小鼠肌肉和末端施旺细胞线粒体形态的 原位 定量方法

摘要

在 体内 对施旺细胞线粒体末端进行局部注射，用于共聚焦显微镜。该方法利用健康或病变小鼠骨骼肌组织中展示的概念验证，提供高分辨率线粒体可视化。

摘要

线粒体网络形态被广泛用作细胞健康的指标;然而，在完整组织中量化线粒体结构仍然具有技术挑战。末端施旺细胞（tSCs）对于神经肌肉连接处的维护和再生至关重要，但由于其解剖结构位置和对组织破坏的敏感性，原位分析尤其困难。该方案描述了一种可重复的方法，用于在整支架骨骼肌和小鼠tSC中，使用标准共聚焦显微镜标记和量化三维线粒体网络形态。该方法采用膜电位敏感线粒体染料的 体内 递送，随后进行快速组织处理和高分辨率共焦成像。图像堆栈被分析以量化线粒体网络的连通性、面积和碎片化。该方案最初在营养不良和健康骨骼肌中验证，以确认线粒体形态的预期差异，随后被改编用于可视化和量化使用S100β报告小鼠识别的tSCs线粒体网络。该方法使得在完整神经肌肉组织内分析线粒体形态，无需转基因线粒体报告器或专业成像平台。该方案仅需大学核心设施常见的设备，并可适配至其他薄组织或表面可及组织。

引言

线粒体是极具可塑性的细胞器，作为细胞的肺部，在细胞呼吸过程中消耗氧气以支持三磷酸腺苷（ATP）的产生，以应对代谢需求¹。虽然曾被认为是独立的细胞器，但现在人们认识到线粒体^{高度整合，2,3,4}，根据局部需求共享能量底物。整合相较于隔离具有明显优势：连接的线粒体支持能量缺口，在代谢需求升高时维持电化学梯度以实现氧化磷酸化。事实上，线粒体的分布、体积和形态都符合其附近的能量需求⁵.在健康方面，线粒体网络的规律更新通过线粒体生物发生、融合和裂变事件以及线粒吞噬^2,3来维持。线粒体生物发生是维持和扩展健康线粒体所必需的。代谢需求，如体育锻炼，会增加过氧化物酶体增殖体激活受体γ共激活因子1α（PGC-1α^）的表达5。这一过程通过初级耐力信号发生，特别是运动诱导的AMP激活蛋白激酶（AMPK）、钙和活性氧^6,7的升高。融合扩展网络，促进生存能力并补缺损，裂变通过优先排除功能失^{调区域2、3、8}来减轻线粒体进一步损伤。切除后，排除区域必须进行线粒吞噬，以防止功能失调的细胞器和蛋白质积累 ^6,9。

骨骼肌约占体重的40%，依赖线粒体进行有氧代谢和细胞信号传导以维持体内^平衡。总体而言，在骨骼肌功能障碍的条件下，线粒体的质量控制机制会受到损害¹⁰。肌肉功能障碍的研究通常测量线粒体呼吸、体积、形态和活性氧（ROS）产生，以评估线^{粒体质量3,10}。在这方面，在长期肌肉功能障碍期间，线粒体呼吸减少，ROS增加，网络^{碎片化3,10}。线粒体形态的扰动主要源于线粒体裂变蛋白——动力蛋白1（DRP1）和线粒体裂变1（FIS1）^2,8,11的激活。针对肌肉萎缩，位于线粒体外膜表面的FIS1招募DRP1与多个DRP1二聚体寡聚，形成线粒体周围的丝状体，逐渐缩小，直到某一线粒体切片被“夹断”，从而促进碎片化 ^3,11。线粒体裂变的过度活跃、新形成的线粒体融合减少以及线粒体吞噬功能失调共同导致了功能失调的线粒体网络碎片化，如不活跃或病^变肌肉中描述的^2,12。

