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方法文章

方法 原位 小鼠肌肉和终末施万细胞中线粒体形态的定量分析

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DOI：

10.3791/69732

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2026年4月10日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Kinesiology and Sport Management, College of Education and Human Development, Texas A&M University, College Station, 2National Institutes of Health

本文内容

摘要

局部注射线粒体染料可标记终末施万细胞的线粒体 体内 用于共聚焦显微镜观察。该方法利用来自健康或患病小鼠骨骼肌组织的概念验证，实现线粒体的高分辨率可视化。

摘要

线粒体网络形态被广泛用作细胞健康状况的指标；然而，在完整组织中对线粒体结构进行定量分析在技术上仍具挑战性。终末施万细胞（tSCs）对神经肌肉接头的维持与再生至关重要，但由于其解剖位置特殊且对组织损伤敏感，原位分析尤为困难。本实验方案介绍了一种可重复的方法，利用常规共聚焦显微镜对小鼠全层骨骼肌及tSCs中的三维线粒体网络形态进行标记与定量分析。该方法采用 体内 膜电位敏感性线粒体染料的递送，随后进行快速组织处理和高分辨率共聚焦成像。通过分析图像堆栈，定量线粒体网络的连接性、面积及碎片化程度。该方案首先在肌营养不良和健康骨骼肌中进行验证，以确认线粒体形态的预期差异，随后调整用于在S100β报告基因小鼠鉴定的tSCs中可视化和定量线粒体网络。该方法能够在无需转基因线粒体报告基因或特殊成像平台的情况下，对完整神经肌肉组织中的线粒体形态进行分析。该方案仅需大学核心设施中常见的设备，且可适用于其他薄层或表浅可及的组织。

引言

线粒体是具有高度可塑性的细胞器，其功能类似于细胞的“肺”，在细胞呼吸过程中消耗氧气，以响应代谢需求来支持三磷酸腺苷（ATP）的生成1虽然线粒体曾被认为是独立的细胞器，但现在已认识到它们具有高度的整合性2,3,4，根据局部需求在其网络中共享能量底物。融合相比孤立具有明显优势：相互连接的线粒体可弥补能量不足，在代谢需求升高时维持氧化磷酸化所需的电化学梯度。事实上，线粒体的分布、体积和形态均与其所在区域的能量需求相适应5在健康状态下，线粒体网络通过线粒体生物发生、融合与分裂事件以及线粒体自噬维持规律的更新。2,3线粒体生物发生对于维持和扩增健康的线粒体至关重要。代谢需求（如体力运动）可上调过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（PGC-1α）的表达。5该过程发生 通过 主要耐力信号，特别是运动诱导的AMP激活蛋白激酶（AMPK）、钙离子和活性氧物种的升高6,7融合可扩展网络，促进细胞存活并弥补功能缺陷，而分裂则通过优先排除功能失调区域来减轻线粒体的进一步损伤2,3,8一旦被移除，这些被排除的区域必须经历线粒体自噬，以防止功能失调的细胞器和蛋白质的累积6,9.

骨骼肌约占体重的40%，依赖线粒体进行有氧代谢和细胞信号传导以维持稳态10。总体而言，在骨骼肌功能障碍状态下，线粒体质量控制机制会受到损害10。对肌肉功能障碍的研究通常通过测量线粒体呼吸、体积、形态以及活性氧（ROS）的产生来评估线粒体质量3,10。在这方面，长期肌肉功能障碍期间，线粒体呼吸能力下降，ROS水平升高，且线粒体网络呈现碎片化状态3,10。线粒体形态的改变主要源于线粒体分裂蛋白——动力相关蛋白1（DRP1）和线粒体分裂蛋白1（FIS1）的激活2,8,11。在肌肉萎缩过程中，位于线粒体外膜表面的FIS1会招募DRP1，使其与多个DRP1二聚体寡聚化，在线粒体周围形成丝状结构，使线粒体逐渐缩小，直至某一部分被“掐断”，从而促进线粒体分裂3,11。综上所述，线粒体分裂过度活跃、新生线粒体融合减少以及线粒体自噬功能障碍共同导致了功能失调线粒体网络的碎片化表型，这种现象常见于失活或病变的肌肉组织中2,12。

