方法文章

用于筛选的抗增殖斑块试验 体外 生物活性分子对抗 弓形虫（Toxoplasma gondii） 速殖子

DOI：

10.3791/69725

⸱

2026年1月23日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratório de Quimioterapia de Protozoários Egler Chiari, Departamento de Parasitologia - ICB, Universidade Federal de Minas Gerais

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究旨在介绍一种简单的噬斑测定方法，以辅助筛选新的生物活性分子 原虫的速殖子阶段 弓形虫（Toxoplasma gondii）.

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

弓形虫病是一种寄生虫感染，常与眼部病变和新生儿畸形相关。自20世纪50年代初以来，该病的一线治疗方案一直依赖磺胺嘧啶、乙胺嘧啶和亚叶酸的联合使用。在此之后的数十年中，仅有少数替代疗法被引入。这凸显了发现针对Toxoplasma gondii的新生物活性分子的迫切需求。由于该病原体为专性胞内寄生虫，传统的药物筛选通常需要昂贵的材料和设备，例如使用表达荧光蛋白或β-半乳糖苷酶的寄生虫进行检测。此外，光学显微镜定量等方法可能耗时较长。蚀斑试验是一种通过测量寄生虫裂解周期所破坏的细胞单层中破坏区域的数量和面积，来评估胞内病原体增殖强度的方法。本研究描述了一种优化的蚀斑试验方案，专为体外筛选抗T. gondii速殖子活性分子而设计。该方案使用低成本材料和简单的实验装置，能够快速获得可重复的结果，有助于各研究团队高效识别针对该寄生虫的新活性化合物。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

弓形虫病是一种人畜共患疾病，在全球范围内呈异质性分布，影响约三分之一的世界人口1,2。该疾病的症状与宿主的免疫状态及寄生虫的复制程度相关3,4。急性期以速殖子阶段的复制为特征，在免疫功能正常个体中通常无症状5,6。相比之下，免疫功能低下者症状更为常见，包括全身不适、发热等非特异性症状，以及脑炎和视网膜脉络膜炎6,7,8。尽管该病具有重要的临床意义，但目前可用的治疗手段对弓形虫（Toxoplasma gondii）的缓殖子阶段（慢性期）无效，也无法实现寄生虫学治愈。现有药物的不良反应也降低了患者的治疗依从性9,10,11。因此，亟需寻找更安全、更有效的弓形虫病新疗法。

新药的研发需要经历漫长的时间，投入数十亿美元的资金，并涉及多个研究阶段。由于药物研发成本高昂，制药行业需要提前筛选出最优的候选药物12,13,14,15。在药物筛选过程中，可采用多种方法，包括计算机模拟（in silico）方法、人工智能技术，以及最常用的方法——生物学方法16,17,18,19。体外生物学筛选涉及使用分子文库（chemolibraries），以提供可用于识别生物活性的分子20,21,22。由于这些化学文库包含多种多样的分子，因此有必要优化资源和时间。因此，斑块实验（plaque assay）可作为一种快速筛选针对多种病原体（如T. gondii）的新生物活性分子的方法。

空斑试验是一种 体外 利用细胞内病原体的裂解周期来定量细胞单层中病原体浓度的方法，随时间推移形成坏死性蚀斑23最早使用蚀斑测定技术的研究可追溯到20世纪下半叶初期，当时Renato Dulbecco团队利用感染了西方马脑脊髓炎病毒的鸡成纤维细胞单层，证明了所形成的坏死蚀斑数量与病毒浓度之间的正比关系。16该技术在 T. gondii 也已被充分描述，正如Ufermann及其合作者先前阐明的那样23.