神经肌肉连接处（NMJ）是肌肉兴奋的部位。体细胞中启动的动作电位沿轴突传播，轴突被髓鞘化的施旺细胞（SCs）包裹，终止于NMJ，NMJs被末端施旺细胞（tSC）包裹。NMJ在受伤后可以再生。然而，随着损伤部位与NMJ距离的增加，再生的可能性和速度会降低^13,14。在神经切断、压碎或拉伸造成损伤后，脊髓鞘会脱分化为脱髓鞘的前体样状态^15,16。脱髓鞘细胞增殖并与巨噬细胞协同作用，通过清理损伤部位与近端轴突残端之间的碎屑，重塑局部环境以利再生，过程发生Wallerian退化过程^17,18。迁移的SCs传递炎症反应信号，重塑环境以促进神经再生成功¹⁸。神经再生发生在由前体状SC形成的神经鞘内，这些SC形成邦格带，轴突通过这些带再生¹⁹。轴突残端随后伸出丝足，启动再神经化¹⁴。神经再支配后，突触前可以完全再生，前提是tSCs在NMJ²⁰处重新投资。

线粒体形态在不同细胞类型间差异显著，符合组织功能²¹。肝脏组织的报告表明，线粒体更为紧凑且呈球形，而大脑白质中的线粒体则更为细长^且管状。在挑战时，如衰老和氧化应激条件下，这些组织中的线粒体表现出类似甜甜圈的表型。然而，在成骨细胞中，线粒体甜甜圈的形成和破碎与线粒体及线粒体来源囊泡分泌增加，以及成骨细胞成熟相关²³。尽管骨骼肌线粒体网络已被广泛研究，但从周围神经系统的tSCs成像线粒体网络方面仍存在局限性。这些组织在其原生环境中难以捕捉，因为细胞超微结构在分离后发生显著变化， 且在体内 用染料靶向这些组织时难以同时承受伴随骨骼肌的负荷。

用于捕捉活体系统中线粒体形态的成像技术可分为光显微镜和电子显微镜^5。通过传统的光捕获显微镜，染料可以标记活细胞，固定细胞可以免疫标记，线粒体可以遗传标记^5,24。活细胞成像通常需要在荧光分析前培养细胞20–60分钟。染料通过膜电位导向线粒体，因此在^膜电位改变条件下可能被改变。理论上通过染料加载捕捉tSCs的线粒体形态是可能的;但这需要对整个组织进行成像和详细的标记技术。特别是，它能在完整结构内捕捉线粒体，且不受骨骼肌标记干扰。为克服这些限制，线粒体荧光染色被用于标记健康和营养不良小鼠的活体骨骼肌，随后对tSC线粒体进行体内和原位成像的标记。胫骨前肌（TA）因其浅层解剖位置、明确的注射体积和肌筋膜扩散^25、26、27，以及适合同时进行功能测量，被选为优化骨骼肌成像。臀大肌（GM）基于其已建立的注射程序^28,29、其薄型结构（最小化背景荧光）以及神经肌肉连接处位于GM与臀中肌之间腹侧浅位置，从而优先标记tSCs，从而在骨骼肌纤维之前进行优先标记，从而被选中进行tSC成像。

方案

六个月龄（n=3）成年雄性DBA/2J[野生型（WT）] [RRID： IMSR_JAX：000671）和D2.B10-DMD^D2.mdx/J [D2.mdx （mdx）] （RRID： IMSR_JAX：013141），而三至五个月大的成年雄性和雌性B6;D2-Tg（S100-EGFP）^1Wjt/J （S100B）（RRID： IMSR_JAX：005621） [因与DBA无差异，也与WT合并]来自一个持续由研究者维持的小鼠群体。TA和GM注射、组织处理及影像的整体实验流程总结见 图1。额外的D2。MDX 小鼠为MDX进行tSC成像（n=1）。所有动物操作均由德克萨斯农工大学机构动物护理与使用委员会批准（AUP 2022-0215），并按照国家研究委员会《实验动物护理与使用指南》（第8^版）进行。安乐死是在麻醉下施行的异氟醚麻醉下宫颈脱位。

1. 制备2微米的荧光线粒体染色工作溶液

1. 按照制造商说明，将线粒体染色液（50微克）悬浮在322微升的二甲基亚砜（DMSO）中，制备200微米的液料。
2. 制备30毫升2微米工作液时，将300微升200微米液液转移到29.7毫升无菌生理盐水中。充分搅拌。
3. 将250微升2微米工作液放入微离心管，储存在-80°C下直到使用。
   注：在-80°C下储存3年后，未观察到可检测到的信号衰减。

2. 染料与动物制备

1. 实验前15分钟解冻一个冷冻的分块。将溶液吸入一个30克、1毫升的胰岛素注射器中。
2. 用异氟醚麻醉动物。涂抹眼软膏，剃净注射部位，并使用带有温度探头的加热灯维持体温，探头置于动物与热源之间。
3. 用70%异丙醇清洁剃净的注射部位。