神经肌肉接头（NMJ）是肌肉兴奋的发生部位。神经元胞体产生的动作电位沿轴突传导，轴突由髓鞘化施万细胞（SCs）包绕，最终终止于由终末施万细胞（tSC）包裹的神经肌肉接头。在损伤后，神经肌肉接头具有再生能力。然而，随着损伤部位与神经肌肉接头之间距离的增加，其再生的可能性和速度均会下降13,14。在神经因横断、压迫或牵拉而受损后，施万细胞会去分化为一种去髓鞘化的、类似前体细胞的状态15,16。去髓鞘化的施万细胞开始增殖，并与巨噬细胞协同作用，通过瓦勒变性清除损伤部位与近端轴突断端之间的细胞碎片，从而重塑局部微环境以促进再生17,18。迁移中的施万细胞还会启动炎症反应，进一步重塑环境以支持神经成功再生18。神经再生发生在由类似前体细胞的施万细胞所形成的神经鞘内，这些细胞排列成布恩格尔带（bands of Büngner），为轴突重新生长提供通路19。随后，轴突断端伸出丝状伪足，启动再支配过程14。在完成再支配后，只要终末施万细胞重新定植于神经肌肉接头处，突触前成分即可实现完全再生20。

线粒体形态在不同细胞类型间存在显著差异，与组织功能相适应21肝脏组织的报告表明，线粒体更为致密且呈球形，而脑白质中的线粒体则更长，呈管状。22在受到挑战时，例如在衰老和氧化应激条件下，这些组织中的线粒体会表现出环状（doughnut-like）表型。然而，在成骨细胞中，线粒体环状结构的形成与碎片化与线粒体及线粒体来源囊泡的分泌增加以及成骨细胞成熟相关联。23尽管已对多种物种的骨骼肌线粒体网络进行了广泛研究，但在成像周围神经系统卫星细胞（tSCs）中的线粒体网络方面仍存在局限性。这些局限性带来了困难 以在其原生环境中进行捕获，因为细胞超微结构在分离后会发生显著改变，且这些组织难以用染料靶向标记 体内 而不同时加载相应的骨骼肌。

用于捕捉活体系统中线粒体形态的成像技术可分为光学显微镜和电子显微镜两类5采用传统的光学显微成像技术，可对活细胞进行染料标记，对固定细胞进行免疫标记，并对线粒体进行遗传标记5,24活细胞成像通常需要在进行荧光分析前将细胞孵育20–60分钟。染料被靶向至线粒体 通过 膜电位，因此在膜电位改变的条件下可能会发生变化5捕获骨骼肌中tSCs的线粒体形态 通过 染料负载在理论上是可行的；然而，这需要对整个组织进行成像以及精细的标记技术。特别是，该方法能够捕获完整结构内的线粒体，且不受骨骼肌标记的干扰。为了克服这些局限性，采用线粒体荧光染料对健康小鼠和肌营养不良小鼠的活体骨骼肌进行标记，随后对tSC线粒体进行标记 体内 和 原位 成像。选择胫骨前肌（TA）以优化骨骼肌成像，因其解剖位置表浅，且其注射体积与肌筋膜扩散特性已有充分表征。25,26,27，以及适用于同步功能测量的特性。根据已确立的注射操作流程，选择臀大肌（GM）作为tSC成像的部位28,29其纤薄的结构可最大限度降低背景荧光，且股后肌与臀中肌之间的神经肌肉接头位于较浅的腹侧位置，可在骨骼肌纤维之前优先标记tSCs。

