一个样品制备匣段新打孔的孔中。为了获得最佳效果，在移液时缓慢地以略微角度加入裂解液，并从锡箔孔中移液。
27. 将注射器柱重新插入弹芯的红色部分。把液体完全吸入注射器，然后推出。重复这个泵动动作10次。
28. 在进入下一步之前，先把注射器里的所有液体推回红色区域。液体不应从一个切段转移到另一个切片——这适用于样本DNA分离协议的每一个剩余步骤。
29. 将注射器柱尖顶覆盖红橙色部分，并在箔膜上穿出两个孔。用活塞把注射器里的液体全部抽出，然后再抽出来。重复这一步骤，总共泵两次，将所有液体排出。不要把任何液体转移到下一步。
30. 将注射器柱尖顶对准橙色部分，穿透铝箔屏障两个孔。用活塞把注射器里的液体全部拉进注射器，然后把液体泵回去。不要把任何液体转移到下一步。
31. 将注射器柱尖顶对准黄色部分，并穿透箔膜两次。用活塞把注射器里的液体全部拉进注射器，然后把液体泵回去。不要把任何液体转移到下一步。
32. 将注射器柱尖端对准蓝色风干部分，只需穿透一次锡箔隔层。用活塞把注射器里的空气全部吸进注射器，然后迅速抽出。快速重复此泵送动作至少20次，直到柱看起来干燥。
33. 将注射器柱尖顶覆盖最后的绿色部分，并穿透箔膜两次。用活塞把注射器里的液体全部拉进注射器，然后把液体泵回去。重复这一步骤，总共5次泵。
34. 使用1毫升注射器和样品制备柱，将绿色切片中的所有溶液转移到标记良好的1毫升微管中——这就是现场提取的DNA样本。保存温度为1-10°C（例如，放入冷藏箱，加冰袋或冰箱等），保存一周或直到使用。
    注意：为了长期储存，DNA样本可以无限期保存在-20°C。

2. 使用现场qPCR单元的现场qPCR分析协议

注意：现场的qPCR仪器及其控制设备的手机依赖可充电电池。前往现场前，确保两者都充满电。

1. 将最多三份现场提取的DNA样本放入托盘的纯样本槽中。确保每个部分有一个采样：一个采样位在1、2或3槽位，一个采样位在4、5或6位，另一个采样位在7、8或9位。
2. 将每个样品的检测试纸放入托盘对应的A、B或C试纸槽中。把试纸上的第一个孔对准托盘上的第一个槽口。
3. 解锁手机，打开以注册商标qPCR仪器命名的应用程序。电话与现场qPCR单元通过集成短距离无线连接。应用打开后，点击 “开始运行 ”按钮。
   注意：该应用已预载在随附手机上，无法在其他地方下载。
4. 在下一界面，点击 生成ID 按钮。
5. 下一个界面是输入每个样本信息的地方;点击“ 样本ID ”下方，输入样本名称。
   1. 抽取 样品单位 ，选择用于提取的样品类型的合适体积单位（克数[g]、毫升[mL]或拭子）。
   2. 然后在 样本量 下方抽取，输入上述现场提取中使用的样本体积（例如过滤后的毫升数）。对剩余的两个样本重复此过程。
   3. 当所有采样信息输入完成后，点击 继续 按钮。
      注意：如果使用少于3个样本，保留样本ID为默认，选择任意单位，并在样本量栏输入1，表示未使用的样本继续。
6. 在下一界面，点击文件夹。切换到下一个界面，点击 保存 到当前文件夹。
7. 在下一画面，输入运行名称并点击 确认。
8. 按住位于乐器左上角 的电源 键，直到乐器前方所有灯光亮起（~5秒）即可开启乐器。然后，在应用里点击 确认 继续。
9. 在下一个界面，通过集成短距离无线连接。按下仪器顶部 的内置短距离无线 按钮（一个熟悉的商标符号），直到蓝灯开始闪烁。点击 确认 ，等待应用和乐器同步。同步完成后，在应用中点击 仪器名称 选择，然后点击 连接 按钮继续加载检测试纸。
   注意：如果仪器和应用第一次无法同步，请确保仪器上的短距离无线灯仍在闪烁，然后再次轻触扫描。
10. 在拆除分析条的盖子之前，请检查冻干沉淀是否位于任何分析条井顶部。如果有，轻轻拨动井底，让沉颗粒下降到井内。
11. 取出第一个样品时，先把Go strip管上的盖子取下来。向试纸第一孔加入18微升无菌水，轻柔上下移液器以溶解沉淀。对剩下的两口井重复同样作。
12. 向每个孔加入2微升样品，并通过将一套橡胶测定条盖插入管内密封，盖子间的缺口朝向托盘背面。如有需要，对剩余样本重复步骤2.10-2.12。所有试纸填充并封好条带盖后，在应用中点击 确认 。
13. 逐条取出试纸，检查井底是否有气泡。如果井底有气泡，轻轻摇晃带状物，直到气泡向上移动。检查完所有井后，在应用中点击 确认 ，然后开始将试纸装入仪器。
14. 打开仪器盖子，将检测试纸按托盘上的顺序和方向放入现场qPCR仪器，使井的铰链和盖子间的缺口朝向仪器背面。所有试纸都加入后，轻轻将盖子往下推，直到盖子锁定，然后敲 击确认。
15. 在应用里点击 开始 运行按钮。
    注意：跑步将开始，按照预设的跑步条件，完成时间约为~45分钟。这些条件不可编辑。
16. 跑步结束后，点击 邮件结果。一旦手机接入WiFi，结果将被发送进行分析和报告;在此之前，结果会存储在仪器上。
    1. 连接 WiFi 后，用户需要再次点击 发送 按钮发送结果。
17. 每次检测间清理托盘，避免样本间污染。
    注意：输出为Excel文件，包含每口井的循环阈值（Ct）值。这些结果会被送往实验室，实验室会检查扩增质量，并利用针对每个qPCR靶点的经过验证的标准曲线，并根据原始样品的体积和基质，将Ct值转换为丰度。这些结果会以电子交付物和PDF形式发送给用户。