Roberts 等人于 1976 年进行了一项早期研究，首次采用蚀斑实验观察不同浓度分子对T. gondii抑制作用的反应17。尽管蚀斑实验广泛用于病毒滴定16,24，但仅有少数研究团队将其用于评估分子的抗T. gondii活性21,22,25,26,27。为了寻找一种可用于高通量筛选化合物文库、使用廉价材料且实验装置简单的检测方法，本研究探索了将蚀斑实验作为常规实验室药物筛选的替代方案。由此建立了一种优化的实验流程，可利用简单材料和图像采集系统同时评估多种分子的活性，获得快速且可重复的结果。因此，本文描述了经本实验室验证的详细实验方案，以协助其他研究团队筛选针对T. gondii速殖子的新生物活性分子。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

寄生虫和细胞培养物的操作以及废弃物的处理和处置均按照巴西国家卫生监督局（ANVISA）RDC nº 222/2018号法规所要求的巴西法律法规进行。所有操作均由米纳斯吉拉斯联邦大学生物医学科学研究所（ICB-UFMG）的内部生物安全委员会（CIBio）监督。本研究未涉及动物、人类或转基因生物的使用。本工作得到了CNPq、CAPES和FAPEMIG基金的资助。ESMD（CNPq 308082/2023-0）和RWAV（CNPq 305574/2021-3）为CNPq生产力研究员。所用试剂和设备列于材料表中。

1. 配制添加物的 RPMI-1640 培养基

注意：RPMI-1640 培养基最初是为悬浮和单层培养人白血病细胞而开发的。然而，后续研究表明，该培养基也适用于多种哺乳动物细胞的培养。

  1. 向含有 250 mL RPMI-1640 的瓶子中加入 2.5 mL 200 mM L-谷氨酰胺（100 倍浓度）。
  2. 向培养基中加入 2.5 mL 抗生素-抗真菌素溶液（100 倍浓度）。
  3. 接着，向含有 RPMI-1640 的瓶子中加入 5.0 mL 或 25 mL 胎牛血清（FBS）（终浓度为 2% 或 10% FBS）。
  4. 储存于冰箱中（2–8 °C）。

2. PBS（1x）的配制

注意：在 pH 7.2 和 25 °C 条件下配制 1 L 磷酸盐缓冲液（PBS），请按照以下步骤操作。

  1. 分别称取以下质量的盐：1.4 g Na2HPO4、0.24 g KH2PO4 和 8.5 g NaCl。
  2. 将称量好的盐分别加入盛有 800 mL 去离子水的 1 L 烧杯中，搅拌至所有盐完全溶解。
  3. 使用 pH 计测量溶液的 pH 值，应为 7.2。如有必要，使用 6 M 盐酸或 3 M 氢氧化钠调节 pH 至 7.2。
  4. 用玻璃棒将上述溶液定量转移至 1 L 容量瓶中。
  5. 向容量瓶中加入去离子水，直至总体积达到 1 L，确保液面弯月面与刻度线相切。
  6. 轻轻倒置容量瓶，混匀溶液。
  7. 将最终的 PBS 溶液分装至较小的玻璃瓶（100–250 mL）中。
  8. 在 121 °C、1.1 kg/cm2 条件下高压灭菌 15 分钟。
  9. 将 PBS 溶液储存于冰箱（2–8 °C）中。
    注意 1：所有实验均应使用 37 °C 的 PBS 溶液。

3. 4% 甲醛溶液的配制

  1. 将 35.68 mL 的 1x PBS 与 4.32 mL 的 37% P.A. 甲醛混合。
  2. 将溶液储存于塑料烧瓶中，室温（25 °C）保存。

4. 活性分子储备液的制备

注意：请检查分子在 DMSO、DMF、乙醇或水中的溶解度，并选择最合适的溶剂。为尽量减少稀释剂对寄生虫可能产生的毒性影响，储备液的浓度应至少比待测化合物的最高测试浓度高 1000 倍。例如，若最高测试浓度为 1 µM，则储备液浓度应至少为 1 mM。要配制 10 mM 的储备液，请按以下步骤操作：

