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使用生物提取野外试剂盒和野外qPCR仪进行现场微生物DNA分析

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DOI：

10.3791/69713

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2026年1月2日

 ,  ,  , 
1Microbial Insights, Inc.

本文内容

摘要

可靠且准确的现场可部署DNA分析方法对许多行业至关重要。本文提供了两种用于野外环境微生物分析的方法：1）利用生物提取野外试剂盒从环境样本中分离微生物DNA；2）通过野外qPCR仪进行DNA分析。

摘要

随着定量PCR（qPCR）在各行业中的广泛应用，能够在偏远地区进行DNA提取与分析，并克服后勤障碍的能力正变得至关重要。一个明确的例子是，在发生列车脱轨或石油泄漏等事故的偏远现场，需要简便的工具来定量污染物降解细菌，从而及时评估风险和环境影响。为可靠实现这一目标，相关流程必须具备便携性和轻量化特点，操作对非专业人员友好，抗污染能力强，并能在保持严格质量控制的同时快速获得结果。尽管多年来已存在多种适用于实验室外的核酸提取和qPCR分析方案，但直到最近，技术进步才推动了可部署于野外、且性能可靠准确的系统的发展。本研究展示了在真实环境条件下，使用野外DNA提取试剂盒结合便携式qPCR仪器的操作方法。在约30 °C的室外常温下开展的野外试验表明，所获得的DNA产量和扩增效率与在受控实验室环境中得到的结果相当。尤为重要的是，野外获得的结果在灵敏度和可重复性方面均表现出同等水平，证实便携式工作流程无需依赖传统实验室基础设施即可提供高质量数据。这些发现凸显了分子分析去中心化的潜力，使qPCR技术得以拓展至偏远及资源有限的地区，同时保持决策所需的准确性与可靠性。

引言

在进行分子生物学分析（如qPCR）时，样品管理存在若干局限性。一个明显的例子是，在受火车脱轨或石油泄漏影响的偏远地区，需要简单可靠的工具来定量污染物降解细菌，以支持对环境风险和影响的及时评估1,2,3,4,5。主要限制在于，无论样品保存得多低温，微生物群落仍会随时间发生（且必然发生）变化6,7。为确保数据能准确反映样品采集地的原始环境状况，建议在采样后24小时内完成DNA提取8。然而，对于在海上石油平台采集微生物样品的工程师，或深入雨林腹地开展研究的科学家而言，这一时间要求是不可行的。将水样或土样从这些偏远地点在同一天内送至运输公司，再连夜运送到实验室（全程需保持冷藏），并在分析前完成DNA提取，实际上是无法实现的。

一旦提取出 DNA，时间的影响便停止了，只要采用适当的保存技术，样本的全部遗传信息便可无限期地保存下来9。这使得提取的 DNA 与绝大多数化学、冶金和生物样本相比具有极高的独特性——因为后者大多具有有限的保质期。存档的 DNA 可在数年甚至数十年后被重新获取，并在新的检测平台上针对新的目标进行分析。因此，确保提取的 DNA 真实反映原始微生物群落，而非因运输延迟而发生改变的群落，至关重要。

此外，样本的提取和分析需要依赖实验室，这在很大程度上限制了采样项目的灵活性和一致性。仅物流成本就可能使某些项目难以开展10。若能在采样后数小时甚至数分钟内对样本进行分析，准确定量目标遗传物质，将为全球范围内的环境研究项目带来诸多机遇。

