本方案描述了包载辣椒素的α-乳白蛋白纳米胶束可溶性微针贴片的制备方法。该方法提供了一种可重复、微创的透皮递送技术，可将疏水性生物活性物质靶向递送至脂肪组织，实现有效的局部减脂，有望拓展其在肥胖管理中的应用。
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方法文章
制备负载α-乳清蛋白纳米胶束的可溶性微针贴片用于辣椒素经皮递送及脂肪组织减少
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
本方案概述了含有α-乳白蛋白纳米胶束的可溶性微针（MN）贴片的制备及其应用，用于将辣椒素靶向递送至脂肪组织。该过程首先对α-乳白蛋白进行部分酶法水解，生成具有两亲性的肽段，这些肽段可自组装形成包裹疏水性化合物辣椒素的纳米胶束。将载有辣椒素的纳米胶束与透明质酸（HA）和聚乙烯醇（PVA）基质混合后，浇铸至聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具中，并通过离心处理制备成10 × 10的微针阵列。经真空干燥后，微针具备足够的机械强度以穿透皮肤，并在施用后约30分钟内完全溶解。代表性结果包括扫描电子显微镜图像，证实微针形态均匀；共聚焦显微镜图像，验证其皮肤穿透能力及药物释放效果；以及在高脂饮食（HFD）小鼠模型中的体内实验，显示脂肪质量减少、代谢活性增强以及脂肪组织褐变的诱导。本方案提供了一种可重复且微创的疏水性生物活性物质经皮递送方法，为肥胖症的治疗提供了有前景的策略。该方案已优化以确保可重复性，且适用于其他疏水性生物活性物质的递送系统开发。
引言
肥胖已成为全球最紧迫的健康挑战之一，在发达国家和发展中国家的患病率持续上升。根据世界卫生组织的数据，2016年有超过6.5亿成年人被归类为肥胖；2022年，约43%的18岁及以上成年人超重，16%患有肥胖症1。肥胖与代谢综合征、心血管疾病、2型糖尿病以及多种癌症密切相关，给社会经济和医疗系统带来沉重负担2,3。目前的治疗策略，包括饮食限制、运动、药物治疗和减重手术，仅能提供部分且常常是短暂的效果。这些方法常因患者依从性差、长期疗效有限、侵入性高以及不良反应明显而受限4,5。因此，迫切需要开发安全、有效且患者依从性高的局部化治疗方法来管理肥胖。
天然生物活性化合物因其多靶点作用和普遍良好的安全性而作为抗肥胖剂受到越来越多的关注。例如，芦丁是一种黄酮醇苷，可通过抑制脂肪生成相关转录因子并促进线粒体生物合成，发挥抗脂质生成和代谢调节作用。6辣椒素是辣椒中的辛辣成分，据报道可增强能量消耗，诱导白色脂肪组织褐变，并抑制脂质积累 通过 瞬时受体电位香草素1（TRPV1）信号通路的激活7,....
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方案
所有动物实验均按照《实验动物护理与使用指南》进行，并经鲁东大学科学技术伦理审查委员会批准（批准号：LDU-IRB2025020011）。所用试剂和 设备列于材料表中。
1. 制备包载辣椒素的α-乳白蛋白纳米胶束12
- 将α-乳白蛋白溶于去离子水中，配制成浓度为6 mg/mL的溶液，并调节pH至7.4。使用磁力搅拌器在8–28 × g条件下搅拌，直至α-乳白蛋白完全溶解（通常需要20–30分钟）。
- 按酶与底物质量比1:100（w/w）加入枯草芽孢杆菌蛋白酶（BLP）。
- 在50 °C下孵育混合物30分钟，以生成两亲性肽段。
- 将溶液加热至95 °C并维持5分钟以终止反应，随后冷却至室温，并通过0.22 µm滤膜过滤。
- 将辣椒素溶于乙醇中，配制成浓度为1 mg/mL的溶液。在温和搅拌下，将辣椒素溶液逐滴加入肽溶液中。
- 继续搅拌2小时，使纳米胶束自发组装形成。
- 将混合物在去离子水中透析12小时（截留分子量3.5 kDa），每4小时更换一次透析液，以去除未结合的辣椒素。
- 将制备好的α-乳白蛋白纳米胶束进行冷冻干燥（冻干）。
- 采用透射电子显微镜（TEM）、动态光散射（DLS）和Zeta电....
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结果
纳米胶束的形态学与表征
透射电子显微镜（TEM）显示，α-乳白蛋白纳米胶束呈均匀分散的球形颗粒，粒径分布较窄（图1）。辣椒素包载后，颗粒平均直径从约22 nm增加至约30 nm，表明药物成功载入胶束核心。相应地，zeta电位从−16.8 mV略微变化至−20.3 mV，进一步证实了高效的包封效果以及表面性质的改变。
细胞摄取及对3T3-L1脂肪细胞脂质生成的抑制作用
使用Cy3标记的胶束进行共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察，发现纳米胶束在2小时内即可被3T3-L1前脂肪细胞快速且高效地摄取（图2A）。BODIPY染色显示，与未处理对照组和游离辣椒素相比，M(Cap)显著减少了细胞内脂滴的积累（图2B）。Western blot和qPCR分析表明，脂肪生成相关转录因子PPARγ和C/EBPα的表达显著下调，同时TRPV1.......