  1. 使用精度为 0.0001 g 的分析天平称取待测化合物。
  2. 使用以下公式计算配制 10 mM 溶液所需的稀释剂体积：
    V (mL) = (Y MM) × 100
    其中：
    Y：化合物的质量（单位为毫克，mg）
    MM：化合物的摩尔质量
    V (mL)：溶剂的体积（单位为毫升）
  3. 将稀释剂加入盛有称量后化合物的容器中。
  4. 使用涡旋振荡器混匀。
  5. 将溶液分装成小份，于 -20 °C 冰箱中保存。
  6. 使用前，将分装溶液完全解冻，并再次使用涡旋振荡器混匀。
    注意：若需配制其他浓度的工作液，请使用以下公式：
    V (µL) = x mM × y µL/10 mM
    V (µL)：配制新溶液所需母液的体积
    x mM：新溶液的目标浓度
    y (µL)：新溶液的目标体积。

5. 细胞培养

  1. 将NHDF细胞小瓶轻轻在37 °C水浴中摇动以解冻细胞。
    注意：NHDF细胞可用人包皮成纤维细胞（HFF）或其他能形成稳定单层的细胞系替代。蚀斑试验仅适用于能形成稳定单层的细胞系，即细胞生长在接触时会停止增殖的细胞系。不表现出增殖抑制的细胞系（如肿瘤细胞系）不可使用，因为这些细胞会与寄生虫竞争培养基中的营养物质，并填补寄生虫形成的蚀斑区域。
  2. 立即将解冻后的细胞转移至含有10 mL添加物补充的RPMI-1640培养基（见步骤1）的15 mL锥形离心管中。
  3. 在室温下以200 × g 离心5分钟。离心结束后，应在管底可见细胞沉淀。
  4. 小心弃去上清液，以保留细胞沉淀。
  5. 用12 mL含10%胎牛血清（FBS）的补充RPMI-1640培养基重悬细胞沉淀，并接种至三个25 cm2培养瓶或一个75 cm2培养瓶中。2–3天后，使用倒置相差显微镜检查培养瓶，评估细胞增殖恢复情况（细胞汇合度应至少达到40%–50%）。
  6. 当细胞达到完全单层（100%汇合度）时，用巴斯德吸管吸出培养瓶中的培养基。弃去培养基和吸管。
  7. 向培养瓶中加入1–2 mL 1× PBS，静置1分钟，然后移除PBS。
  8. 向培养瓶中加入1 mL 0.05%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（trypsin-versene）溶液，并将其置于含5% CO2、湿度饱和、温度为37 °C的培养箱中孵育2分钟。
  9. 2分钟后，使用倒置显微镜观察细胞，确认细胞已脱落。
  10. 使用10 mL移液管和自动移液器，加入24 mL含10% FBS的补充RPMI-1640培养基重悬脱落的细胞。
    注意：每个长满单层的25 cm²或75 cm²培养瓶分别可传代至5个或15个新的25 cm²培养瓶中。
  11. 加入所需体积的培养基（24 mL）后，用移液管充分混匀细胞悬液。
  12. 将4 mL细胞悬液转移至每个25 cm2培养瓶，或将12 mL转移至每个75 cm2培养瓶。注意在原始培养瓶中保留4 mL细胞悬液。
  13. 将培养瓶置于含5% CO2、湿度饱和、温度为37 °C的培养箱中培养。
  14. 等待细胞形成完全单层（100%汇合度）。
    注意：请在每个培养瓶上标注日期和传代次数。

