方法文章

小鼠肌肉和末端施旺细胞线粒体形态的 原位 定量方法

DOI：

10.3791/69732

⸱

2026年4月10日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Kinesiology and Sport Management, College of Education and Human Development, Texas A&M University, College Station, 2National Institutes of Health

本文内容

摘要

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在 体内 对施旺细胞线粒体末端进行局部注射，用于共聚焦显微镜。该方法利用健康或病变小鼠骨骼肌组织中展示的概念验证，提供高分辨率线粒体可视化。

摘要

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线粒体网络形态被广泛用作细胞健康的指标;然而，在完整组织中量化线粒体结构仍然具有技术挑战。末端施旺细胞（tSCs）对于神经肌肉连接处的维护和再生至关重要，但由于其解剖结构位置和对组织破坏的敏感性，原位分析尤其困难。该方案描述了一种可重复的方法，用于在整支架骨骼肌和小鼠tSC中，使用标准共聚焦显微镜标记和量化三维线粒体网络形态。该方法采用膜电位敏感线粒体染料的 体内 递送，随后进行快速组织处理和高分辨率共焦成像。图像堆栈被分析以量化线粒体网络的连通性、面积和碎片化。该方案最初在营养不良和健康骨骼肌中验证，以确认线粒体形态的预期差异，随后被改编用于可视化和量化使用S100β报告小鼠识别的tSCs线粒体网络。该方法使得在完整神经肌肉组织内分析线粒体形态，无需转基因线粒体报告器或专业成像平台。该方案仅需大学核心设施常见的设备，并可适配至其他薄组织或表面可及组织。

引言

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线粒体是极具可塑性的细胞器，作为细胞的肺部，在细胞呼吸过程中消耗氧气以支持三磷酸腺苷（ATP）的产生，以应对代谢需求1。虽然曾被认为是独立的细胞器，但现在人们认识到线粒体高度整合，2,3,4，根据局部需求共享能量底物。整合相较于隔离具有明显优势：连接的线粒体支持能量缺口，在代谢需求升高时维持电化学梯度以实现氧化磷酸化。事实上，线粒体的分布、体积和形态都符合其附近的能量需求5.在健康方面，线粒体网络的规律更新通过线粒体生物发生、融合和裂变事件以及线粒吞噬2,3来维持。线粒体生物发生是维持和扩展健康线粒体所必需的。代谢需求，如体育锻炼，会增加过氧化物酶体增殖体激活受体γ共激活因子1α（PGC-1α）的表达5。这一过程通过初级耐力信号发生，特别是运动诱导的AMP激活蛋白激酶（AMPK）、钙和活性氧6,7

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方案

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六个月龄（n=3）成年雄性DBA/2J[野生型（WT）] [RRID： IMSR_JAX：000671）和D2.B10-DMDD2.mdx/J [D2.mdx （mdx）] （RRID： IMSR_JAX：013141），而三至五个月大的成年雄性和雌性B6;D2-Tg（S100-EGFP）1Wjt/J （S100B）（RRID： IMSR_JAX：005621） [因与DBA无差异，也与WT合并]来自一个持续由研究者维持的小鼠群体。TA和GM注射、组织处理及影像的整体实验流程总结见 图1。额外的D2。MDX 小鼠为MDX进行tSC成像（n=1）。所有动物操作均由德克萨斯农工大学机构动物护理与使用委员会批准（AUP 2022-0215），并按照国家研究委员会《实验动物护理与使用指南》（第8版）进行。安乐死是在麻醉下施行的异氟醚麻醉下宫颈脱位。

1. 制备2微米的荧光线粒体染色工作溶液

  1. 按照制造商说明，将线粒体染色液（50微克）悬浮在322微升的二甲基亚砜（DMSO）中，制备200微米的液料。
  2. 制备3....

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结果

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线粒体网络显示出预期的连接性减少
图2展示了两组功能性肌肉共聚焦扫描的代表性三维荧光图像，分别为WT组和mdx组。与WT组相比，mdx小鼠的线粒体连通性明显低于WT组（见图2A–D）。在mdx小鼠中观察到较多小粒线体碎片[<100微米2]（WT，17.3±3.5%;mdx，36.3±4.9%;P = 0.015）以及与WT小鼠相比，大型互联线粒体网络数量[1000微米²]减少（WT，23.5±0.26%;mdx，16.8±1.02%;P = 0.001）（图3A，B）。

tSC原位成像 .......