3. 胫骨前肌（TA）线粒体染料的施用与功能

1. TA染料施用
   1. 将50微升2微米粒体染色剂注入麻醉白日和D2.mdx小鼠的右侧TA肌。
   2. 将针头插入远端肌腱，靠近膝盖，按下活塞，同时沿注射路径抽出针头。
   3. 在体内培养染料1小时后进行解剖。
2. TA肌肉功能测量
   1. 染料培养45分钟后，使用异氟醚麻醉小鼠（诱导2%–3%，氧气维持1.5%–2%）。
   2. 手术中暴露左侧的TA肌，同时保留周围组织。将远端肌腱绑在肌肉测试系统的载重梁上。
   3. 用实验室湿巾包裹暴露的肌肉，并以3毫升微分¹ 冲洗，使用0.9%无菌生理盐水加热至40°C。 使用热灯将肌肉温度保持在32°C。
   4. 将铂/铱金属线电极横跨肌肉腹部，进行直接刺激。
   5. 将载荷束连接到微米上，利用1 Hz的抽搐收缩（T_w）调整最佳长度（L₀）。用数字卡尺记录L₀。
   6. 诱导最大破伤直线收缩（P₀）三次，频率为140赫兹，宫缩间隔60秒休息。记录最高力值（g）。使用肌肉功能系统和分析软件获取数据。
3. TA组织处理
   1. 孵育后，分离并剥离TA肌肉，然后进行安乐死。
   2. 将分离的肌纤维束放入4%对甲醛室温下15分钟，同时在立体显微镜下轻轻梳理纤维。
      注意：对甲醛有毒，应在化学排气罩内处理，同时佩戴适当的个人防护装备（实验服、手套和护目镜）。
   3. 将细胞渗透核酸染色剂加入最终浓度为5–10 μg/mL，以标记细胞核。
   4. 将样品用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗三次，每次5分钟，以去除多余染料。
   5. 依次用50%、75%和100%乙醇脱水样品，每次5分钟。
   6. 将样本依次在组织清除液I和II中培养，分别30分钟，室温下保持足够体积以完全浸没组织。
   7. 将清理好的TA束放在盖片上，并用玻璃块（2.5厘米×2厘米×1厘米;质量7.8^克）轻轻压平。

4. TA肌肉样本成像

1. 用共焦显微镜成像肌肉样本，以获得高分辨率的三维（3D）光学切片。
2. 使用63倍放大镜（N.A. 1.40）在约100微米深度获取肌肉的Z叠层图像。
3. 使用成像系统的共聚焦软件，激发波长为646 nm，以提供最清晰的背景和最清晰的画面。
4. 使用反卷积模式获取图像，采用“系统优化”参数，步长为1微米。
   注意：为防止脱水和光漂白，将组织转移到组织清除液II中，并放在盖片上。影像检查前，将两滴透明液2直接滴在组织上。

5。 GM肌肉tSC染色加注与成像

1. 使用S100β小鼠进行tSCs的特异性荧光鉴定。
2. 在GM肌肉上方做一个小皮肤切口。在闭合伤口前，将75微升2微米远红荧光线粒体染色剂注入GM^下方。
3. 闭合伤口，让造影剂孵育45分钟，以选择性标记tSCs，同时不显著标记下方肌纤维。
4. 解剖GM肌肉，立即放入冷藏的0.9%无菌生理盐水中。快速修剪多余脂肪和结缔组织。
5. 将解剖后的GM转到一张封面单上进行影像检查。
6. 仅在使用D2.mdx小鼠时，将荧光乙酰胆碱受体（AChR）染料以1：500稀释加入微解剖浴。将组织潜伏30分钟，以观察神经肌肉接头（NMJ）的突触后成分。
7. 利用这种双重标记方法区分突触后线粒体与tSC特异性线粒体。
   注意：将基因解剖和清洁时间限制在放置于影像覆盖套前不超过10分钟，以减少解剖后形态变化。这一时间限制对于减少解剖后形态变化和线粒体降解至关重要。
8. 进行共軛焦显微镜以获得高分辨率的三维（3D）光学切片。
9. 使用20倍放大镜（N.A. 0.75）在约16微米深度下获取tSCs的Z叠栈图像。使用63倍放大的物镜拍摄单个tSC的高分辨率代表性图像。
10. 实施装裱手术，以减少成像过程中的组织脱水和光漂白。
    注意：将盐水组织转移到盖片上，确保腹侧朝下以便倒置显微镜检查。
11. 在GM背面涂抹2微升通用安装介质。
12. 用校准过的玻璃块（2.5厘米×2厘米×1厘米;质量7.8克）轻柔地将组织压平，以确保成像平面均匀。