方案

注意：以下实验方案使用生物提取试剂盒（生物样本提取野外试剂盒）和FieldQuant qPCR（基于野外的qPCR）完成。

1. 利用封装式滤膜和生物提取野外试剂盒从地下水中采集生物量样本及DNA分离方案

  1. 在步骤1的所有操作中均需佩戴手套和安全眼镜。
  2. 准备蠕动泵和管路，按照美国环境保护署（EPA）地下水采样指南，使用标准体积冲洗法对井进行冲洗。11.
  3. 移除所提供的离心管中的滤芯、接头、夹子及管帽图1).
  4. 将导管（1/4-5/16 英寸）穿过 内径 [I.D.]）穿过所提供的夹具，并拧紧夹具以将软管固定在锁定鲁尔接头（图2).
  5. 将滤器的入口连接到上一步中安装的鲁尔锁紧接头。
  6. 将滤膜置于接收容器内，以便准确测量过滤的水量。
  7. 使用低流速过滤最多1升水（<0.5 L/min）。过滤的水量将根据水的浊度而变化。
    1. 如果在过滤达到1 L之前滤膜堵塞，请停止过滤并继续下一步操作。
      注意：DNA分析具有高灵敏度，仅需10 mL样品即可进行，具体用量取决于系统的生物量。
  8. 手动记录通过滤膜的滤液体积（单位：毫升，mL）。弃去滤后水样。
  9. 将滤器两端盖紧。确保较细的一端用红色盖子封闭，较粗的一端用白色鲁尔锁紧接头堵头封闭。
  10. 将滤膜放回所提供的塑料管中。
  11. 将标签贴在离心管上，并注明通过滤膜的水量、采样地点、采样日期及要求的分析项目。在提取前于1-4 °C保存。
    注意：滤膜必须在采样后24小时内进行提取。
  12. 使用随附的酒精消毒湿巾，清洁一个可用于放置提取操作的平坦表面（例如木板、卡车尾板等）。
  13. 为了提取DNA，将生物提取野外用试剂盒的所有组分平铺在平坦、洁净的表面上（图3).
    1. 打开滤器两端的盖帽，并将盖帽妥善放置以备后续使用。找到试剂盒中提供的一个3 mL注射器并打开。将空气吸入3 mL注射器中，然后通过锁定式鲁尔接头将其连接至滤器。
    2. 将注射器中的空气推出，以将滤膜中残留的水分全部排出。断开注射器，重新吸入空气，然后重复上述操作。
    3. 重复数次，确保尽可能将滤器中的水排出。重新盖上红色出口盖。
  14. 将封闭的A溶液注射器倒置数次，确保充分混匀。取下鲁尔锁式注射器帽。
  15. 将溶液A的注射器通过鲁尔锁扣接头连接至封装的0.2 µm滤器入口，缓慢推动活塞，将全部溶液A加入。推进过快可能导致反压形成，因此务必缓慢下压活塞。如果滤器堵塞导致溶液A无法加入，可取下滤器的红色出口帽后再次尝试。操作完成后重新盖上滤器帽。
  16. 用力手动振摇密闭滤器5分钟。
    注意：为防止疲劳，可预先制备多个样本至该步骤，随后可同时手动振摇。如有条件，可使用可充电涡旋混合器代替手动振摇完成此步骤。
  17. 将封闭的B溶液注射器倒置数次，确保充分混匀。取下注射器上的鲁尔锁帽。
  18. 取下封装滤器入口盖帽。通过鲁尔锁扣尖端将溶液B注射器连接至封装滤器入口，缓慢推动活塞，加入全部溶液B。推进过快可能导致反向压力形成，因此务必缓慢下压活塞。重新盖上滤器入口盖帽。