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方案

使用来自研究者自行维护的正在进行的品系中6月龄（n=3）成年雄性DBA/2J [野生型（WT）]（RRID: IMSR_JAX:000671）和D2.B10-DMDD2.mdx/J [D2.mdx (mdx)]（RRID: IMSR_JAX:013141），以及3至5月龄（n=8）成年雄性和雌性B6; D2-Tg(S100-EGFP)1Wjt/J（S100B）（RRID: IMSR_JAX:005621）[由于与DBA无差异，亦与WT合并使用]。TA和GM注射、组织处理及成像的整体实验流程见图1。另有一只D2.mdx小鼠由研究者提供，用于mdx小鼠的tSC成像（n=1）。所有动物实验均经德克萨斯农工大学（Texas A&M University）机构动物护理与使用委员会批准（AUP 2022-0215），并依照美国国家研究委员会《实验动物护理与使用指南》（第8版）30进行。安乐死采用异氟烷过量麻醉后颈椎脱位法实施。

1. 制备2 µM的荧光线粒体染料工作液

  1. 根据制造商说明，将线粒体染料（50 µg）溶于 322 µL 二甲基亚砜（DMSO）中，配制 200 µM 的储备液。
  2. 为配制 30 mL 的 2 µM 工作液，取 300 µL 的 200 µM 储备液加入 29.7 mL 无菌生理盐水中，充分混匀。
  3. 将 2 µM 工作液以 250 µL 分装至微量离心管中，于 -80 °C 保存直至使用。
    注意：在 -80 °C 保存 3 年后未观察到可检测的信号降解。

2. 染料与动物准备

  1. 实验前15分钟解冻一份冷冻样品。用30 G、1 cc胰岛素注射器吸取溶液。
  2. 使用异氟烷麻醉动物。涂抹眼膏，剃除注射部位毛发，并使用加热灯维持体温，将温度探头置于动物与热源之间。
  3. 用70%异丙醇清洁剃毛后的注射部位。

3. 胫骨前肌（TA）线粒体染料给药及功能检测

  1. TA染料给药
    1. 在麻醉状态下，向麻醉的野生型（WT）和 D2.mdx 小鼠的左侧或右侧胫骨前肌（TA 肌）注射 50 µL 的 2 µM 线粒体染料。
    2. 从远端肌腱向膝盖方向插入针头，在沿注射路径回撤针头的同时推动针栓。
    3. 孵育染料 体内 解剖前1小时
  2. TA肌肉功能测量
    1. 染料孵育45分钟后，使用异氟烷（2%–3%诱导，1.5%–2%维持，以氧气为载体）对小鼠进行麻醉。
    2. 手术暴露左侧胫骨前肌，同时保留周围组织。将远端肌腱结扎并连接至肌肉测试系统的负荷梁上。
    3. 用实验室擦拭纸包裹暴露的肌肉，并以 3 mL min⁻¹ 的速度进行灌注1 用预热至 40 °C 的 0.9% 无菌生理盐水灌注。使用加热灯维持肌肉温度在 32 °C。
    4. 将铂/铱合金丝电极置于肌腹上以进行直接刺激。
    5. 将载荷梁连接至千分尺，并调节至最佳长度（L0) 使用抽搐收缩（Tw) 在 1 Hz 条件下记录 L0 使用数字卡尺。
    6. 诱导最大强直收缩（P0以140 Hz频率刺激3次，每次收缩之间间隔60秒。记录最大张力值（g）。使用肌肉功能系统及其分析软件采集数据。
  3. TA 组织处理
    1. 孵育后，在处死前分离并解剖趾长伸肌（TA 肌）。
    2. 将分离的肌纤维束置于室温下4%多聚甲醛中固定15分钟，同时在体视显微镜下轻轻分离纤维。
      警告：多聚甲醛具有毒性，操作时应佩戴适当的个人防护装备（实验服、手套和护目用具），并在化学通风橱中进行。
    3. 加入细胞膜通透性核酸染料，终浓度为 5–10 µg/mL，以标记细胞核。
    4. 用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤样本三次，每次5分钟，以去除多余的染料。
    5. 依次用50%、75%和100%乙醇对样品进行脱水处理，每次5分钟。
    6. 将样本依次在组织透明溶液I和溶液II中孵育，每步30分钟，室温下进行，使用足量溶液以完全浸没组织。
    7. 将清理后的TA肌束放置在盖玻片上，并使用玻璃块（2.5 cm × 2 cm × 1 cm；质量7.8 g）轻轻压平26.