6. 培养板制备

  1. 使用倒置显微镜检查培养瓶中细胞单层的完整性（100% 汇合度）。
  2. 按照上述方法进行胰酶消化操作（步骤 5.7–5.9）。
  3. 使用 5 mL 血清移液管，用 4 mL RPMI 培养基重悬脱落的细胞，并转移至 15 mL 圆锥形离心管中。
  4. 在室温下以 200 × g 离心 5 分钟。
  5. 小心弃去上清液。
  6. 用 1 mL 新鲜 RPMI-1640 培养基重悬细胞沉淀。
  7. 使用涡旋振荡器混匀。
  8. 使用带无菌吸头的微量移液器，将 10 µL 样品转移至含有 490 µL 4% 甲醛溶液（1:50 稀释）的 1.5 mL 离心管中。
    注意：稀释倍数 = （总体积 (µL)）/（样品体积 (µL)）
  9. 安装血细胞计数板（Neubauer 计数室）。
  10. 使用涡旋振荡器将固定液与寄生虫（按步骤 6.8 制备）充分混匀。
  11. 取 10 µL 含固定寄生虫的溶液加入血细胞计数板中。
  12. 计数血细胞计数板的四个象限，每个象限包含 16 个小方格。
  13. 计算每毫升细胞数量：
    细胞数（每毫升）= [（每格细胞数）/4] × Fd × 104
    其中：
    Fd（稀释倍数）= 50
  14. 在 12 孔或 6 孔培养板的每个孔中，分别接种 5 × 104 或 1 × 105 个细胞，细胞重悬于含 10% FBS 的 1 或 2 mL RPMI-1640 完全培养基中。
  15. 将培养板置于含 5% CO2、湿度饱和、温度为 37 °C 的培养箱中培养。
  16. 等待细胞单层达到 100% 汇合度。

7. 速殖子 体外 培养

注意：对于蚀斑试验，我们推荐使用RH株 T. gondii.

  1. 使用巴斯德吸管弃去含有正常人真皮成纤维细胞（NHDF）完整单层（100% 汇合度）的 25 cm2 培养瓶中的旧培养基。随后，向培养瓶中加入 4 mL 新鲜的 RPMI-1640 完全培养基。
  2. 用移液器转移 5 µL 来自先前已裂解感染培养物培养瓶的新鲜裂殖释放的速殖子上清液。每 25 cm² 培养瓶加入 5 µL 可维持 6–7 天的裂解周期。
  3. 将新接种的感染培养瓶置于含 5% CO2、湿润气氛、温度为 37 °C 的培养箱中培养。

8. 速殖子定量

  1. 使用巴斯德吸管从含有新逸出寄生虫的培养瓶中移除培养基，并转移至15 mL锥形管中。
  2. 在室温下以760 × g 离心2分钟。离心结束后，可在管底观察到明显的沉淀。
  3. 小心弃去上清液。
  4. 用1 mL含2%胎牛血清的新鲜RPMI-1640培养基重悬寄生虫沉淀。
  5. 使用涡旋混合器均匀悬浮寄生虫悬液。
  6. 用带无菌吸头的移液器将10 µL寄生虫悬液转移至含有490 µL 4%甲醛溶液（1:50稀释）的1.5 mL离心管中。
  7. 按照步骤6.10至6.12所述操作。
  8. 确定每1 mL中的速殖子数量。
    注意：速殖子数量（每mL）= [（方格内速殖子数）/4] × Fd × 104
    其中：
    Fd（稀释因子）= 50

9. 化合物库中活性分子筛选的噬斑实验准备

注意：本实验旨在鉴定在 1 µM 浓度下可使T. gondii增殖减少超过 50% 的分子。在启动本实验之前，必须先进行细胞毒性实验（例如 MTS 法或 MTT 法），以确保蚀斑实验中所用化合物浓度对宿主细胞无毒性。

  1. 确认12孔板或6孔板中的细胞培养物已达到100%汇合度。
  2. 弃去旧培养基，分别向12孔板和6孔板的每孔中加入1 mL或2 mL含2%胎牛血清（FBS）的新鲜RPMI-1640完全培养基。
  3. 将待测化合物以目标浓度加入各孔中。初步筛选建议使用1 µM的浓度。
    注意：请使用以下公式计算每孔需加入的体积。
    V (µL) = （孔中终浓度 (µM) × 孔内体积 (µL)）/ 储存液浓度 (µM)
  4. 向每孔分别加入600个速殖子（用于12孔板）或1,000个速殖子（用于6孔板）的RH株虫体。
    注意：由于培养基、FBS供应商或所用细胞系的不同，寄生虫增殖情况可能存在差异。因此，建议先进行预实验，以确定各实验室条件下的最佳接种虫数。如有必要，请调整本实验所用虫体数量。
  5. 将培养板置于37 °C、5% CO2及湿润环境的培养箱中，静置培养7天，期间不得扰动。
    警告：在7天培养期间，不得移动或触碰培养板，否则实验将被破坏。