  19. 用力手动振摇密闭滤器5分钟。
    注意：为防止疲劳，可将多个样本同时处理至该步骤，并同时进行手动振荡。如有条件，可使用可充电涡旋混合器代替手动振荡完成此步骤。
  20. 移除进样口盖帽。
  21. 将滤器倒置，使用连接在封装滤器单元上的3 mL注射器向滤器内推入1 mL空气，然后回拉活塞，尽可能排出裂解液（液体）。
    注意：如果裂解液特别黏稠，可能需要反复推拉活塞数次，才能将溶液从滤膜中完全移出。
  22. 将裂解液加入一个5 mL珠管中。盖上管盖，并用封口膜密封管口。
  23. 用力手摇试管5分钟。将试管直立放置，继续后续步骤。
    注意：为防止疲劳，可预先制备多个样本至该步骤，并同时进行手动振荡。如有条件，可使用可充电涡旋混合器代替手动振荡完成此步骤。
  24. 在避免污染箔膜顶部的情况下，将样本制备柱置于平坦表面上。
  25. 从包装中取出1 mL注射器，并将鲁尔锁式柱拧到注射器末端。使用柱的尖端在样本制备卡盒的第一节上刺出两个孔。
    警告：部分 cartridge 含有变性盐和/或乙醇。请佩戴手套和护目镜。
  26. 使用塑料刻度移液管，将1 mL裂解液（仅液体部分，尽量避免转移磁珠）从珠管转移至第一个样本制备卡盒部分新打的孔中。为获得最佳效果，将裂解液加入铝箔孔中时，应缓慢倾斜移液管进行加样。
  27. 将注射器柱重新插入卡盒的红色部分。将液体完全吸入注射器，然后推出。重复此抽吸操作10次。
  28. 将注射器中的所有液体推回至 cartridge 的红色部分，然后再进行下一步操作。在样本DNA分离方案的后续每一步中，均不得将液体从一个区域转移至另一个区域。
  29. 将注射器-柱组合的尖端置于红色-橙色区域上方，刺穿铝箔屏障形成两个孔。用活塞将全部液体抽吸至注射器顶端，然后完全推出。重复此步骤一次，共进行2次抽吸-推出循环，每次均需将所有液体彻底推出。后续步骤中无需转移任何液体。
  30. 将注射器柱的尖端置于橙色区域上方，刺穿铝箔屏障形成两个孔。用活塞抽吸，使全部液体吸入注射器内，再完全推回。此步骤无需转移任何液体至下一步。
  31. 将注射器-柱的尖端置于黄色区域上方，穿过铝箔屏障穿刺两次。使用活塞将全部体积的液体吸入注射器，然后完全推回。此步骤中的液体不转入下一步。
  32. 将注射器-柱的尖端置于蓝色空气干燥区上方，仅穿刺铝箔屏障一次。用活塞将整支注射器体积的空气吸入，然后迅速推出。快速重复此抽吸动作至少20次，直至柱体看起来干燥。
  33. 将注射器-柱的尖端置于末端绿色部分上方，穿过铝箔屏障两次。用活塞将全部体积的液体吸入注射器，然后完全推出。重复此步骤，共进行5次抽吸。
  34. 使用1 mL注射器和样品制备柱，将绿色区域中的全部溶液转移至标记清晰的1 mL微量离心管中——此即野外提取的DNA样品。样品可在1–10 °C条件下保存最多一周或直至使用，可置于冰袋或冰盒冷却的保温箱内，或存放在冰箱中。
    注意：DNA 样本可于 -20 °C 长期保存，无保存期限限制。