4. TA 肌肉样本的成像

  1. 使用共聚焦显微镜对肌肉样本进行成像，以获得高分辨率的三维（3D）光学切片。
  2. 使用63倍物镜（数值孔径1.40），对肌肉组织在约100 µm深度处采集Z轴堆栈图像。
  3. 使用成像系统的共聚焦软件，设置激发波长为646 nm，以获得最清晰的图像并减少背景信号。
  4. 采用去卷积模式采集图像，使用“系统优化”参数，Z轴步长为1 µm。
    注意：为防止脱水和荧光淬灭，将组织转移至组织透明溶液II中，并置于盖玻片上。成像前，在组织上直接滴加两滴透明溶液2。

5. GM 肌肉 tSC 染料负载与成像

  1. 使用 S100β 小鼠进行 tSCs 的特异性荧光鉴定。
  2. 在麻醉状态下，在 GM 肌肉上方进行小切口皮肤切开术。在缝合伤口前，向 GM 肌肉下方注射 75 μL 的 2 μM 远红荧光线粒体染料25。
  3. 缝合伤口，并让染料孵育 45 分钟，以选择性地标记 tSCs，同时避免对 underlying 肌纤维产生显著标记。
  4. 解剖 GM 肌肉并立即置于冰冷的 0.9% 无菌生理盐水中。迅速去除多余的脂肪和结缔组织。
  5. 将解剖后的 GM 肌肉转移至盖玻片上用于成像。
  6. 仅在使用 D2.mdx 小鼠时，向显微解剖浴液中加入荧光乙酰胆碱受体（AChR）染料，稀释比例为 1:500。孵育组织 30 分钟，以可视化神经肌肉接头（NMJ）的突触后成分。
  7. 采用此双标记方法区分突触后线粒体与 tSC 特异性线粒体。
    注意：在将 GM 肌肉转移至盖玻片进行成像前，解剖和清洁操作时间不得超过 10 分钟，以最大限度减少解剖后形态学变化。此时间限制对于最小化解剖后的形态改变和线粒体降解至关重要。
  8. 进行共聚焦显微镜成像，获取高分辨率的三维（3D）光学切片。
  9. 使用 20 倍物镜（数值孔径 N.A. 0.75）对 tSCs 进行约 16 µm 深度的 Z 轴扫描成像。使用 63 倍物镜获取单个 tSCs 的高分辨率代表性图像。
  10. 实施封片操作，以尽量减少成像过程中组织脱水和光漂白。
    注意：将组织在生理盐水中转移至盖玻片，确保腹侧朝下，以适用于倒置显微镜观察。
  11. 在 GM 肌肉的背侧表面滴加 2 µL 通用封片介质。
  12. 使用校准的玻璃块（2.5 cm × 2 cm × 1 cm；质量 7.8 g）轻轻压平组织，以确保成像平面均匀。

6. 聚焦离子束显微镜

  1. 根据先前建立的方案进行聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）分析26。
    1. 应用FIB-SEM特别用于确认和可视化共聚焦成像过程中发现的新形态学特征。