10. 使用结晶紫对平板进行染色及图像采集

  1. 7天后，从每个孔中移除培养基。
  2. 在室温下用1× PBS小心清洗每个孔。
  3. 弃去PBS，然后小心地向每个孔中加入1 mL 70%乙醇。室温孵育15分钟，随后弃去乙醇。
  4. 加入0.5%结晶紫水溶液，室温静置30分钟。
  5. 移除结晶紫溶液。
  6. 用去离子水小心清洗每个孔一次。
    注意：在洗涤步骤中移除培养基或PBS时，切勿用移液枪头接触孔底，以免破坏单层细胞的完整性。在洗涤过程中，切勿将PBS或乙醇直接喷射到细胞上，应沿孔壁四周充分加入。
  7. 将培养板倒扣在吸水纸上，以去除多余水分，并在室温下干燥24小时。
  8. 使用高分辨率平板扫描仪28,29或配置为考马斯亮蓝凝胶模式的成像记录系统21,22,30对培养板进行拍照。

11. 可逆性实验

注意：该可逆性实验的主要目的是 T. gondii 速殖子的目的是确定在从培养基中去除化合物后，经处理的寄生虫的增殖能力是否被完全抑制或降低。31.

  1. 按照步骤6所述方法，在6孔板中接种NHDF细胞。每孔加入重悬于2 mL含10% FBS的完全RPMI-1640培养基中的1 × 105个细胞。
    注意：当每孔细胞单层达到100%汇合度时，即可进行蚀斑试验。
  2. 弃去培养基，每孔加入重悬于2 mL含2% FBS新鲜培养基中的1 × 104个速殖子。
  3. 让速殖子与NHDF细胞作用1小时后，加入所选化合物，使其终浓度接近90%抑制浓度（IC90）。仅含药物溶剂的孔作为阳性对照。
  4. 将6孔板置于37 °C、5% CO2及湿润环境的培养箱中处理4天。
  5. 4天处理期结束后，用37 °C的1×PBS洗涤培养板3次，以确保完全去除化合物。
  6. 每孔加入不含化合物的2 mL新鲜培养基，继续在培养箱中培养额外7天。
  7. 按照步骤10所述方法，用结晶紫染色剂对培养板染色并拍照。

12. 使用 ImageJ 软件进行图像分析

  1. 使用 ImageJ 软件打开图像32。
  2. 使用椭圆选择工具选择对应一个孔的区域（图 1A、B）。
    注意：在进行选择时，忽略孔边缘存在缺陷的区域。这些缺陷通常出现在孔的边缘。
  3. 复制并创建新图像：按Ctrl + C复制所选区域；按Ctrl + N创建一个新的图像文件；使用Ctrl + V将复制的图像粘贴到新的黑色窗口中。
    注意：创建新图像时，请使用默认设置：8 位，用黑色填充，512 × 512 像素，单层（图 1C）。
  4. 导航至：图像 > 调整 > 阈值，或按Ctrl + Shift + T（图 1D）。
  5. 在“阈值”窗口中，选择Huang和Red选项，然后点击自动（图 1E）。
  6. 点击分析，然后选择分析颗粒（图 1F）。在弹出的窗口中保留默认选项，并点击确定（图 1G）。
  7. 将打开一个新窗口。复制%Area中显示的数值（在图 1H中以红色矩形高亮显示），用于计算寄生虫增殖或抑制的百分比。
  8. 对板上的每个孔重复上述步骤。
  9. 计算增殖百分比时，使用以下公式：
    增殖百分比 = （处理孔%Area / 对照孔%Area） × 100
  10. 计算抑制百分比时，使用以下公式：
    抑制百分比 = [1 - （处理孔%Area / 对照孔%Area）] × 100