2. 使用便携式 qPCR 设备进行野外 qPCR 分析的实验方案

注意：现场用 qPCR 仪器及其控制手机均依赖可充电电池。在前往现场前，请确保两者均已充满电。

  1. 将最多三个野外提取的DNA样本放入托盘的纯样本槽中。确保每个区域放置一个样本：一个样本放入第1、2或3号槽，一个样本放入第4、5或6号槽，一个样本放入第7、8或9号槽。
  2. 将每个样本的检测试纸条放入托盘上对应的A、B或C试纸条槽中。将试纸条上的第一个孔与托盘上的第一个槽对齐。
  3. 解锁手机并打开以注册商标qPCR仪器命名的应用程序。手机与野外qPCR设备通过集成的短距离无线技术连接。应用程序打开后，点击 开始运行 按钮。
    注意：该应用程序已预装在附带的手机上，无法在其他地方下载。
  4. 在下一个界面中，点击 生成ID 按钮。
  5. 在接下来的界面中输入每个样本的样本信息；点击 样本ID 下方，输入样本名称。
    1. 点击 样本单位 ，选择提取过程中所用样本类型的合适体积单位（克 [g]、毫升 [mL] 或拭子）。
    2. 然后点击 样本量 下方，输入上述野外提取中所用样本的体积（例如，过滤的水样毫升数）。对剩余两个样本重复此步骤。
    3. 完成所有样本信息输入后，点击 继续 按钮。
      注意：若使用少于3个样本，请将样本ID保留为默认值，任意选择一个单位，并在未使用的样本的样本量栏中输入“1”以继续操作。
  6. 在下一个界面中，点击文件夹。进入下一界面后，点击 保存至当前文件夹。
  7. 在下一个界面中输入运行名称，然后点击 确认。
  8. 按下仪器左上角的 电源 按钮并持续按住，直到仪器正面的所有指示灯亮起（约5秒）。然后在应用程序中点击 确认 以继续。
  9. 在下一个界面中，点击通过集成短距离无线连接。按下仪器顶部的 集成短距离无线 按钮（一个常见的注册商标符号），直到蓝色指示灯开始闪烁。点击 确认，等待应用程序与仪器同步完成。同步成功后，在应用程序中点击 仪器名称 以选中该设备，然后点击 连接 按钮，进入加载试纸条的步骤。
    注意：如果仪器与应用程序首次未能同步，请确保仪器上的集成短距离无线指示灯仍在闪烁，然后再次点击扫描。
  10. 在取下试纸条盖帽前，请检查冻干颗粒是否位于任何试纸条孔的顶部。如果存在，请轻轻弹击孔底部，使颗粒下沉至孔底。
  11. 取下第一个样本的go试纸管盖帽。向试纸条的第一个孔中加入18 µL无菌水，并轻轻吹打数次以溶解颗粒。对剩余两个孔重复此操作。
  12. 向每个孔中加入2 µL样本，并通过将一组带缺口的橡胶试纸条盖帽插入管中进行密封，确保盖帽之间的缺口朝向托盘后方。如有必要，对剩余样本重复步骤2.10–2.12。所有试纸条填充并用盖帽密封后，在应用程序中点击 确认。
  13. 每次取出一个试纸条，检查各孔底部是否存在气泡。若孔底有气泡，请轻轻前后摇动试纸条，使气泡上升至孔顶部。检查完所有孔后，在应用程序中点击 确认，然后继续将试纸条装入仪器。
  14. 打开仪器盖板，将试纸条按其在托盘上的相同顺序和方向放入野外qPCR仪器中，确保孔的铰链和盖帽间的缺口朝向仪器后方。所有试纸条放入后，轻轻下压盖板直至其锁定到位，然后点击 确认。
  15. 在应用程序中点击 开始 运行按钮。
    注意：运行将开始，并在预设运行条件下约需45分钟完成。这些条件不可编辑。
  16. 运行结束后，点击 邮件发送结果。当手机连接到Wi-Fi后，结果将被发送用于分析和报告；在此之前，结果将存储在仪器中。
    1. 连接Wi-Fi后，用户需再次点击 发送 按钮以发送结果。
  17. 每次运行之间应清洁托盘，以避免样本间交叉污染。
    注意：输出结果为一个包含每个孔的循环阈值（Ct）的Excel文件。这些结果将被发送至实验室，由实验室检查扩增质量，并根据每个qPCR靶标的经验证标准曲线，结合原始样本的体积和基质，将Ct值转换为丰度。最终结果将以电子文件形式及PDF格式发送给用户。

结果

采用生物提取野外试剂盒以及先前描述的一种高度验证的实验室方法4，对代表性环境样品进行了DNA提取。如图4所示，通过将qPCR结果与高度验证的实验室提取方法进行比较，证实了使用该野外试剂盒成功完成了DNA分离。这一致性结果表明，该方法在野外条件下有效保持了环境样品中DNA的完整性。

现场qPCR试剂盒的组分如图5所示。使用现场qPCR仪对Dehalococcoides（DHC）的标准培养稀释液在室内（21 °C）和室外（30 °C）温度下进行了分析，以说明该仪器在真实野外条件下的稳定性。结果如图6所示，显示了每组10次重复实验的偏差极小。为提供完整背景信息，DHC是一种能够降解氯化溶剂的微生物，在环境修复行业中通常通过qPCR对其进行定量4。

为验证仪器的精确性，使用10台现场qPCR仪器对DHC在三种不同浓度下进行分析，每组实验均设置两个重复（图7）。即使在低丰度条件下，所有运行中的相对标准偏差仍保持较低水平（低于5%）。需要注意的是，与标准偏差相比，相对标准偏差对于对数数据更为重要，因其通过以下公式对结果进行归一化处理：