7. 图像分析

  1. TA 肌肉样本
    1. 使用人工智能驱动的图像分析软件，对 TA 扫描的共聚焦光学切片（1 μm）进行定量分析（扫描厚度约为 75–112 μm）。
      ​注意：在自动分割之前，需进行多次有监督的训练，以增强算法的适应性。
    2. 导入单个光学切片（Z 切片），教导软件保留代表白色线粒体染料的像素化信息，同时排除黑色背景。
    3. 生成供研究者审查的图像掩膜，以确保分析质量和准确性。
    4. 在算法优化后，将 3D 图像堆栈拆分为单个光学切片。
    5. 从每个 3D 图像中选择每第五个 Z 切片进行分析，每个数据点代表每份样本中这些独立切片的平均值。
    6. 量化线粒体形态，以获得空间分布和网络连接性指标。
    7. 在所有样本中统一强度阈值、边缘检测设置和体素尺寸校准，以最小化实验变异性。
  2. GM 样本上的 tSCs
    1. 将 1 μm 的光学切片组装成 Z 堆栈（厚度约为 6–25 μm），并使用 2D 图像分析软件将图像分离为独立的颜色通道。
    2. 使用比例尺校准软件，并应用阈值设定以优化 tSC 线粒体的可视化效果，同时尽量减少背景干扰。
    3. 进行二值化处理并去除背景噪声，以分离 tSC 线粒体或 tSCs，用于面积和颗粒计数的测量。
    4. 保存二值化图像以确保处理的一致性，并在相同条件下进行所有成像实验，以保证生物学重复样本间的可重复性。

8. 免疫组织化学

  1. 使用最佳切割温度（OCT）包埋剂包埋左侧TA肌肉样本，以评估横截面积（CSA）。
    1. 将样本在-17°C的恒冷切片机中以10 μm厚度切片，并将切片收集至显微镜载玻片上。
    2. 使用兔抗层粘连蛋白一抗（1:400）和山羊抗兔Rhodamine二抗（1:400）对肌肉横切面进行染色，以识别肌纤维边界。
    3. 成像前使用适当的封片介质封片。
  2. 使用共聚焦显微镜对载玻片进行成像，每份样本随机选择2–3个感兴趣区域（580 x 580 µm），采用20倍物镜（数值孔径0.75）。
  3. 对每块肌肉各区域的数值取平均值，并分析每份TA肌肉切片中约400个肌纤维。
  4. 使用半自动肌肉分割软件，通过标记肌纤维来确定横截面积（CSA，单位为µm2）。

9. 统计学分析

  1. 以均值 ± 均值标准误（S.E.M.）报告汇总数据。
  2. 使用专业的统计软件进行统计分析，采用参数性、非配对的 Student t 检验来确定组间均值差异的显著性。
  3. 对胫前肌（TA 肌）的横截面积（CSA）和肌肉力量进行简单线性回归分析，并利用这些指标作为杜氏肌营养不良症（DMD）病理的标志，以比较 TA 肌肉和 GM tSCs 中的线粒体形态。
  4. 评估 Pearson r 相关系数，以确定 DMD 病理与线粒体病理之间的相关性。统计学显著性定义为 P ≤ 0.05。

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结果

线粒体网络表现出预期的连接性降低
展示两组TA肌肉共聚焦扫描的代表性三维荧光图像，分别为WT组和mdx组（图2）。与WT组相比，mdx小鼠的线粒体连接性较WT组降低（图2A–D). 在 mdx 小鼠中观察到更多的小型线粒体碎片 [<100 µm2]（野生型，17.3 ± 3.5%；mdx，36.3 ± 4.9%； P = 0.015）以及大型相互连接的线粒体网络数量减少 [1000 µm2] 与野生型小鼠相比（野生型：23.5 ± 0.26%；mdx：16.8 ± 1.02%； P = 0.001) (图 3A，B).

tSC 原位成像 ...

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讨论

线粒体在细胞结构中的位置及其形态与线粒体健康状况和代谢需求相关21鉴于线粒体健康状况的临床相关性，以及不同类型细胞在线粒体呼吸动力学和形态上的差异，本研究首先在骨骼肌中评估了一种基于共聚焦显微镜的线粒体形态分析方法，随后将其拓展应用于tSCs中。该方法可对难以维持活性的组织类型中线粒体的形态特征进行简便检测，从而反映其健康状况。 体内 分离后结构。在这方面，可控加载荧光线粒体染料 体内 在骨骼肌和tSCs中对线粒体进行标记，从而能够在健康与疾病状态下定量分析基本的形态学指标。