ImageJ 软件；图像分析、阈值调整、颗粒分析；数据提取过程。
图 1：在 ImageJ 软件中逐步分析结果。（A）“椭圆”工具的选择。（B）在图像中选择感兴趣区域。（C）新建图像窗口（Ctrl + N），并设置推荐参数。（D）将感兴趣区域粘贴至新图像窗口后进行“阈值分析”的操作步骤。（E）在阈值窗口中选择 Huang 和红色选项，使所有白色区域被填充为红色。（F）执行“分析颗粒”功能的操作序列。（G）用于分析颗粒的参数设置。（H）总破坏面积百分比的结果显示在摘要窗口中。请点击此处查看此图的放大版本。

13. 统计分析

  1. 计算增殖抑制百分比后，将数据整理到 Office 软件的 Excel 电子表格中。
  2. 打开 GraphPad Prism 5.0 软件，点击 XY（位于“新建表格与图表”下方）。
  3. 在 Y 区域（位于“X：误差线”下方），输入数据重复次数（通常为三个生物学重复）。该数值可根据实际进行的重复次数而变化。
  4. 在图表旁边选择 仅均值，切勿选择“输入并绘制已从其他位置计算的误差值”，然后点击 创建。
  5. 将浓度数据置于 X 轴，将增殖抑制百分比数据填入 A、A:Y1、A:Y2、A:Y3、A:Y4、A:Y5 各列中。
  6. 点击 = 分析，然后点击 转换，再点击 确定。新窗口将打开。在此新窗口中，点击 使用 X = Log(X) 转换 X 值，然后选择 创建结果的新图表，再点击 确定。
  7. 点击 = 分析，然后点击 归一化。新窗口将打开。在 如何定义 0%？ 部分，点击并设置为 Y = 0.0；在 如何定义 100%？ 部分，点击并设置为 Y = 100；选择 百分比，然后点击 创建结果的新图表。
  8. 点击位于 = 分析 上方的符号：使用非线性回归拟合曲线。点击 剂量-反应 - 抑制，然后选择 log（抑制剂）vs. 归一化反应 - 可变斜率，再点击 确定。
    注意：将弹出一个窗口，显示以下结果：IC50（50% 抑制浓度）、95% 置信区间以及 R² 值。这些数值至关重要，应包含在文章的结果表格中。
  9. 若需估算其他抑制浓度，如 IC25、IC90 或 IC95，可使用链接（https://www.graphpad.com/quickcalcs/Ecanything1.cfm）中的 Quick Calcs - GraphPad 工具；EC 表示有效浓度。报告 Prism 软件为每种测试药物所得出的 IC50 和 Hill 斜率（HillSlope）值。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在处理后的蚀斑试验评估中，阳性对照（感染速殖子但未处理的细胞）和阴性对照（未感染细胞并添加0.1% DMSO）均至关重要。实验结束时，阳性对照孔应出现界限清晰的空斑区域，并残留部分贴壁细胞（图2）。相比之下，阴性对照孔应显示完整单层细胞，无任何空斑形成。阴性对照对于确认单层细胞的完整性以及整个实验过程中细胞的存活状态具有关键作用。阳性对照则作为计算受试化合物或药物对T. gondii增殖抑制率的参考依据；因此，必须存在界限清晰的蚀斑及部分残留的完整细胞单层，才能进行准确评估。在确认对照组结果符合预期后，再对处理组孔进行评估。

图2 显示了预期结果。可以观察到，阴性对照显示出完整保存的单层细胞，而阳性对照则在完整贴壁的细胞中显示出界限清晰的独立空斑区域（空斑）。任何孔中均未见操作不当、细胞毒性或污染的迹象（图2）。应避免染料染色伪影（如 图2