相对标准偏差公式，RSD=σ/μ×100%，用于统计数据分析。

其中，RSD 为相对标准偏差，σ 为数据集的标准偏差，µ 为数据集的均值。

综上所述，本文中的两种方法在重复的野外提取和qPCR检测中均能提供可重复的结果。野外与实验室提取及qPCR分析结果的一致性表明，无需依赖实验室基础设施即可获得可靠且高质量的数据，从而使得微生物分析能够在偏远或资源有限的环境中进行。

色谱装置组件：用于蛋白质纯化实验的管子、接头和夹具。
图1：封装式滤器套件组件。 封装式滤器用于将生物量从水样中过滤出来。通过管路连接至蠕动泵，使水样流经过滤器。记录总取水量后，弃去滤液，滤膜上截留的生物量即可用于DNA提取。组件包括：a. 无菌管，用于使用前后盛放滤器及相关组件；b. 进样端盖；c. 软管夹；d. 鲁尔锁式管路连接适配器；e. 封装式滤器；f. 橡胶出样端盖。图片经 Microbial Insights, Inc. 授权使用12。 请点击此处查看该图的放大版本。

带鲁尔锁接头和滤器的过滤装置；软管和夹具组件示意图。
图 2：滤器与管路连接。 将管路推入鲁尔锁式管路连接适配器，并用软管夹固定。管路的另一端连接至蠕动泵（该连接及泵的操作不在本实验方案的范围内）。图片经 Microbial Insights, Inc. 许可使用12。 请点击此处查看此图的放大版本。

DNA 提取过程；实验设备设置：注射器、小瓶、用于纯化实验的移液器。
图 3：DNA 分离野外试剂盒组件。所有组件在使用前均为无菌状态。组件包括：(1) 封装式滤膜试剂盒（详见 图 1），(2) 3 mL 注射器，(3) 预装溶液 A 的 1 mL 注射器（带盖），(4) 预装溶液 B 的 1 mL 注射器（带盖），(5) 3 mL 注射器，(6) 硅胶珠管，(7) 安装有分离柱的 1 mL 注射器，(8) 1 mL 一次性转移移液器，(9) DNA 分离样品制备卡盒，(10) 1.5 mL 微型离心管。图中未显示：用于振荡过程中密封的封口膜方块，以及用于清洁提取操作台面的酒精擦拭片。图片经 Microbial Insights, Inc. 授权使用12。请点击此处查看该图的放大版本。

显示样品A和B中细胞浓度比较的柱状图；Bio-Extract与实验室方法。
图4：使用实际样品进行的现场提取方法比较。 采用实验室方法（红色柱）与生物提取现场试剂盒（蓝色柱）从两个代表性样品中分离DNA的qPCR结果对比。这些样品未进行重复分析，这与标准qPCR分析中的常规做法不同。两种方法在数量级范围内显示出各基因靶标（x轴）的丰度（y轴）。由于具体每个基因靶标的信息不在本文研究范围内，故未予提供。请点击此处查看该图的放大版本。

用于DNA分析的实时PCR实验设置，配备热循环仪和触摸屏界面。
图5：现场用qPCR仪器及其组件。组件包括：A. 现场用qPCR仪器，B. 样品制备托盘，C. 含有冻干试剂的检测条，D. 预装运行仪器所需应用程序的手机。图片经Microbial Insights, Inc.许可使用12。请点击此处查看此图的放大版本。

比较不同重复样本中21°C和30°C下DHC细胞浓度的柱状图。
图6：现场qPCR检测稳定性的验证。 在室外（30 °C，红色柱）和室内（21 °C，蓝色柱）温度条件下对Dehalococcoides（DHC）标准品进行了10次重复分析，结果表明该仪器适用于现场检测。横轴列出重复运行编号，纵轴列出计算得到的DHC丰度。室内（20 °C）均值为4.92 × 10² cell/mL，标准差（SD）= 1.14 × 10² cells/mL（n = 10）；室外（30 °C）均值为5.89 × 10² cells/mL，标准差（SD）= 1.80 × 10² cell/mL（n = 10）。20 °C与30 °C下测得的结果无显著差异（Welch's t检验，p = 0.17）。请点击此处查看该图的放大版本。