Results

从代表性的环境样本中提取DNA是通过生物提取现场套件和^{之前描述的}高度验证的实验室方法进行的。如 图4所示，通过将qPCR结果与高度验证的实验室提取方法进行比较，确认了使用现场试剂盒完成DNA分离的成功。这一一致性证实了该方法在野外环境中保持了环境样本的DNA完整性。

现场qPCR试剂盒的组成部分如 图5所示。使用现场qPCR单元对标准培养稀释脱 盐 球菌（DHC）进行了分析，同时在室内（21°C）和室外（30°C）温度下进行，以展示仪器在真实现场条件下的稳健性。结果如 图6所示，突出显示每种10次重复的偏差较低。作为完整背景，DHC是一种能够降解氯化溶剂的生物体，通常通过qPCR在环境^{修复行业中}定量4。

为验证仪器的精度，使用十台现场qPCR仪器在三种不同浓度下进行了DHC分析（见图7）。即使在低丰度下，所有运行的相对标准差也保持在较低（低于5%）。注意，与标准差相比，相对标准差对对数数据很重要，因为它通过以下方程对结果进行归一化：

其中RSD是相对标准差，σ是数据集的标准差，μ是数据集的平均值。

本文中的两种方法共同提供了在重复现场提取和qPCR检测中可重复的结果。现场与实验室提取与qPCR分析的一致性表明，无需依赖实验室基础设施即可获得可靠且高质量的数据，使微生物分析能够在偏远或资源有限的环境中进行。

图1：封装滤网组件。 封装过滤器用于过滤水样中的生物质。通过管道连接到蠕动泵，水被推入过滤器。记录水的总体积后，水被丢弃，过滤机上收集的生物质即可进行DNA提取。组件：a. 用于固定过滤器及组件的无菌管，用于使用前后，b. 进气口盖，C. 软管夹，d. 鲁尔锁定管连接适配器，E. 封闭滤网，F. 橡胶出口盖。图片经Microbial Insights， ^Inc.12授权使用。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：滤网与管路连接。 管子被推入鲁尔锁定管连接适配器，并用软管夹固定。管路的另一端连接到蠕动泵（该连接及泵作不在本协议范围内）。图片经Microbial Insights， ^Inc.12授权使用。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3：DNA分离现场试剂盒组件。 所有部件在使用前均为无菌状态。组件包括：（1）封装过滤套件（详见 图1 ），（2）3毫升注射器，（3）预装溶液A的1毫升注射器，封盖，（4）预装溶液B的1毫升注射器，（5）3毫升注射器，（6）硅胶珠管，（7）装有隔离柱的1毫升注射器，（8）1毫升一次性转移移液管， （9） DNA分离样本制备筒，（10） 1.5毫升微离心管。未显示的：用于摇晃时密封的对抗胶片方块，以及用于清洁提取表面的酒精处理湿巾。图片经Microbial Insights， ^Inc.12授权使用。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4：使用真实样本进行场提取比较。 比较实验室方法（红色条）与生物提取现场试剂盒（蓝色条）分离的DNAqPCR结果。这些样本未像标准qPCR分析那样进行重复分析。基因靶点（横轴）在这两种方法中均显示丰度（纵轴）在一个数量级范围内。未包含每个具体基因靶点的信息，因为这超出了本文的范围。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5：现场基qPCR仪器及组件。 组成部分包括：A.现场基qPCR仪器，B. 样品制备托盘，C. 检测试纸含冻干性试剂，D. 预装应用器，用于运行该仪器。图片经Microbial Insights， ^Inc.12授权使用。 请点击此处查看该图的放大版本。