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讨论
本研究表明，载有包裹辣椒素的α-乳白蛋白纳米胶束（M(Cap)）的可溶性微针（MN）贴片可实现局部化、微创的抗肥胖效果。α-乳白蛋白纳米胶束能高效包载疏水性辣椒素，改善其水相分散性，并增强细胞摄取，与游离辣椒素相比，在3T3-L1脂肪细胞中更显著地抑制脂肪生成并促进线粒体生物合成。这些结果与先前研究一致，表明基于蛋白质的纳米载体可提高脂溶性营养素的生物利用度和细胞穿透能力11。
可溶解微针实现了高效的透皮递送。基于透明质酸/聚乙烯醇（HA/PVA）的微针具有均匀的锥体形态，并具备足够的机械强度以穿透皮肤，随后在约30分钟内溶解，满足了便于患者使用的关键要求。该系统表现出pH响应性释放特征，在pH约为6.5时辣椒素的释放速度较pH 7.4时更快，有利于药物在脂肪组织微环境中释放，同时有助于限制全身性泄漏，这与先前关于用于可控递送的可溶性微针的研究报道一致12,20。
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致谢
本项目得到国家自然科学基金青年科学基金项目（No. 32202024）、山东省自然科学基金青年科学基金项目（No. ZR2024QC103）、山东省重点研发计划（2025CXGC010803，2022CXPT022）、山东省家禽产业技术体系（SDAIT-11-10）以及中国烟台市教育局资助的产学研合作项目（宠物动物下一代疫苗平台研发）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3T3-L1 前脂肪细胞 | ATCC | CL-173 | 用于脂肪生成研究的细胞系 |
| 地衣芽孢杆菌蛋白酶（BLP） | Sigma-Aldrich | P5380 | 用于 α-乳白蛋白的酶法水解 |
| 辣椒素（≥98%） | Sigma-Aldrich | M2028 | 待包封的活性成分 |
| 离心机（≥4000 rpm） | Eppendorf | 5810R | 用于填充模具 |
| 共聚焦激光扫描显微镜（CLSM） | Zeiss | LSM 900 | 用于观察胶束分布与穿透情况 |
| Cy3 荧光染料 | GE Healthcare | PA23001 | 用于标记纳米胶束 |
| Cy5 或 Cy7 荧光染料 | Fanbo Biochemical，中国北京 | N/A | 用于生物分布成像 |
| Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基（DMEM） | Gibco（Thermo Fisher Scientific） | 11965-092 | 用于细胞培养 |
| 乙醇（≥99.7%） | 国药集团化学试剂有限公司 | 100092683 | 辣椒素的溶剂 |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco（Thermo Fisher Scientific） | 16000-044 | 用于细胞培养 |
| 高脂饮食（60% kcal 脂肪，D12492） | Research Diets，美国 | D12492 | 用于诱导小鼠肥胖 |
| 透明质酸 （HA，分子量 100–300 kDa） | 阿拉丁生化科技股份有限公司，中国 | H108124 | 用于微针制备的聚合物 |
| 异氟烷 | RWD，中国 | R510-22-10 | 麻醉剂 |
| 代谢笼系统 | Panlab，美国 | N/A | 用于评估活动量、耗氧量和呼吸商（RQ） |
| Milli-Q 去离子水 | Millipore | N/A | 溶剂 |
| MRI 系统 | NiuMag，中国 | MesoQMR23-060H-I | 用于测量体脂/瘦体质量组成 |
| PDMS 微针模具（10 × 10，600 μm 高度） | Blueacre Technology 或定制 | N/A | 用于微针制备 |
| 青霉素–链霉素 | Gibco（Thermo Fisher Scientific） | 15140-122 | 用于细胞培养 |
| 磷酸盐缓冲液 （PBS，pH 7.4） | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | 用于体外和体内研究的缓冲液 |
| 聚乙烯醇 （PVA，分子量 30–70 kDa） | 阿拉丁生化科技股份有限公司，中国 | P109389 | 用于微针制备的聚合物 |
| 扫描电子显微镜（SEM） | FEI Tecnai | G2 F30 | 用于表征微针形貌 |
| 质构分析仪 | 博辛科技，中国上海 | TA.XTC-20 | 用于测试微针强度 |
| 台盼蓝溶液（0.4%） | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | 用于观察微针插入位点 |
| 紫外–可见分光光度计 | PerkinElmer | Lambda 35 | 用于药物释放测定 |
| 真空烘箱/干燥器 | Thermo Fisher Scientific | N/A | 用于干燥微针 |
| Western blot 装置 | Bio-Rad | Mini-PROTEAN Tetra | 蛋白质分析 |
| α-乳白蛋白（≥95%） | Sigma-Aldrich | L6010 | 用于纳米胶束形成的蛋白来源 |
参考文献
- Obesity and overweight. WHO Fact Sheets. , World Health Organization. https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/obesity-and-overweight (2025).
- Bray, G. A., Kim, K. K., Wilding, J. P. H. Federation, W. O. Obesity: A chronic relapsing progressive disease process. A position statement of the World Obesity Federation.
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重印与许可