6. 聚焦离子束显微镜

1. 按照先前制定的规范进行聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）²⁶。
   1. 应用FIB-SEM以确认和可视化共聚焦成像中识别出的新形态特征。

7. 图像分析

1. TA肌肉样本
   1. 使用AI驱动的图像分析软件，对TA扫描中共聚焦光学切片（约1微米厚度）进行定量分析（约75–112微米）。
      注意：在自动分割前，进行多次监督训练以增强算法适应性。
   2. 导入单一光学切片（Z切片），以教软件保留代表白色线粒体染料的像素化信息，同时排除黑色背景。
   3. 开发供调查员审查的图像掩码，以确保高质量的分析和准确性。
   4. 在算法优化后，将三维图像堆栈分离为单个光学部分。
   5. 每从每张三维图像中选取每五个Z切片进行分析，每个数据点代表每个样本中这些单独切片的平均值。
   6. 量化线粒体形态以推导空间分布和网络连接度指标。
   7. 在所有样品中标准化强度阈值、边缘检测设置和体素尺寸校准，以最大限度减少实验变异性。
2. 转基因样本上的tSC
   1. 将1微米的光学截面组装成Z堆栈（约6–25微米厚），并使用二维图像分析软件将图像分离为单独的色彩通道。
   2. 使用比例条校准软件并应用阈值化，以最小的背景干扰优化tSC线粒体可视化。
   3. 进行二元化并去除背景噪声，以分离tSC线粒体或tSCs，用于测量面积和颗粒数。
   4. 保存二进制图像以确保处理一致，并在相同条件下进行所有成像实验，以确保生物复制间的可重复性。

8. 免疫组织化学

1. 将左侧TA肌肉样本嵌入最佳切割温度（OCT）化合物中，以评估横截面积（CSA）。
   1. 使用设定为-17°C的低温恒温器切片，厚度为10微米，采集到显微镜载玻片上。
   2. 利用兔子抗层磁蛋白一级抗体（1：400）和山羊抗兔罗达明二抗抗体（1：400）染色层联动蛋白肌肉横截面，以识别肌纤维边界。
   3. 在成像前使用合适的安装介质安装载玻片。
2. 利用共聚焦显微镜随机选择2–3个感兴趣区域（580 x 580微米），物镜为20倍（N.A. 0.75）。
3. 每个肌肉区域的平均值，并分析每个TA肌肉切片约400根肌纤维。
4. 使用半自动肌肉分段软件，通过遮蔽肌纤维来确定CSA（μm^²）。

9. 统计分析

1. 报告摘要数据为均值±均值标准误（S.E.M.）。
2. 使用专用统计软件进行统计分析，利用参数化、未配对的学生t检验来确定组间均值差异的显著性。
3. 对TA肌肉的CSA和肌肉力进行简单线性回归，利用这些作为DMD病理的标志，比较TA肌和GM tSCs的线粒体形态。
4. 评估皮尔逊 r 相关系数，以确定DMD病理与线粒体病理之间的相关性。统计显著性定义为 P ≤ 0.05。

结果

线粒体网络显示出预期的连接性减少
图2展示了两组功能性肌肉共聚焦扫描的代表性三维荧光图像，分别为WT组和mdx组。与WT组相比，mdx小鼠的线粒体连通性明显低于WT组（见图2A–D）。在mdx小鼠中观察到较多小粒线体碎片[<100微米²]（WT，17.3±3.5%;mdx，36.3±4.9%;P = 0.015）以及与WT小鼠相比，大型互联线粒体网络数量[1000微米^²]减少（WT，23.5±0.26%;mdx，16.8±1.02%;P = 0.001）（图3A，B）。

tSC原位成像 ...