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

新抗增殖试验方案的标准化是推进未来药物研发科学探索的基础步骤。本文所介绍的方案为 体外 评估生物活性分子对速殖子的作用 T. gondii 鉴于 T.gondii 是一种专性胞内寄生虫，通过滑行运动进行移动。当寄生虫从裂解的细胞中逸出后，会侵入邻近先前受感染细胞的细胞。因此，随着寄生虫的增殖，会导致界限清晰的破坏区域（图2），其大小与逸出的寄生虫数量和侵入的细胞数量成正比，从而可实现对 T. gondii 增殖

空斑实验能够以不同的浓度测试多种分子，其所需的实验室结构与显微定量分析相似，但通量更高21,30。尽管空斑实验需要7天才能获得结果，但在该期间内研究人员或学生无需进行任何操作。结果分析非常简便，仅需完成细胞固定、染色和图像采集（若无专用成像系统，可使用高分辨率平板扫描仪）。图像分析仅需数小时即可完成，且可在配备免费软件的普通计...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明不存在利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者还感谢国家研究与发展委员会（CNPq）、米纳斯吉拉斯州研究资助基金会（FAPEMIG）以及 CAPES/PROEX 提供的经费支持。作者谨向米纳斯吉拉斯联邦大学研究副校长办公室致谢，感谢其对本研究的支持。ESMD（CNPq 308082/2023-0）和 RWAV（CNPq 305574/2021-3）为 CNPq 生产力研究员。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.05 % 胰蛋白酶-EDTALife Technologies25300-062
10 mL 血清移液管OlenK17-110
15 mL 离心管离心机Fanem型号：206
5 mL 血清移液管OlenK17-115
6 孔培养板Sarstedt833920
分析天平Mettler Toledo 型号：AB204 序列号：1116473813
抗生素-抗真菌素（100X）Life Technologies15240-062
自动移液器KasviK1-AID
离心机Eppendorf型号 5415 R 序列号：0023591
CO2 培养箱PHC Corporation型号：MCO-230AICUVL-PA 序列号：210360090
25 cm² 培养瓶Sarstedt833910
二甲基亚砜（DMSO）P.A.Merck 1,02,95,21,000
乙醇 P.AMerck1,00,98,31,000
胎牛血清（FBS）Life Technologies12657-029
甲醛 37-38%Panreac131328
GraphPad Prism GraphPad Software-版本 8.0.1
ImageJ  软件 --版本 1.52e
成像记录系统Bio-Rad型号：  ChemiDoc MP 成像系统 序列号：734BR2249
层流罩Veco do Brasil型号：VLFS-09
L-谷氨酰胺 200 mM（100X）Life Technologies25030-081
0.5 mL 微量离心管Sarstedt72,699
新生儿正常人真皮成纤维细胞（NHDF）LonzaCC-3132由巴西Fiocruz Paraná的Sheila Nardelli博士慷慨提供
Neubauer计数板 0.100 mm 0.0025 mm²New Optics7301-1
pH计Micronal型号：B374 序列号：30/37
移液器 20-200 µLKasvi basic22032893
移液器 2-20 µLLabmate Pro656630226
移液器  0.2-2 µLLabmate Pro556610114
移液器  1000-5.000 µLUniscienceYM4A021482
移液器  100-1000 µLEppendorf Research plusQ34354C
磷酸二氢钾 （KH2PO4）P.A Synth01F2002.01.AF
RPMI-1640 培养基Sigma-Aldrich R0883
氯化钠（NaCl）P.A. Cromoline Química Fina -
磷酸氢二钠（Na2HPO4）P.A.CRQ Produtos Quimicos EireliR2715920500
1.000 µL 吸头Sarstedt7,01,186
10 µL 吸头Sarstedt7,03,010
5.000 µL 吸头Sarstedt70,11,83,001
200 µL 吸头 Sarstedt7,03,030
移液管 （3.5 mL） Sarstedt86,11,71,001
15 mL 管Sarstedt6,25,54,502
结晶紫Merck101408
涡旋混合器Phoenix型号：AP56 序列号：6633
水浴锅Hemoquimica do Brasil型号：HM1003 序列号：700001556

参考文献

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