图6：现场qPCR鲁棒性的演示。 在室外（30°C，红色条）和室内（21°C，蓝色条）条件下，进行了十次重复分析，凸显了该仪器在该领域的可靠性。复制运行编号沿横轴列出，计算出的DHC丰度沿纵轴显示。室内（20°C）平均值为4.92×10²细胞/毫升，标准差=1.14×10²细胞/毫升（n=10），外部（30°C）平均为5.89×10²细胞/毫升，标准差=1.8×0,10²细胞/毫升（n=10）。在20°C和30°C时的测量结果没有显著差异（韦尔奇t检验，p = 0.17）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图7：现场qPCR精度演示。 10种不同仪器之间的精密性能，在三种不同标准浓度下重复运行。真实值和复制数量（每个标准浓度下10个仪器为n = 2）沿横轴列出，并用特定现场单元的彩色条标示。纵轴显示每次运行的计算丰度。每个标准浓度的相对标准差百分比在条上方的虚线中显示。 请点击此处查看该图的放大版本。

Discussion

该协议的一个关键特点是能够在现场条件下提取微生物DNA和qPCR分析，无需实验室基础设施或^电力。该方法经过优化，平衡了便携性和可靠性，即使在户外环境温度范围下，也提供了与实验室工作流程一致的可复现^结果。建议的使用范围为4°C至95°C（39°F至104°F），在标准户外温度（30°C、86°F）下，野外团队的温度一致性可靠（见图6）。这种一致性对于确保现场结果与实验室数据集并存可解读至关重要。

协议成功的关键步骤有几个关键。在提取过程中，完全去除滤液中的液体并充分混合试剂，以确保高效的裂解和DNA回收。同样，在减少珠子残留的同时，谨慎地将裂解液转移到样品制备筒中，是防止堵塞或柱子失效的关键。排查策略包括减缓活塞下压以降低背压，并在粘稠裂解液阻碍液体流动时重复注射器泵送。对于qPCR，避免检测井内气泡并确保完整沉淀重新悬浮对准确扩增至关重要。

尽管有其优势，该方法也存在局限性。DNA产量可能低于基于离心的实验台，且高度浑浊或富含有机物的样品会挑战柱子的性能。虽然隔离试剂盒简单易用——包括没有实验室经验的用户——但与缺乏经验的人比较时，存在额外的错误风险。此外，虽然现场qPCR单元能提供快速结果，但其同时反应数量有限（目前每次运行仅限9个基因靶点），相比标准热循环装置。然而，这些局限性被分析速度和野外捕捉微生物群落特征的能力所抵消。除了提供该单元的实验室目录外，分析的qPCR靶点本身没有固有限制。

该方法的重要性在于其动员分子分析的能力，使得对油田、农业场地或偏远生态系统等环境中微生物种群进行实时监测成为可能。通过在采样点保持DNA完整性并在现场生成结果，这种方法降低了物流障碍，提升了数据质量，并促进了快速决策。未来的应用可能包括公共卫生中的病原体监测、生物修复进展监测，或水系统中的微生物风险评估。经过少量修改，该平台可持续适应更多分子靶点和新兴的qPCR检测方法。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5/16英寸硅管	亚马逊（www.amazon.com）	796753613221	替代型号可能也可以接受
冷却器	Staples（www.staples.com）	24299978	替代型号可能也可以接受
DNA分离现场套件	微生物洞察公司及nbsp;	https://microbe.com/bio-extract/	专有
现场qPCR单元及附件	微生物洞察公司及nbsp;	https://microbe.com/fieldquant/	专有
手套	亚马逊（www.amazon.com）	这取决于大小	替代型号可能也可以接受
地下水过滤器	微生物洞察公司及nbsp;	https://microbe.com/wp-content/uploads/2025/08/MI-Sampling-US-01.02-bio-flo_dna_mi.pdf
冰	本地便利店	匿名
Kamoer DIP1500蠕动泵 24 V 1500 mL/min 高功率	亚马逊（www.amazon.com）	701705886813	替代型号可能也可以接受
尖嘴钳	亚马逊（www.amazon.com）	762983170575	替代型号可能也可以接受
纸巾	Staples（www.staples.com）	2126874	替代型号可能也可以接受
安全眼镜	亚马逊（www.amazon.com）	B0BNHKWR6W	替代型号可能也可以接受
Sharpie细尖马克笔	亚马逊（www.amazon.com）	71641300033	替代型号可能也可以接受