显示不同RSD百分比下DHC重复实验中精密度的柱状图，用于数据分析。
图7：现场qPCR精密度的验证。在三个不同标准浓度下，10台不同仪器分别进行双重复实验所表现出的精密度性能。横轴列出真实值及重复次数（每种标准浓度下10台仪器，n = 2），不同颜色的柱形对应不同的现场检测单元。纵轴显示每次运行所计算出的丰度值。各标准浓度的相对标准偏差百分比（%RSD）以柱形上方的虚线标示。请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

本方案的一个关键特征是，它能够在野外条件下进行微生物DNA提取和qPCR分析，而无需实验室基础设施或电力供应12。该方法已在便携性与可靠性之间进行了优化，在不同环境温度下于户外操作时，仍可提供与基于实验室的流程一致且可重复的结果12。建议使用温度范围为4 °C至95 °C（39 °F至104 °F），野外工作团队在标准室外温度（30 °C，86 °F）下进行的并行对比显示结果具有可靠的重复性（图6）。这种一致性对于确保野外结果能够与实验室数据集进行联合解读至关重要。

确保实验方案成功的关键步骤包括：在提取过程中，必须彻底去除滤膜中的液体，并充分混匀试剂，以保证高效的细胞裂解和DNA回收。同样，在将裂解液转移至样本制备柱时，需小心操作，尽量减少磁珠的带入，这是防止堵塞或层析柱失效的关键。若出现异常，可采取的故障排除策略包括减慢活塞下压速度以降低反向压力，或在裂解液黏稠导致液体流动受阻时重复使用注射器抽吸。对于qPCR实验，避免反应孔中产生气泡，并确保沉淀物完全重悬，是实现准确扩增的关键。

尽管该方法具有优势，但也存在局限性。DNA 产量可能低于使用台式离心柱法试剂盒所获得的产量，且高度浑浊或富含有机物的样品可能影响柱的性能。虽然核酸分离试剂盒操作简单，任何人都可轻松使用——包括无任何实验室经验的使用者——但与经验不足的人员在野外操作时，出错的风险会相应增加。此外，尽管现场 qPCR 设备可快速获得结果，但其同时进行的反应数量有限（目前每次运行最多检测 9 个基因靶标），相较于标准的热循环仪仍显不足。然而，这些局限性被其分析速度快以及能够在野外获取微生物群落特征的能力所弥补。除提供该设备的实验室目录所限外，qPCR 检测靶标本身并无内在限制。

该方法的重要性在于其能够开展分子分析，实现在油田、农业场所或偏远生态系统等环境中对微生物群落的实时监测。通过在采样点保持DNA完整性并进行现场检测，该方法降低了后勤障碍，提高了数据质量，并实现了快速决策。未来应用可能包括公共卫生领域的病原体监测、生物修复进程的监控，或水系统中的微生物风险评估。经过少量修改，该平台可持续适应其他分子靶标和新兴的qPCR检测方法。

披露

作者受雇于 Microbial Insights，该公司拥有 FieldQuant 和 Bio-Extract 的知识产权。

致谢

本工作的资助和支持由 Microbial Insights, Inc. 提供。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
5/16" 硅胶管Amazon (www.amazon.com)796753613221可接受替代型号
保温箱Staples (www.staples.com)24299978可接受替代型号
DNA 提取野外试剂盒Microbial Insights, Inc. https://microbe.com/bio-extract/专有产品
便携式 qPCR 仪及配件Microbial Insights, Inc. https://microbe.com/fieldquant/专有产品
手套Amazon (www.amazon.com)取决于尺寸可接受替代型号
地下水过滤器Microbial Insights, Inc. https://microbe.com/wp-content/uploads/2025/08/MI-Sampling-US-01.02-bio-flo_dna_mi.pdf
冰块当地便利店NA
Kamoer DIP1500 蠕动泵 24 V 1500 mL/minAmazon (www.amazon.com)701705886813可接受替代型号
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纸巾Staples (www.staples.com)2126874可接受替代型号
护目镜Amazon (www.amazon.com)B0BNHKWR6W可接受替代型号
Sharpie 细头记号笔Amazon (www.amazon.com)71641300033可接受替代型号

参考文献

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