骨骼肌占体重的40%，对呼吸、肌因子分泌和运动至关重要3,10。由于骨骼肌在体内的质量较高、易于分离，并具有多种生理效应，自20世纪60年代以来，研究人员已开始在骨骼肌中研究线粒体形态21。骨骼肌中的线粒体形态与健康和疾病状态密切相关

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致谢

作者感谢 Mariappan Muthuchamy 博士、Mendell Rimer 博士和 Peter Nghiem 博士慷慨提供用于评估 tSC 线粒体的 D2.mdx 小鼠。本研究得到了悉尼和 J.L. Huffines 体育医学与人类表现研究所学生研究基金以及德克萨斯农工大学教育与人类发展学院资金的支持。&M 大学。A.B.M. 还获得了美国国立卫生研究院贷款偿还计划（NIH LRP，NIAMS，2L40AR077899-02A3）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3合1整体动物系统Aurora Scientific，安大略省，加拿大1300A肌肉功能系统配分析软件
AIVIA Leica Microsystems，贝尔维尤，华盛顿州，美国15AI 驱动的图像分析软件
抗层粘连蛋白 MilliporeSigmaL9393-.2mL肌纤维边界标记
B6；D2-Tg(S100-EGFP)1Wjt/J 小鼠品系杰克逊实验室，巴港，缅因州JAX:005621S100β
Cryostar NX50 冷冻切片机Epredia，密歇根州卡拉马祖，美国https://www.epredia.com/products/histology-instruments/cryotomy/cryostar-nx50冷冻切片机
D2.B10-DMDD2.mdx/J 小鼠品系杰克逊实验室，巴港，缅因州JAX:13141D2.mdx
DBA/2J 小鼠品系杰克逊实验室，巴港，缅因州JAX:00671野生型
二甲基亚砜（DMSO）Fisher Scientific；Hampton，NJ，USABP231-100线粒体染料重悬试剂
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH1399细胞通透性核酸染料
ImageJ/Fiji 美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州，美国SCR_002285二维分析软件
Invitrogen ProLong Gold 抗荧光淬灭剂（含 DAPI） Fisher Scientific，新泽西州汉普顿，美国P36941封片剂
KimWipeKimberly-Clark，美国德克萨斯州欧文市06-666A实验室擦拭纸
Leica LAS_X 软件 Leica Biosystems，德国韦茨拉尔SCR_013673共聚焦软件
MitoView Fix 640Biotium70075-50ug远红荧光线粒体染料
NIS-Elements Advanced Research 软件 Nikon，美国纽约州梅尔维尔SCR_014329横截面积分析软件
Permount封片剂 Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆，邮编02454#SP15-100常规封片介质
Prism 9 软件 GraphPad Software, La Jolla, CA, USARRID: SCR_002798统计分析软件
罗丹明（TRITC）Fisher Scientific；Hampton，NJ，USAAP132RMI二抗
Stellaris 5 白光共聚焦显微镜及相应去卷积软件徕卡显微系统，德国韦茨拉尔158301313:158201310:158004752:
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158203200:158203220:158204201:
158204510:158204709:158301200:
9I_LL_STELLARIS_C:9T-CLSM-APP
_CLASSC:9WE_LAS_405:9WE_
LAS_WLL:9WE_LL_STELLARIS_C		共聚焦显微镜
SZ61Olympus，美国宾夕法尼亚州布赖尼格斯维尔sz61体视显微镜
Tissue-Plus O.C.T. 化合物 Scigen，Fischer Scientific，Hampton，NJ，USA23-730-571最佳切割温度化合物
Visikol ISigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯H1-30组织透明溶液1
Visikol IISigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯H2-30组织透明溶液2
α-bungarotoxin 552Biotrend，Koln，德国00014乙酰胆碱受体染料

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骨骼肌共聚焦显微镜线粒体网络膜电位染料线粒体断裂神经肌肉接头S100β 报告基因小鼠
方法 原位 小鼠肌肉和终末施万细胞中线粒体形态的定量分析
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