讨论

线粒体在细胞结构中的位置及其形态与线粒体健康和代谢需求相关²¹。鉴于线粒体健康的临床相关性，以及不同细胞类型的呼吸动力学和形态差异，在先评估骨骼肌中线粒体形态的简单共聚焦显微镜方法后，开发出一种易于应用的共聚焦显微镜方法，提供线粒体健康状况的相关信息，适用于难以在 体内 维持的组织类型结构与隔离。在这方面，在 体内 控制加载荧光线粒体染料可以标记骨骼肌和tSC中的线粒体，从而实现健康和疾病基本形态指标的量化。

骨骼肌占身体质量的40%，对呼吸、肌碱分泌和运动至关重要 ^3,10。由于其高体重、易于分离以及多样的生理效应，线粒体形态自20世纪60^年代起就在骨骼肌中被研究。骨骼肌中的线粒体形态与健康和疾病密切相关

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3-in-1全动物系统	Aurora Scientific，加拿大安大略省	1300A	带分析软件的肌肉功能系统
AIVIA	美国莱卡显微系统公司，华盛顿州贝尔维尤	15	AI驱动的图像分析软件
抗层黏蛋白	美国Sigma公司	L9393-.2mL	肌纤维边界标记
B6; D2-Tg(S100-EGFP)1Wjt/J小鼠品系	美国缅因州巴哈尔实验室	JAX:005621	S100β
Cryostar NX50冷冻切片机	美国Epredia公司，密歇根州卡拉马祖市	https://www.epredia.com/products/histology-instruments/cryotomy/cryostar-nx50	冷冻切片机
D2.B10-DMDD2.mdx/J小鼠品系	美国缅因州巴哈尔实验室	JAX:13141	D2.mdx
DBA/2J小鼠品系	美国缅因州巴哈尔实验室	JAX:00671	WT
二甲基亚砜（DMSO）	美国Fisher Scientific公司；新泽西州汉普顿市	BP231-100	线粒体染色重组试剂
Hoechst 33342	美国Thermo Fisher Scientific公司	H1399	细胞渗透核酸染料
ImageJ/Fiji	美国马里兰州贝塞斯达市国立卫生研究院	SCR_002285	2D分析软件
Invitrogen ProLong Gold抗褪色试剂与DAPI	美国Fisher Scientific公司，新泽西州汉普顿市	P36941	安装介质
KimWipe	美国德州欧文市的Kimberly-Clark公司	06-666A	实验室擦拭布
Leica LAS_X软件	德国莱卡生物系统公司，韦茨拉尔	SCR_013673	共聚焦软件
MitoView Fix 640	美国Biotium公司	70075-50ug	远红色荧光线粒体染料
NIS-Elements Advanced Research软件	美国纽约州梅尔维尔市的尼康公司	SCR_014329	横截面积分析软件
Permount安装介质	美国Fisher Scientific公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆市	#SP15-100	通用安装介质
Prism 9软件	美国加利福尼亚州拉霍亚市的GraphPad软件公司	RRID: SCR_002798	统计分析软件
罗丹明（TRITC）	美国Fisher Scientific公司；新泽西州汉普顿市	AP132RMI	二级抗体
Stellaris 5白光共聚焦显微镜及相应的反卷积软件	德国莱卡显微系统公司，韦茨拉尔	158301313:158201310:158004752: 158301312:158301314:158401100: 158209011:158301130:158204510: 158301120:158401140:158204511: 15500332:15506428:15506517:155 13859:15521522:15525226:155252 32:15525314:15555009:15555017: 15555046:27100022:155933660: 155933666:155933668:158000640 :158002407:158003150:158004141 :158004201:158004421:158004423 :158200681:158202140:158203114: 158203200:158203220:158204201: 158204510:158204709:158301200: 9I_LL_STELLARIS_C:9T-CLSM-APP _CLASSC:9WE_LAS_405:9WE_ LAS_WLL:9WE_LL_STELLARIS_C	共聚焦显微镜
SZ61	美国宾夕法尼亚州布雷尼格斯维尔市的奥林巴斯公司	sz61	立体显微镜
Tissue-Plus O.C.T. Compound	美国Scigen公司；新泽西州汉普顿市的Fisher Scientific公司	23-730-571	最佳切割温度化合物
Visikol I	美国密苏里州圣路易斯市的Sigma-Aldrich公司	H1-30	组织清除溶液1
Visikol II	美国密苏里州圣路易斯市的Sigma-Aldrich公司	H2-30	组织清除溶液2
α-蛇毒蛋白552	德国科隆市的Biotrend公司	00014	乙酰胆碱受体染料