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讨论

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线粒体在细胞结构中的位置及其形态与线粒体健康和代谢需求相关21。鉴于线粒体健康的临床相关性，以及不同细胞类型的呼吸动力学和形态差异，在先评估骨骼肌中线粒体形态的简单共聚焦显微镜方法后，开发出一种易于应用的共聚焦显微镜方法，提供线粒体健康状况的相关信息，适用于难以在 体内 维持的组织类型结构与隔离。在这方面，在 体内 控制加载荧光线粒体染料可以标记骨骼肌和tSC中的线粒体，从而实现健康和疾病基本形态指标的量化。

骨骼肌占身体质量的40%，对呼吸、肌碱分泌和运动至关重要 3,10。由于其高体重、易于分离以及多样的生理效应，线粒体形态自20世纪60年代起就在骨骼肌中被研究。骨骼肌中的线粒体形态与健康和疾病密切相关

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披露

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作者们没有利益冲突。

致谢

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作者感谢Mariappan Muthuchamy博士、Mendell Rimer博士和Peter Nghiem博士慷慨提供用于评估tSC线粒体的D2.mdx小鼠。这项工作得到了悉尼和J.L. Huffines运动医学与人类表现研究所学生研究资助以及德克萨斯农工大学教育与人类发展学院的资助。A.B.M.还得到了NIH LRP（NIAMS，编号2L40AR077899-02A3）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3-in-1全动物系统Aurora Scientific，加拿大安大略省1300A带分析软件的肌肉功能系统
AIVIA 美国莱卡显微系统公司，华盛顿州贝尔维尤15AI驱动的图像分析软件
抗层黏蛋白 美国Sigma公司L9393-.2mL肌纤维边界标记
B6; D2-Tg(S100-EGFP)1Wjt/J小鼠品系美国缅因州巴哈尔实验室JAX:005621S100β
Cryostar NX50冷冻切片机美国Epredia公司，密歇根州卡拉马祖市https://www.epredia.com/products/histology-instruments/cryotomy/cryostar-nx50冷冻切片机
D2.B10-DMDD2.mdx/J小鼠品系美国缅因州巴哈尔实验室JAX:13141D2.mdx
DBA/2J小鼠品系美国缅因州巴哈尔实验室JAX:00671WT
二甲基亚砜（DMSO）美国Fisher Scientific公司；新泽西州汉普顿市BP231-100线粒体染色重组试剂
Hoechst 33342美国Thermo Fisher Scientific公司H1399细胞渗透核酸染料
ImageJ/Fiji 美国马里兰州贝塞斯达市国立卫生研究院SCR_0022852D分析软件
Invitrogen ProLong Gold抗褪色试剂与DAPI 美国Fisher Scientific公司，新泽西州汉普顿市P36941安装介质
KimWipe美国德州欧文市的Kimberly-Clark公司06-666A实验室擦拭布
Leica LAS_X软件 德国莱卡生物系统公司，韦茨拉尔SCR_013673共聚焦软件
MitoView Fix 640美国Biotium公司70075-50ug远红色荧光线粒体染料
NIS-Elements Advanced Research软件 美国纽约州梅尔维尔市的尼康公司SCR_014329横截面积分析软件
Permount安装介质 美国Fisher Scientific公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆市#SP15-100通用安装介质
Prism 9软件 美国加利福尼亚州拉霍亚市的GraphPad软件公司RRID: SCR_002798统计分析软件
罗丹明（TRITC）美国Fisher Scientific公司；新泽西州汉普顿市AP132RMI二级抗体
Stellaris 5白光共聚焦显微镜及相应的反卷积软件德国莱卡显微系统公司，韦茨拉尔158301313:158201310:158004752:
158301312:158301314:158401100:
158209011:158301130:158204510:
158301120:158401140:158204511:
15500332:15506428:15506517:155
13859:15521522:15525226:155252
32:15525314:15555009:15555017:
15555046:27100022:155933660:
155933666:155933668:158000640
:158002407:158003150:158004141
:158004201:158004421:158004423
:158200681:158202140:158203114:
158203200:158203220:158204201:
158204510:158204709:158301200:
9I_LL_STELLARIS_C:9T-CLSM-APP
_CLASSC:9WE_LAS_405:9WE_
LAS_WLL:9WE_LL_STELLARIS_C		共聚焦显微镜
SZ61美国宾夕法尼亚州布雷尼格斯维尔市的奥林巴斯公司sz61立体显微镜
Tissue-Plus O.C.T. Compound 美国Scigen公司；新泽西州汉普顿市的Fisher Scientific公司23-730-571最佳切割温度化合物
Visikol I美国密苏里州圣路易斯市的Sigma-Aldrich公司H1-30组织清除溶液1
Visikol II美国密苏里州圣路易斯市的Sigma-Aldrich公司H2-30组织清除溶液2
α-蛇毒蛋白552德国科隆市的Biotrend公司00014乙酰胆碱受体染料

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Memme, J. M., Slavin, M., Moradi, N., Hood, D. A. Mitochondrial bioenergetics and turnover during chronic muscle disuse. Int J Mol Sci. 22 (10), 5179(2021).
  2. Iqbal, S., Hood, D. A. The role of mitochondrial fusion and fission in skeletal muscle function and dy....

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Mitochondrial MorphologyIn Situ QuantificationSkeletal MuscleTerminal Schwann CellsConfocal MicroscopyMitochondrial NetworkMembrane Potential DyeMitochondrial FragmentationNeuromuscular JunctionS100 Reporter Mice

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